專利名稱：蜜環(huán)菌液體發(fā)酵產(chǎn)物hplc指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蜜環(huán)菌液體發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量控制方法，進(jìn)一步講是公開了一種蜜環(huán)菌液體發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC指紋圖譜的建立方法，以及由此方法 所得蜜環(huán)菌液體發(fā)酵產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)HPLC指紋圖譜，屬于中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腦心舒U服液山蜜環(huán)菌、蜂王漿、蜂蜜3味藥物組成，其主藥蜜環(huán)菌 (lr?。縣rj'a/z e"ea)屬擔(dān)子菌亞門，傘菌目，白蘑科，蜜環(huán)菌屬，是--種夏、秋季發(fā)生，能兼性寄生，藥食兼用的真菌?；鹆垦芯堪l(fā)現(xiàn)蜜環(huán)菌有 天麻類似的藥理作用，對屮樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜及抗驚厥作用，能改善血循 環(huán)，增加腦及冠狀動脈血流量，主要用于頭痛、眩暈、神經(jīng)衰弱、冠心病。 該制劑吉林省藥品標(biāo)準(zhǔn)(1986年)只有性狀和常規(guī)檢驗(yàn)，云南省藥品標(biāo) 準(zhǔn)(1993年)只增加一些試管反應(yīng)作為定性鑒別，《:H生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥 成方制劑第二十冊也只有對蜂王漿屮所含的10-羥基-2-癸烯酸(10-HM)的 薄層定性鑒別，而對其主藥蜜環(huán)菌未能做出準(zhǔn)確的定性檢驗(yàn)。經(jīng)檢索未見 蜜環(huán)菌提取物指紋圖譜作為質(zhì)量控制方法的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物HPLC指紋圖譜的建立方法 及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，使以蜜環(huán)菌為原料的腦心舒口服液等系列產(chǎn)品的質(zhì)量 得以更好的控制。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物HPLC指紋圖譜的建立方法包括 以下步驟(1) 對照品溶液的制備稱取尿苷、腺苷和5 —羥甲基糠醛三種對照品 適量置于容量瓶中，加50%甲醇溶解，定容至刻度線，作為對照溶液備用；(2) 樣品溶液的制備蜜環(huán)菌發(fā)酵終止后，通過離心將菌絲體與發(fā)酵 液分離，菌絲體干燥后用研缽研碎成粉末狀，過篩，稱取蜜環(huán)菌粉末，加入甲醇超聲提取30min，放置過夜后再次超聲提取30min;濾過，減壓干燥， 用蒸餾水溶解，過濾，濾液即為供試樣品；(3) 測定分別將對照品溶液和供試樣品溶液注入高效液相系統(tǒng)，檢 測波長254 300nm;以三氟乙酸-水-甲醇為流動相進(jìn)行梯度洗脫，體積 流量1 mL / min，采集45min檢觀!j數(shù)據(jù)；(4) 以對照品色譜峰為參照，根據(jù)中藥色譜指紋圖譜軟件對所得數(shù)據(jù) 和譜圖進(jìn)行處理，得到蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。色譜條件為反相Gs色譜柱；流動相A為O. 1%三氟乙酸甲醇，流動 相B為O. 1%三氟乙酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長280nm。梯度洗脫過程中流動相變化為0- 6min 2%流動相A等度，6_36 min 2 %A-40%流動相A線性梯度，36-45min 40X流動相A等度。蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物指紋圖譜是以對照品色譜峰為參照，根據(jù)中藥色譜指 紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2004A版)對所得數(shù)據(jù)和譜圖進(jìn)行處理，得到蜜環(huán) 菌發(fā)酵產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。