專利名稱：特異性識(shí)別τ的抗體的用途,及包含該抗體的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及CNS損傷領(lǐng)域。本發(fā)明涉及通過τ的檢測和/或量化，實(shí)現(xiàn)CNS損傷的早期診斷的新方法。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(CNS損傷)是由各種誘因?qū)е碌模渲杏胁煌募膊∵^程、物理或化學(xué)因素、缺氧和缺血。疾病過程包括占位性損害、不同惡性腫瘤導(dǎo)致的腦侵襲或轉(zhuǎn)移和/或多種病原體感染。
CNS腫瘤可能是局部原發(fā)的(原發(fā)性腫瘤)，或者可能是播散到CNS的(轉(zhuǎn)移瘤)。原發(fā)性腫瘤是由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、室管膜細(xì)胞(室管膜瘤)或支持組織(腦脊膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、脈絡(luò)叢乳頭狀瘤)產(chǎn)生的。在兒童期，腫瘤是由更多的原始細(xì)胞(成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、脊索瘤)引起的。惡性星形細(xì)胞瘤或成膠質(zhì)細(xì)胞瘤是20歲以上成人原發(fā)性腫瘤的最常見類型。良性和惡性原發(fā)性CNS腫瘤都能產(chǎn)生神經(jīng)病學(xué)損害。
白血病是兒童最常見的癌癥。在過去的二十年間，在常規(guī)單獨(dú)應(yīng)用強(qiáng)化化學(xué)療法或聯(lián)合治療(放射療法和化學(xué)療法)的基礎(chǔ)上，白血病兒童的存活率已有顯著增加。最近據(jù)估計(jì)，10年總存活率約為75％。隨著白血病兒童存活人數(shù)不斷增加，關(guān)于可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致?lián)p傷的抗癌化學(xué)療法和/或放射療法的長期效果已經(jīng)引起關(guān)注，對(duì)該CNS損傷的早期量化測定的需要也在不斷增加。
細(xì)菌性腦膜炎可以被定義為響應(yīng)于軟膜珠網(wǎng)膜的細(xì)菌感染和軟膜蛛網(wǎng)膜包裹的腦脊液以及腦室內(nèi)腦脊液的炎癥。細(xì)菌性腦膜炎的發(fā)生率每年每100000人為4.6～10例。嗜血流感桿菌是最常見的原因，其次是萘瑟氏腦膜炎球菌和肺炎鏈球菌。一旦發(fā)展為細(xì)菌性腦膜炎，其特異性特征包括顱內(nèi)壓升高、血腦屏障瓦解、腦水腫和腦血流改變。腦膜炎持續(xù)時(shí)間越長，治療的有效性越低，則發(fā)生并發(fā)癥和神經(jīng)病學(xué)后遺癥的機(jī)會(huì)越大。大約10％的細(xì)菌性腦膜炎嬰兒和兒童將留下持續(xù)性一側(cè)或雙側(cè)感覺性聽力喪失的后遺癥。大約30％的細(xì)菌性腦膜炎兒童以后將證明患有輕微的學(xué)習(xí)能力缺陷(Wilson等，1991)。
病毒也能夠以各種方式影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致各不相同的病毒性腦膜炎、病毒性腦炎、脊髓炎和由慢性病毒感染引起的CNS疾病。其它可能導(dǎo)致CNS損傷的病況是諸如藥物、化學(xué)療法或接觸化合物等化學(xué)因素，以及物理因素。頭部外傷在工業(yè)化國家常見，影響到很多患者的基本生活。為了領(lǐng)會(huì)這個(gè)問題在醫(yī)學(xué)和社會(huì)上的重要性，僅需對(duì)下列事實(shí)有清楚的認(rèn)識(shí)每年幾乎有一千萬美國人的頭部受傷，其中約20％嚴(yán)重到足以導(dǎo)致腦損傷的程度。CNS損傷的另一種原因可以是缺氧或缺血。缺氧-缺血性腦病是常見的經(jīng)常引起嚴(yán)重后果的疾病，由腦缺乏氧供應(yīng)所致，后者是由低血壓或呼吸衰竭引起的。急性缺血性中風(fēng)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，是西方社會(huì)神經(jīng)病學(xué)殘障的主要原因。圍產(chǎn)期窒息可能也與CNS損傷有關(guān)。迄今，臨床、腦動(dòng)電流描記法和神經(jīng)系放射學(xué)的評(píng)價(jià)以及腦血流研究是最容易獲得的方法。不過，發(fā)生低氧-缺血后，腦損傷嚴(yán)重性的早期與準(zhǔn)確評(píng)價(jià)仍然是新生兒護(hù)理最困難的問題之一。
為了檢測白血病兒童的CNS侵襲，目前的診斷程序包括腰椎穿刺、眼底鏡和腦成像(Raichle，1998)。不過，這些診斷方法僅允許檢測更嚴(yán)重階段的CNS損傷，已經(jīng)存在并持續(xù)發(fā)展的早期CNS損傷可能被這些方法所遺漏。因此，需要能夠進(jìn)行CNS損傷早期檢測的其他診斷方法。
最近已經(jīng)可以獲得大量神經(jīng)病學(xué)上的標(biāo)記物，它們可以反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)細(xì)胞死亡、軸突生長/再誘導(dǎo)、炎癥和/或血腦屏障機(jī)能障礙的病況。與微管有關(guān)的τ蛋白以不同的亞型存在，其中在成人腦中發(fā)現(xiàn)了4～6種，但是在胎兒腦中僅發(fā)現(xiàn)了1種亞型。亞型的多樣性是由位于人17號(hào)染色體上單基因的交替性mRNA剪接所產(chǎn)生的(Himmler，1989；Goedert等，1989；Andreadis等，1992)。從分子克隆推斷，τ蛋白最突出的特征是31或32個(gè)氨基酸的伸長，這發(fā)生在分子的羧基末端部分，并且可以重復(fù)3或4次。其他的多樣性是通過29或58個(gè)氨基酸長度單位插入τ分子NH2末端部分所產(chǎn)生的(Goedert等，1989)。在體內(nèi)通過與位于τ重復(fù)區(qū)(255-381)的微管結(jié)合域的相互作用，τ促進(jìn)神經(jīng)元軸突腔隙內(nèi)的微管聚合和穩(wěn)定性(Lewis等，1988)。在正常環(huán)境中，成人的腦每摩爾τ含有2-3摩爾磷酸鹽(Selden和Pollard，1983；Ksiezak-Reding等，1992)。根據(jù)對(duì)大鼠和人所進(jìn)行的研究，在正常τ中不同部位的磷酸化作用取決于發(fā)育狀態(tài)(Lee等，1991；Bramblett等，1993；Goedert等，1993)。在顯示神經(jīng)原纖維纏結(jié)的腦區(qū)已經(jīng)檢測到由磷酸化作用所產(chǎn)生的60、64和68kDa的τ變異體(Delacourte等，1990；Goedert等，1992；Flament和Delacourte，1990；Greenberg和Davies，1990)。這些腦每摩爾τ含有6-8摩爾磷酸鹽(Ksiezak-Reding等，1992)。在從成對(duì)螺旋絲分離的τ中，磷酸化作用能夠發(fā)生在數(shù)個(gè)位置(Iqbal等，1989；Lee等，1991；Hasegawa等，1992)。腦提取物中正常和異常磷酸化τ的檢測是通過抗體進(jìn)行的(Mab Alz50Ghanbari等，1990；Mab Ab423Harrington等，1991；Mab AT120Vandermeeren等，1993；MabAT180；Mab AT270國際申請(qǐng)公報(bào)WO 95/17429和Mab AT8國際申請(qǐng)公報(bào)WO 93/08302)，或者是通過分子量的變化進(jìn)行的(Flament和Delacourte，1990)，或者是通過功能測定進(jìn)行的(Bramblett等，1992)。各自識(shí)別特異性τ表位的單克隆抗體的組合已經(jīng)用于檢測CSF中正常和異常磷酸化τ的存在(Van de Voorde等，1995)。作為標(biāo)記物，τ已經(jīng)用于區(qū)別伴有細(xì)胞骨架性質(zhì)改變的癡呆，例如阿爾茨海默病，與正常老化受驗(yàn)者或其它類型癡呆患者。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供個(gè)體CNS損傷的早期檢測和/或量化方法，所述CNS損傷是由CNS的占位性損害、CNS的病灶侵襲或轉(zhuǎn)移、病原體、缺氧或缺血、化學(xué)因素、物理因素、或這些機(jī)理聯(lián)合導(dǎo)致的。
本發(fā)明更為具體的目的是提供個(gè)體CNS損傷的早期檢測和/或量化方法，所述CNS損傷是由良性或惡性原發(fā)性腦腫瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、或硬膜下血腫所致。
本發(fā)明另一個(gè)更為具體的目的是提供個(gè)體CNS損傷的早期檢測和/或量化方法，所述CNS損傷是由白血病、淋巴瘤或乳腺癌的CNS侵襲導(dǎo)致的。
本發(fā)明另一個(gè)更為具體的目的是提供個(gè)體CNS損傷的早期檢測和/或量化方法，所述CNS損傷是由細(xì)菌或病毒所致腦炎或腦膜炎導(dǎo)致的。
本發(fā)明另一個(gè)更為具體的目的是提供個(gè)體CNS損傷的早期檢測和/或量化方法，所述CNS損傷是由中風(fēng)、腦梗塞、腦出血、血栓形成、圍產(chǎn)期窒息、賓斯旺格氏病或結(jié)節(jié)性脈管炎導(dǎo)致。
本發(fā)明另一個(gè)更為具體的目的是提供個(gè)體CNS損傷的早期檢測和/或量化方法，所述CNS損傷是由化學(xué)療法所導(dǎo)致的。
本發(fā)明另一個(gè)更為具體的目的是提供個(gè)體CNS損傷的早期檢測和/或量化方法，所述CNS損傷是由創(chuàng)傷、中風(fēng)、顱內(nèi)壓或輻射導(dǎo)致。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供個(gè)體CNS損傷的早期檢測和/或量化方法，所述CNS損傷是由CNS的占位性損害、CNS的病灶侵襲或轉(zhuǎn)移、病原體、缺氧或缺血、化學(xué)因素、物理因素、或這些機(jī)理聯(lián)合所致，目的是為了評(píng)價(jià)對(duì)所述CNS損傷的治療效果。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于個(gè)體CNS損傷的早期診斷的試劑盒，所述CNS損傷是由CNS的占位性損害、CNS侵襲、病原體、缺氧或缺血、化學(xué)因素、物理因素、或這些機(jī)理聯(lián)合所致。
本發(fā)明另一個(gè)更為具體的目的是提供用于個(gè)體CNS損傷的早期診斷的試劑盒，所述CNS損傷是由良性或惡性原發(fā)性腦腫瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、或硬膜下血腫所致。
本發(fā)明另一個(gè)更為具體的目的是提供用于個(gè)體CNS損傷的早期診斷的試劑盒，所述CNS損傷是由白血病、淋巴瘤或乳腺癌的CNS侵襲導(dǎo)致的。
本發(fā)明另一個(gè)更為具體的目的是提供用于個(gè)體CNS損傷的早期診斷的試劑盒，所述CNS損傷是由細(xì)菌或病毒所致腦炎或腦膜炎導(dǎo)致的。