在280nm檢測波長下，共檢測到色譜峰43個(gè)， 共有峰15個(gè)，共有率34.9%，整個(gè)色譜圖基線平整，相似度很高(0.9以 上)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)以蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物建立起來的HPLC指紋圖譜，代表了蜜環(huán)菌大部分藥理活性物質(zhì)，能有效地表征蜜環(huán)菌 的質(zhì)量。通過HPLC指紋圖譜中共有峰的有無，提供了一種全面評價(jià)蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物的有效方法，可以作為蜜環(huán)菌質(zhì)量檢測與質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)之一， 更好地控制以蜜環(huán)菌為原料的腦心舒口服液等系列產(chǎn)品的質(zhì)量。


圖1是分別在254nm、 270nm和280nm波長時(shí)蜜環(huán)菌指紋圖譜。 圖2是蜜環(huán)菌三維光譜圖。圖3是254nm不同發(fā)酵批次蜜環(huán)菌HPLC指紋圖譜。 圖4是270nm不同發(fā)酵批次蜜環(huán)菌HPLC指紋圖譜。 圖5是280nm不同發(fā)酵批次蜜環(huán)菌HPLC指紋圖譜。 圖6是樣品精密度試驗(yàn)指紋圖譜。 圖7是樣品重現(xiàn)性試驗(yàn)指紋圖譜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例 l.儀器與試劑1. 1儀器美國Agilent IIOO高效液相色譜儀，DAD檢測器。色譜柱ZORBAX SB—C18 (4.6X150mm， 5um)，美國Agilent公司。1.2試劑甲醇為美國Fisher公司色譜純試劑,三氟乙酸為美國Tedia公司色譜純 試劑。對照品尿苷、腺苷和5—羥甲基糠醛購于中國藥品生物制劑檢定所。2. 方法與結(jié)果2.1對照品溶液的制備稱取尿苷、腺苷和5—羥甲基糠醛三種對照品 各2mg置于2ml容量瓶中，加50%甲醇溶解，定容至刻度線，作為對照溶 液備用；2.2供試品的制備蜜環(huán)菌液體發(fā)酵菌絲體干燥后，用粉碎機(jī)粉碎，過 60目篩。精密稱取蜜環(huán)菌粉末10g，加入80mL甲醇超聲提取30min，放置過夜后再次超聲提取30 min，濾過，35"C減壓干燥，用蒸餾水溶解并容至 lOmL， 12000rpm，室溫離心10min，上清即為供試溶液(相當(dāng)于原藥材1. 0 g /mU。2. 3測定方法取供試品溶液過0. 45 u m濾膜，取20 iU注入液相色譜 儀，流動相O. 1%三氟乙酸甲醇(A)—O. 1%三氟乙酸水溶液(B)， 0-6min 20/^等度，6-36 min 2%A-40% A線性梯度，36-45min 40%A等度。體積 流量1 mL/min。柱溫室溫；檢測波長254nm、 270nm和280nm，記錄 45min內(nèi)的色譜峰及其保留時(shí)間和峰面積。2.4精密度試驗(yàn)取蜜環(huán)菌供試品溶液20"1，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄指 紋圖譜。精密度試驗(yàn)指紋圖譜如圖6所示。相似度分別是0.989、 0.996、 0.997、 0.998、 0.971， RSD為1.1412%。表明該指紋圖譜的精密度良好。2.5重現(xiàn)性試驗(yàn)取蜜環(huán)菌樣品粉末5份，分別按2. 2項(xiàng)下方法制備供 試品溶液，各取20 ul進(jìn)樣，記錄指紋圖譜。重現(xiàn)性試驗(yàn)指紋圖譜如圖7 所示。相似度分別是0.987、 0.995、 0.999、 0.979、 0.998， RSD為0. 8545 %。表明該指紋圖譜的重現(xiàn)性良好。2.6指紋峰及共有峰的選擇在可供比較研究的樣品中，具有相同保留 時(shí)間的峰即為共有峰。計(jì)算指紋圖譜中的共有峰。如圖3所示，在254nm 檢測波長下，共檢測到色譜峰57個(gè)，共有峰20個(gè)，共有率35. 1%,整個(gè)色 譜圖基線平整，相似度很高(0.9以上)，該結(jié)果可以作為其指紋圖譜。如 圖4所示，在270nm檢測波長下，共檢測到色譜峰58個(gè)，共有峰僅11個(gè)， 共有率19.0%，整個(gè)色譜圖基線平整，相似度很高(0.9以上)，該結(jié)果可 以作為其指紋圖譜。如圖5所示，在280nm檢測波長下，共檢測到色譜峰 43個(gè)，共有峰15個(gè)，共有率34. 9%，整個(gè)色譜圖平整，相似度很高(0. 953， 0.985， 0.994， 0.907， 0.979， 0.957， 0.985， 0.917， 0.904， 0.91)，該 結(jié)果可以作為其指紋圖譜。從圖3、 4和5可以看出，280nm時(shí)所檢測的色譜峰較多，且基線穩(wěn)定，所以選取280nm作為指紋圖譜的檢測波長。2.7指紋圖譜的相似度指紋圖譜的相似度是指圖譜的整體相關(guān)性，它 把色譜指紋圖譜的重疊率和共有峰強(qiáng)度結(jié)合起來。本發(fā)明采用2005版藥典 相似度軟件計(jì)算。