本發(fā)明另一個(gè)更為具體的目的是提供用于個(gè)體CNS損傷的早期診斷的試劑盒，所述CNS損傷是由中風(fēng)、腦梗塞、腦出血、血栓形成、圍產(chǎn)期窒息、賓斯旺格氏病或結(jié)節(jié)性脈管炎導(dǎo)致的。
本發(fā)明另一個(gè)更為具體的目的是提供用于個(gè)體CNS損傷的早期診斷的試劑盒，所述CNS損傷是由化學(xué)療法所導(dǎo)致的。
本發(fā)明另一個(gè)更為具體的目的是提供用于個(gè)體CNS損傷的早期診斷的試劑盒，所述CNS損傷是由創(chuàng)傷、中風(fēng)、顱內(nèi)壓或輻射所致。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供篩選或監(jiān)測預(yù)防或治療CNS損傷的化合物效果的方法。
本發(fā)明的所有目的據(jù)信可通過下列實(shí)施方案得以滿足。
本發(fā)明涉及個(gè)體CNS損傷的早期檢測和/或量化方法，所述CNS損傷是由CNS的占位性損害、CNS侵襲、病原體、缺氧或缺血、化學(xué)因素、物理因素、或這些機(jī)理聯(lián)合所致。該方法包括檢測和/或量化個(gè)體τ水平并將其與健康對(duì)照個(gè)體τ水平進(jìn)行比較的步驟。
本發(fā)明涉及這樣的驚人發(fā)現(xiàn)，來自白血病兒童的CSF樣本τ水平高出健康個(gè)體值的上限。這些升高的τ水平是潛在中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵襲和已經(jīng)存在并持續(xù)發(fā)展的CNS損傷的指征，該CNS損傷在此后很長時(shí)間才能用目前的診斷方法檢測到。同樣，在患有CNS占位性損害、CNS病灶侵襲或轉(zhuǎn)移、缺血、中風(fēng)或腦膜炎的個(gè)體中，在早期階段就可觀察到τ水平升高。因此，τ可以作為非特異性標(biāo)記物，用于由白血病CNS侵襲導(dǎo)致的CNS損傷的早期檢測，一般來說作為非特異性標(biāo)記物，用于由CNS損傷劑導(dǎo)致的CNS損傷的早期檢測，例如CNS的占位性損害、CNS病灶侵襲或轉(zhuǎn)移、病原體、缺氧或缺血、化學(xué)因素、物理因素、或這些機(jī)理的組合。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)是神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，在脊椎動(dòng)物中，它包括腦和脊髓，感覺脈沖傳遞到CNS，又從中發(fā)出運(yùn)動(dòng)脈沖，CNS指導(dǎo)和協(xié)調(diào)整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)。
術(shù)語“CNS損傷”指任何與神經(jīng)元機(jī)能障礙有關(guān)的、由特殊的誘發(fā)劑或損傷劑導(dǎo)致的CNS病況。更具體地，CNS損傷指這樣的疾病過程，包括但不限于CNS的占位性損害、CNS病灶侵襲或轉(zhuǎn)移和/或病原體感染。占位性損害例如可以是良性或惡性原發(fā)性腦腫瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、來自寄生蟲，例如豬肉絳蟲或細(xì)粒棘球絳蟲的包囊、腦積水和/或硬膜下血腫。CNS病灶侵襲或轉(zhuǎn)移可以是由惡性腫瘤導(dǎo)致的，例如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤和/或胃腸惡性腫瘤或其它類型的癌癥?？梢愿腥綜NS并導(dǎo)致CNS損傷的病原體包括但不限于朊病毒、病毒、細(xì)菌或寄生蟲。感染CNS的細(xì)菌和病毒可以導(dǎo)致腦膜炎、腦炎、neuroaids或神經(jīng)包柔螺旋體病。它們包括但不限于腦膜炎奈瑟氏菌、嗜血流感桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜腦炎單純皰疹病毒和gluteolis單純皰疹病毒。CNS損傷也可以是在麻醉、圍產(chǎn)期窒息、淹溺、哮喘、中風(fēng)、腦梗塞、血栓形成、腦出血、一氧化碳中毒、賓斯旺格氏病和/或結(jié)節(jié)性脈管炎期間發(fā)生缺氧或缺血導(dǎo)致的。導(dǎo)致CNS損傷的化學(xué)因素包括但不限于基因療法、藥物、化學(xué)療法和接觸化合物。CNS損傷也可以是由物理因素導(dǎo)致的，例如創(chuàng)傷、輻射、體溫過低、體溫過高、顱內(nèi)壓或中風(fēng)。也有可能是一種以上上述致病因素引起CNS損傷。
因此，本發(fā)明提供通過測定τ水平早期檢測和/或量化所述CNS損傷的方法?！癈NS損傷的早期檢測和/或量化”指，在用目前方法可以檢測之前，可以應(yīng)用另一種方法測定CNS損傷。
本申請(qǐng)所指術(shù)語“τ”可以是任意形式的τ，包括任意狀態(tài)的磷酸化作用。定性或定量測定τ水平，作為CNS損傷程度的量度。τ可以在體外以及體內(nèi)進(jìn)行檢測。
個(gè)體CNS損傷的早期體外檢測方法包括以下步驟，從所述個(gè)體獲得樣本，檢測和/或量化所述樣本中的τ水平，將其與健康對(duì)照個(gè)體樣本中的τ水平比較。術(shù)語“樣本”指任意來源的生物材料，例如體液、毛發(fā)、上皮細(xì)胞、外周血或任意其它包含τ蛋白的樣本。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過患者體液樣本中的τ水平分析，可以體外檢測和/或量化τ。術(shù)語“體液”指所有存在于人體內(nèi)的液體，包括但不限于血液、淋巴、尿液和腦脊液(CSF)。在本發(fā)明更具體的實(shí)施方案中，采用患者的腦脊液樣本檢測和/或量化τ。在本發(fā)明另一種具體實(shí)施方案中，采用患者血液衍生物樣本檢測和/或量化τ。血液樣本可以包括取自患者的全血樣本。更優(yōu)選地，血液樣本包括血漿樣本或血清樣本。
τ可以通過任意已知方法加以檢測和/或量化，包括但不限于利用抗體、分子量改變(Flament和Delacourte，1990)，或者通過功能測定法(Bramblett等，1992)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，τ可以通過免疫測定法加以檢測，該測定法包括至少以下步驟-從患者處獲得樣本；和-在適合于產(chǎn)生抗原-抗體復(fù)合物的條件下，使所述樣本與識(shí)別τ的單克隆抗體(第一抗體或俘獲抗體)接觸；和-檢測所述抗體與所述樣本的免疫結(jié)合。
有利的是，用于本發(fā)明的單克隆抗體在適合的載體上處于固定狀態(tài)?；蛘?，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意其它免疫測定形式，也可以將該方法付諸實(shí)施。
然后，抗原的檢測方法可以這樣進(jìn)行，使由抗原和識(shí)別τ的第一抗體所形成的所述抗原-抗體復(fù)合物與下列物質(zhì)共同接觸
a)第二抗體(或檢測抗體)*它可以是識(shí)別τ-第一抗體復(fù)合物表位、但不識(shí)別單獨(dú)的第一抗體的單克隆抗體，或者*它可以是識(shí)別τ-第一抗體復(fù)合物表位、但不識(shí)別單獨(dú)的第一抗體的多克隆抗體，所述多克隆抗體優(yōu)選利用固定的τ或τ-第一抗體復(fù)合物通過免疫親和色譜法加以純化；b)用于特異性標(biāo)記所述第二抗體或者與之偶聯(lián)的標(biāo)記物，所述標(biāo)記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可能的標(biāo)記物；c)適當(dāng)?shù)木彌_溶液，用于進(jìn)行第一抗體與樣本之間、第二抗體與τ-第一抗體復(fù)合物之間和/或被結(jié)合的第二抗體與標(biāo)記物之間的免疫反應(yīng)；和d)與識(shí)別τ抗體具有反應(yīng)性的純化蛋白質(zhì)或合成肽，出于標(biāo)準(zhǔn)化目的也是可能的。
有利的是，第二抗體本身攜帶標(biāo)記物或者攜帶直接或間接與標(biāo)記物偶聯(lián)的基團(tuán)。
術(shù)語“表位”指抗原-抗體復(fù)合物中特異性地被抗體結(jié)合部位結(jié)合的部分。表位可以通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)加以檢測，或者可以通過本領(lǐng)域已知的各種計(jì)算機(jī)預(yù)測模型加以預(yù)測。
本發(fā)明中“識(shí)別”、“與......反應(yīng)”、“免疫結(jié)合”或“生成抗原-抗體復(fù)合物”的表述被解釋為在所有符合抗體和抗原的免疫性質(zhì)的條件下發(fā)生抗原與抗體之間的結(jié)合。
任何特異性地識(shí)別τ的單克隆或多克隆抗體都可用于τ的檢測。特異性地識(shí)別正常和/或異常磷酸化τ的抗體包括Alz50(Ghanbari等，1990)、Ab423(Harrington等，1991)、AT8(國際申請(qǐng)公報(bào)WO93/08302)、AT120(Vandermeeren等，1993)、AT180與AT270(國際申請(qǐng)公報(bào)WO 95/17429)和AT100(國際申請(qǐng)公報(bào)WO 96/04309)。不過也可以使用其它本領(lǐng)域已知的特異性識(shí)別τ的抗體。
個(gè)體CNS損傷的體外早期檢測和/或量化方法也可用于評(píng)價(jià)對(duì)所述個(gè)體CNS損傷的某些治療的效果?？赡苡绊慍NS狀態(tài)的可行的治療包括但不限于藥物治療、化學(xué)療法、物理療法，包括放射療法和基因療法。
個(gè)體CNS損傷的體外早期檢測和/或量化方法包括測定和/或量化所述個(gè)體τ水平并將其與健康對(duì)照個(gè)體τ水平進(jìn)行比較的步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，τ可以通過體內(nèi)成像加以體內(nèi)檢測。τ可以通過非侵入性方法原位顯現(xiàn)，包括但不限于Arbit等(1995)、Tamada等(1995)、Wakabayashi等(1995)、Huang等(1996)、Sandrock等(1996)、Mariani等(1997)描述的腦成像方法。這些體內(nèi)成像方法可以實(shí)現(xiàn)τ的定位化和形象化，例如利用經(jīng)過標(biāo)記的識(shí)別τ的抗體。