權(quán)利要求
1.一種蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物高效液相指紋圖譜的建立方法，其特征在于包括如下步驟(1)對照品溶液的制備稱取尿苷、腺苷和5-羥甲基糠醛三種對照品加甲醇溶解，作為對照溶液備用；(2)樣品溶液的制備蜜環(huán)菌發(fā)酵終止后，通過離心將菌絲體與發(fā)酵液分離，菌絲體干燥后用研缽研碎成粉末狀，過篩，稱取蜜環(huán)菌粉末，加入甲醇超聲提取，放置過夜后再次超聲提??；濾過，減壓干燥，用蒸餾水溶解，過濾，濾液即為供試樣品；(3)測定分別將對照品溶液和供試樣品溶液注入高效液相系統(tǒng)，檢測波長254～300nm；以三氟乙酸-水-甲醇為流動相進(jìn)行梯度洗脫，體積流量1mL/min，采集45min檢測數(shù)據(jù)；(4)以對照品色譜峰為參照，根據(jù)中藥色譜指紋圖譜軟件對所得數(shù)據(jù)和譜圖進(jìn)行處理，得到蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
2. 按照權(quán)利要求1所述的蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物指紋圖譜的建立方法， 其特征在于色譜條件為反相C^色譜柱；流動相A為O. 1%三氟乙 酸甲醇，流動相B為O. 1%三氟乙酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長 254 300nm。
3. 按照權(quán)利要求1所述的蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物指紋圖譜的建立方法， 其特征在于梯度洗脫過程中流動相變化為0- 6min 2X流動相A等 度，6-36 min 2%A_40%流動相A線性梯度，36-45min 40%流動相A等度。
4、 一種蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物指紋圖譜，其特征在于在254 300nm 檢測波長下，檢測到色譜峰43個(gè)，共有峰15個(gè)，共有率34.9%，整 個(gè)色譜圖基線平整。
全文摘要
本發(fā)明提供一種有關(guān)蜜環(huán)菌高效液相指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。涉及蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量管理與質(zhì)量控制。通過對10批次蜜環(huán)菌液體深層發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC指紋圖譜進(jìn)行比較，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)對所得數(shù)據(jù)和譜圖進(jìn)行處理，得到蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。該方法操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定可靠、精密度高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜能有效地表征蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量，為蜜環(huán)菌的質(zhì)量控制與真?zhèn)舞b別提供了一種全新有效的方法。
文檔編號G01N30/02GK101221153SQ200710056168
公開日2008年7月16日 申請日期2007年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月15日
發(fā)明者垠 烏, 于春雷, 孟祥穎, 李喜文, 李玉新, 鄭培和, 鮑永利 申請人:東北師范大學(xué)遺傳與細(xì)胞研究所