τ也可以作為體內(nèi)成像的非特異性標(biāo)記物，用于評(píng)價(jià)對(duì)個(gè)體CNS損傷的某些治療效果。可能影響CNS狀態(tài)的可行的治療包括但不限于藥物治療、化學(xué)療法、物理療法，包括放射療法和基因療法。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及τ作為非特異性標(biāo)記物用于診斷試劑盒的制造，該試劑盒用于個(gè)體CNS損傷的早期檢測，該CNS損傷是由CNS的占位性損害、CNS病灶侵襲或轉(zhuǎn)移、病原體、缺氧或缺血、化學(xué)因素、物理因素、或這些機(jī)理聯(lián)合所致。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及τ作為非特異性標(biāo)記物用于診斷試劑盒的制造，該試劑盒用于個(gè)體CNS損傷的早期檢測，該CNS損傷是由良性或惡性原發(fā)性腦腫瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、或硬膜下血腫導(dǎo)致的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及τ作為非特異性標(biāo)記物用于診斷試劑盒的制造，該試劑盒用于個(gè)體CNS損傷的早期檢測，該CNS損傷是由白血病、淋巴瘤或乳腺癌的CNS侵襲或轉(zhuǎn)移所致。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及τ作為非特異性標(biāo)記物用于診斷試劑盒的制造，該試劑盒用于個(gè)體CNS損傷的早期檢測，該CNS損傷是由細(xì)菌或病毒所致。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及τ作為非特異性標(biāo)記物用于診斷試劑盒的制造，該試劑盒用于個(gè)體CNS損傷的早期檢測，該CNS損傷是由中風(fēng)、腦梗塞、血栓形成、腦出血、圍產(chǎn)期窒息、賓斯旺格氏病或結(jié)節(jié)性脈管炎所導(dǎo)致的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及τ作為非特異性標(biāo)記物用于診斷試劑盒的制造，該試劑盒用于個(gè)體CNS損傷的早期檢測，該CNS損傷是由化學(xué)療法導(dǎo)致的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及τ作為非特異性標(biāo)記物用于診斷試劑盒的制造，該試劑盒用于個(gè)體CNS損傷的早期檢測，該CNS損傷是由創(chuàng)傷、中風(fēng)、顱內(nèi)壓或輻射所導(dǎo)致的。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于個(gè)體CNS損傷的體外或體內(nèi)診斷試劑盒，該CNS損傷是由CNS的占位性損害、CNS病灶侵襲或轉(zhuǎn)移、病原體、缺氧或缺血、化學(xué)因素、物理因素、或這些機(jī)理聯(lián)合所致。任何提供τ檢測工具的試劑盒都可用于上述CNS損傷的診斷。
優(yōu)選用于個(gè)體CNS損傷的體外診斷試劑盒是基于免疫測定法的，該CNS損傷是由CNS的占位性損害、CNS病灶侵襲或轉(zhuǎn)移、病原體、缺氧或缺血、化學(xué)因素、物理因素、或這些機(jī)理聯(lián)合所致，該試劑盒包含-至少一種單克隆抗體(第一抗體)，它與τ蛋白表位形成免疫復(fù)合物；-第二抗體；*它可以是識(shí)別τ-第一抗體復(fù)合物表位、但不識(shí)別單獨(dú)的第一抗體的單克隆抗體，或者*它可以是識(shí)別τ-第一抗體復(fù)合物表位、但不識(shí)別單獨(dú)的第一抗體的多克隆抗體，所述多克隆抗體優(yōu)選利用固定的τ蛋白或固定化的τ-第一抗體復(fù)合物通過免疫親和色譜法加以純化；-用于特異性標(biāo)記所述第二抗體或者與之偶聯(lián)的標(biāo)記物；-適當(dāng)?shù)木彌_溶液，用于進(jìn)行第一抗體與樣本之間、第二抗體與τ-第一抗體復(fù)合物之間和/或被結(jié)合的第二抗體與標(biāo)記物之間的免疫反應(yīng)；-含有一個(gè)或多個(gè)τ表位的純化蛋白質(zhì)或合成肽，出于標(biāo)準(zhǔn)化目的也是可能的。
本發(fā)明也涉及篩選或監(jiān)測預(yù)防或治療CNS損傷的化合物效果的方法，該方法包括測定τ水平并將其與對(duì)照樣本τ水平進(jìn)行比較的步驟。
現(xiàn)在將參照下列實(shí)施例闡述本發(fā)明，實(shí)施例陳述了特別有利的實(shí)施方案。不過應(yīng)當(dāng)注意，這些實(shí)施例是例舉性的，無論如何也不能解釋為限制本發(fā)明。
表1非B-細(xì)胞ALL/NHL患者的治療方案(EORTC 58881)

表1續(xù)

表2B-細(xì)胞NHL患者的治療方案(UKCCSG 9602)

表2續(xù)

IT＝膜內(nèi)；IV＝靜脈內(nèi)；PO＝經(jīng)口；LP＝腰椎穿刺；MTX＝甲氨蝶呤；Ara-C＝阿拉伯糖苷表3AML患者的治療方案(EORTC 58921)

IT＝膜內(nèi)；IV＝靜脈內(nèi)；PO＝經(jīng)口；SC＝皮下；LP＝腰椎穿刺；Ara-C＝阿拉伯糖苷；VP16＝
表4不同因素所致可能的CNS損傷患者CSF樣本的τ水平

表4續(xù)

表4續(xù)

a01Prof.P.Cras，University Hospital，Neurology，Antwerp，Belgium and Dr.A.Daniels，UIA，Laboratory of Neurobiology，Antwerp，Belgium；04Dr.P.D.Mehta，Institute Basic Research，Staten Island，NY，USA；05Dr.A.Ivanoiu，UCL St-Luc，Laboratory of Neurochemistry，Brussels，Belgium；06Prof.P.P.De Deyn，UIA，Laboratory of Neurochemistry，Antwerp，Belgium；08Dr.C.Bancher，Lainz Hospital，Neurology，Vienna，Austria；10Dr.J.Wiltfang，Georg-August University，Gerontopsychiatry，Gttingen，Germany.
bF女性；M男性c在多種因素引起損傷的情況下，給出唯一被假定是最相關(guān)的因素。


圖1在接受任何治療之前診斷時(shí)的τ水平1、對(duì)照兒童；2、急性髓細(xì)胞白血病(AML)；3、AML-CNS+；4、慢性髓細(xì)胞白血病(CML)；5、骨髓增生異常綜合征(MDS)；6、B細(xì)胞非何杰金淋巴瘤(B-NHL)；7、非B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)；8、非B-ALL CNS+；9、極高危險(xiǎn)(VHR)非B-ALL。
圖2七名患者急性缺血性中風(fēng)后的CSF-τ水平。CSF樣本的采集時(shí)間為入院時(shí)(第0-1天)、第2-3天、第7-8天、第21-22天(3周)和第90-110天(3個(gè)月)。
圖3用CT掃描測量到的梗塞面積與最大釋放時(shí)CSF-τ水平的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1白血病兒童τ水平升高為了評(píng)價(jià)化學(xué)療法對(duì)神經(jīng)元損傷的影響，進(jìn)行了如下縱深研究，該研究包括65名按照標(biāo)準(zhǔn)程序治療的白血病兒童(2至16歲)，沒有可測量的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。共分析377份CSF樣本。每次注射前，采集少量液體用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室分析，剩余物用于我們的研究。這些兒童是在比利時(shí)的Leuven大學(xué)醫(yī)院診斷為白血病并進(jìn)行治療的。應(yīng)用INNOTEST hTAU抗原(比利時(shí)Gent Innogenetics公司)評(píng)估腦脊液中的τ蛋白。
在治療開始前，對(duì)所有懷疑患有白血病的兒童進(jìn)行腰椎穿刺，以檢測可能存在的白血病細(xì)胞，這是中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤的指征。此時(shí)、也就是治療前測量的τ水平充當(dāng)對(duì)照水平，以比較化學(xué)療法誘發(fā)的τ水平改變。
我們觀察到，盡管在中樞神經(jīng)系統(tǒng)沒有檢測到白血病細(xì)胞，有些白血病兒童在診斷時(shí)已經(jīng)具有非常高的τ水平。這些兒童構(gòu)成新的腦侵襲或白血病誘發(fā)CNS損傷的危險(xiǎn)組，該損傷用目前的診斷方法(腦成像、腰椎穿刺、眼底鏡)通常不能被發(fā)現(xiàn)。一名證實(shí)細(xì)胞侵襲入腦的(腦脊液中有惡性細(xì)胞)白血病患者τ水平升高，進(jìn)一步支持了這一點(diǎn)。
實(shí)施例2白血病患者治療前τ水平升高1、研究對(duì)象1996年8月～1999年6月，從比利時(shí)Leuven的Catholic大學(xué)兒童血液腫瘤科接受癌癥治療的82名兒童中采集510份CSF樣本。CSF樣本僅在預(yù)定用于惡性腫瘤分期或治療的腰椎穿刺(LP)過程中進(jìn)行取樣。
研究了三組血液惡性腫瘤患者。最大一組由48名非B-ALL患者組成，按照EORTC方案58881進(jìn)行治療(表1)。這些兒童中，20名具有CD10(+)母細(xì)胞(或普通ALL)，其中2名患者還患有Down綜合征(DS)，1名患者患有Brachmann-de Lange綜合征；6名患者具有普通的B-母細(xì)胞，2名患者具有普通的T-母細(xì)胞，2名患者具有原B-母細(xì)胞，9名患者具有前B-母細(xì)胞，9名患者具有T-母細(xì)胞。42名兒童患有白血病，6名患者患有II期(1名)、III期(4名)或IV期(1名)非何杰金淋巴瘤。一名患者具有明顯的CNS浸潤(CNS+)，這是根據(jù)CSF中惡性細(xì)胞研究方案定義的。五名患者根據(jù)該方案定義的標(biāo)準(zhǔn)被認(rèn)為是高危(VHR)患者，(2名患者為t(9；22)，3名患者具有皮質(zhì)激素類耐藥性)。因?yàn)榈谝徊糠终T導(dǎo)治療類似于其它患者，因此按照誘導(dǎo)化學(xué)療法進(jìn)行分析。28名非B-ALL患者可以在治療期間縱深隨訪。
第二組患者包括10名B-細(xì)胞性非何杰金淋巴瘤患者，按照英國兒童癌癥小組(UKCCSG 9602)NHL方案進(jìn)行治療(表2)。5名患者患有B-細(xì)胞淋巴瘤，3名患者患有Burkitt淋巴瘤，2名患者患有退行性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)。所有患者都用相同的方案治療，但是一名B-細(xì)胞性白血病患者除外。對(duì)這些患者中的六名進(jìn)行縱深研究。
第三組患者包括9名急性髓性白血病-骨髓增殖異常綜合征(AML-MDS)兒童，其中2名患者有CNS浸潤，2名患者患有Down綜合征。有3名患者為M0表型，各有1名患者為M1、M2、M5a或M7表型。兩名患者患有MDS，其中一名已經(jīng)發(fā)展為AML，用化學(xué)療法治療。除了一名MDS患者以外，所有這些患者均按照EORTC 58921方案進(jìn)行治療(表3)，7名患者進(jìn)行縱深隨訪。
其他患者組成混雜兒童組(n＝9)，出于臨床原因進(jìn)行LP。該組包括3名成神經(jīng)管細(xì)胞瘤(分級(jí)中)兒童，2名橫紋肌肉瘤(分級(jí)中)兒童，朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥(LCH，分級(jí)中)、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤(分級(jí)中)、生殖細(xì)胞瘤(分級(jí)中)和伴有CNS轉(zhuǎn)移的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(分級(jí)中和隨訪)兒童各1名。對(duì)照組由4名兒童組成，采集他們的CSF，僅作為可能的病毒或細(xì)菌感染的常規(guī)控制手段之一，但具有陰性結(jié)果。1名局限性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(分級(jí)中)患者和1名家族性嗜紅細(xì)胞淋巴組織細(xì)胞增生癥(HLH)患者也包括在對(duì)照組內(nèi)?；颊叩慕H口頭同意參與研究。
2、方法液體取樣。治療藥物IT給藥前進(jìn)行腰椎穿刺。在不同的聚丙烯管內(nèi)收集5ml CSF。一份樣本立即在1500rpm下離心2分鐘，以除去細(xì)胞和其它不溶物。上清液貯存在-70℃，用于隨后的分析。冷凍/融化循環(huán)次數(shù)限制在最少。
CSF中τ的測量。所有CSF-τ檢測的生物化學(xué)分析都在不知道臨床診斷的情況下進(jìn)行?？赡墚a(chǎn)生混淆的因素例如冷凍/融化循環(huán)次數(shù)、受者類型和每次測定的樣本體積在整個(gè)研究方案中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。利用夾心ELISA(INNOTEST hTAU抗原，比利時(shí)Gent Innogenetics有限公司)測定CSF-τ水平，即測量總τ(正常的和過度磷酸化的τ)。首先在每次LP的時(shí)候單獨(dú)分析樣本。然后，在一塊免疫平皿上再次分析來自同一名患者的所有樣本。一組104份樣本的第一種和第二種方法之間的相關(guān)系數(shù)為0.901(95％可信區(qū)間0.856-0.933)。紙面上的CSF-τ升高排除在外，因?yàn)樗且后w中蛋白質(zhì)的一般增加。
3、結(jié)果首先對(duì)來自6名對(duì)照兒童的CSF樣本測定τ水平的正常上限。平均CSF-τ值為106.2pg/ml(95％可信區(qū)間＝34.3-178.0)。任意截取的正常值被認(rèn)為是312pg/ml(平均+3標(biāo)準(zhǔn)差)，在成人觀測值的范圍內(nèi)(Hulstaert等，1999)。而且，我們沒有發(fā)現(xiàn)診斷時(shí)的CSF-τ值與兒童年齡之間的相關(guān)性(Pearson r＝-0.161，可信區(qū)間95％＝-0.3914-0.08836，n＝64)，這說明年齡對(duì)CSF-τ水平?jīng)]有影響。顯然，可以認(rèn)為病理CSF-τ值在500pg/ml以上。
對(duì)每個(gè)亞組患者在診斷時(shí)的τ水平進(jìn)行分析(圖1)。是否伴隨Dow氏綜合征的患者τ水平之間沒有明顯差異(沒有顯示)。兩名具有明顯CNS浸潤(CNS+)的患者診斷時(shí)的CSF-τ水平在312pg/ml以上。不過，2名MDS兒童、7/28名非B-ALL兒童、符合高危標(biāo)準(zhǔn)的1/4非B-ALL患者、1/5名AML患者和2/8名B-細(xì)胞性NHL患者的τ水平在312pg/ml以上，而利用經(jīng)典的診斷方法沒有檢測到CNS侵襲。采集CSF用于分期的三名顱內(nèi)壓升高的(成神經(jīng)管細(xì)胞瘤)患者和一名生殖細(xì)胞瘤患者具有較高CSF-τ濃度(823，1397，1500和442pg/ml)，相形之下，一名I期星形細(xì)胞瘤患者具有正常的CSF-τ水平(97pg/ml)。一名LCH患者具有正常的CSF-τ水平，為112pg/ml。兩名橫紋肌肉瘤患者可以在診斷時(shí)進(jìn)行分析一名I期患者的CSF-τ水平為279pg/ml，另一名IV期患者為320pg/ml。一名視網(wǎng)膜細(xì)胞母瘤并有CNS浸潤的患者的CSF-τ水平為1800pg/ml。
33名非B-ALL患者在診斷時(shí)的CSF-τ水平與腫瘤負(fù)荷不相關(guān)，腫瘤負(fù)荷通過白細(xì)胞計(jì)數(shù)(Pearson r＝0.04575，可信區(qū)間95％-0.3024-0.3831)或血清LDH(Pearson r＝-0.03002，可信區(qū)間95％-0.3696-0.3166)反映。B-NHL患者中，LDH水平與CSF-τ之間沒有顯著的相關(guān)性(Pearson r＝-0.3723，可信區(qū)間95％-0.8532-0.4507)。
實(shí)施例3使用CSF-τ作為中風(fēng)導(dǎo)致的可能CNS損傷早期檢測的標(biāo)記物1、研究對(duì)象七名患者參加研究，3男4女，63-81歲(平均SD，70.7±7.2歲)，患有腦梗塞，收治于瑞典Gteborg Sahlgren大學(xué)醫(yī)院的神經(jīng)內(nèi)科病房。所有患者都在中風(fēng)開始后的72小時(shí)內(nèi)入選研究。
2、方法利用腰椎穿刺采集CSF樣本。收集12ml，每0.5ml冷凍在-80℃下，直至分析。采集CSF樣本的時(shí)間為入院時(shí)(第0-1天)、第2-3天、第7-8天、第21-22天(3周)和第90-110天(3個(gè)月)。用夾心ELISA法(INNOTEST hTAU抗原，比利時(shí)Gent Innogenetics有限公司)測定CSF-τ水平，測量總τ(正常的和過度磷酸化的τ)。
在入院的第一天利用腦計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)檢查腦損傷的程度。臨床上也利用修正的斯堪的納維亞中風(fēng)等級(jí)指數(shù)(SSI；斯堪的納維亞中風(fēng)研究小組，1985)在中風(fēng)開始時(shí)檢查患者，利用Bartel指數(shù)(BI；Mohoney和Barthel，1965)在3個(gè)月后檢查病廢的程度。
3、結(jié)果CSF-τ顯示在急性中風(fēng)后顯著升高，1-3周后達(dá)到峰值，3個(gè)月后恢復(fù)正常(圖2)。根據(jù)CT掃描的測量結(jié)果，CSF-τ水平與梗塞面積之間也存在相關(guān)性(圖3)。這些結(jié)果說明，CSF-τ反映神經(jīng)元損傷和變性，CSF中的水平取決于損傷的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。該項(xiàng)研究中，臨床數(shù)據(jù)(SSI或BI)與CSF-τ之間沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，這可能是患者數(shù)量少的緣故。
實(shí)施例4使用τ作為不同損傷因素導(dǎo)致的可能CNS損傷早期檢測的標(biāo)記物1、研究對(duì)象在8個(gè)歐洲和2個(gè)美國的有關(guān)CSF研究的大學(xué)中心進(jìn)行了一項(xiàng)多中心研究，該研究基于在這些中心為研究目的獲得的剩余CSF?；颊叩腃SF標(biāo)本包括大范圍不同神經(jīng)病學(xué)疾病，目的是獲得關(guān)于τ標(biāo)記物在各種涉及CNS的病理學(xué)中改變特異性的一般認(rèn)識(shí)(表4)。
研究按照當(dāng)?shù)嘏R床研究規(guī)程進(jìn)行。如果需要的話，研究人員在研究開始前需獲得另外的當(dāng)?shù)貍惱韺W(xué)委員會(huì)或?qū)W會(huì)評(píng)論部門的許可。
2、方法利用腰椎穿刺(LP)采集CSF樣本。本研究僅包括每μl含有低于500個(gè)紅細(xì)胞的CSF樣本。在LP后4小時(shí)內(nèi)，將CSF樣本在2000g下離心10分鐘，保持冷凍不融化。來自中心01的CSF樣本在分析前經(jīng)歷額外的冷凍-融化循環(huán)。利用夾心ELISA技術(shù)(INNOTEST hTAU-抗原，Innogenetics N.V.)在各中心測量總τ濃度，包括正常的τ和成對(duì)螺旋絲-τ。
3、可能有CNS損傷的患者與神經(jīng)病學(xué)對(duì)照組的CSF-τ水平比較表4顯示可能有CNS損傷的患者CSF樣本中的τ水平和對(duì)照組CSF樣本中的τ水平，該CNS損傷是由占位性損害、病灶侵襲或轉(zhuǎn)移、出血、梗塞或缺血、或由病原體所導(dǎo)致的?？赡苁艿紺NS損傷的患者組的τ水平全面高于神經(jīng)病學(xué)對(duì)照組(p＝0.022，兩側(cè)Mann Whitney檢驗(yàn))，該CNS損傷是由占位性損害、病灶侵襲或轉(zhuǎn)移、出血、梗塞或缺血、或由病原體所導(dǎo)致的。
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權(quán)利要求
1.特異識(shí)別τ的抗體在制造用于個(gè)體CNS損傷的早期檢測和/或量化的診斷試劑盒中的用途，其中CNS損傷是由原發(fā)性良性或惡性腦腫瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、來自寄生蟲的包囊、CNS的轉(zhuǎn)移、化學(xué)因素、或這些機(jī)理聯(lián)合導(dǎo)致的。
2.特異識(shí)別τ的抗體在制造用于個(gè)體CNS損傷的量化診斷試劑盒中的用途，其中CNS損傷是由缺氧或缺血或由物理因素導(dǎo)致的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征進(jìn)一步在于CNS損傷是通過樣品來檢測和/或量化的，其中樣品取自個(gè)體的腦脊液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征進(jìn)一步在于其特征在于CNS損傷是通過樣品來檢測和/或量化的，其中樣品取自個(gè)體的血液衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、3或4中任一項(xiàng)的用途，其中CNS的轉(zhuǎn)移是由白血病、淋巴瘤或乳腺癌引起的。
6.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4的用途，其中缺氧或缺血是由中風(fēng)、腦梗塞、腦出血、血栓形成、圍產(chǎn)期窒息、賓斯旺格氏病或脈管炎導(dǎo)致的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、3或4中任一項(xiàng)的用途，其中化學(xué)因素是基因治療、藥物、化療或暴露于化學(xué)化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4中任一項(xiàng)的用途，其中物理因素是創(chuàng)傷、中風(fēng)、顱內(nèi)壓或輻射。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的用途，其中檢測和/或量化CNS損傷的目的是為了評(píng)價(jià)對(duì)所述CNS損傷的某些治療效果。
10.一種用于個(gè)體CNS損傷的早期診斷的試劑盒，其中CNS損傷是由原發(fā)性良性或惡性腦腫瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、來自寄生蟲的包囊、CNS的轉(zhuǎn)移、化學(xué)因素、或這些機(jī)理聯(lián)合導(dǎo)致，該試劑盒包含用于檢測τ的工具。
11.一種用于個(gè)體CNS損傷的量化的試劑盒，其中CNS損傷是由缺氧或缺血或由物理因素導(dǎo)致的，該試劑盒包含用于檢測τ的工具。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括-與τ的表位形成免疫復(fù)合物的單克隆抗體(第一抗體)；-第二抗體；*它可以是識(shí)別τ-第一抗體復(fù)合物表位、但不識(shí)別單獨(dú)的第一抗體的單克隆抗體，或者*它可以是識(shí)別τ-第一抗體復(fù)合物表位、但不識(shí)別單獨(dú)的第一抗體的多克隆抗體，所述多克隆抗體優(yōu)選利用固定化的τ蛋白或固定化的τ-第一抗體復(fù)合物通過免疫親和色譜法加以純化；-用于特異性標(biāo)記所述第二抗體或者與之偶聯(lián)的標(biāo)記物；-適當(dāng)?shù)木彌_溶液，用于進(jìn)行第一抗體與待測樣本之間、第二抗體與τ-第一抗體復(fù)合物之間和/或第二抗體與標(biāo)記物之間的免疫反應(yīng)；-可能的情況下，為了標(biāo)準(zhǔn)化的目的，含有一個(gè)或多個(gè)τ表位的純化蛋白質(zhì)或合成肽。
13.篩選或監(jiān)測預(yù)防或治療CNS損傷的化合物效果的方法，該CNS損傷是由原發(fā)性良性或惡性腦腫瘤、腦轉(zhuǎn)移瘤、來自寄生蟲的包囊、CNS的轉(zhuǎn)移、化學(xué)因素、或這些機(jī)理聯(lián)合導(dǎo)致的，該方法包括測定τ水平并將其與對(duì)照樣本τ水平進(jìn)行比較的步驟。
14.篩選或監(jiān)測預(yù)防或治療CNS損傷的化合物效果的方法，該CNS損傷是由缺氧或缺血或由物理因素導(dǎo)致的，該方法包括量化τ水平的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性識(shí)別τ的抗體的用途，及包含該抗體的試劑盒。本發(fā)明提供了新穎的個(gè)體CNS損傷的早期診斷方法，所述CNS損傷是由CNS的占位性損害、CNS的病灶侵襲或轉(zhuǎn)移、病原體、缺氧或缺血、化學(xué)因素、物理因素、或這些機(jī)理聯(lián)合導(dǎo)致的。這種新方法包括測定和/或量化所述個(gè)體τ水平并將其與對(duì)照健康個(gè)體τ水平進(jìn)行比較的步驟。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101046476SQ20071010324
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期1999年9月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月8日
發(fā)明者F·胡爾斯塔爾特, E·范梅徹倫, H·范德爾斯蒂徹勒, A·范德沃德, S·范古爾 申請(qǐng)人:基因創(chuàng)新有限公司