專利名稱：：一種和癌癥有關(guān)的組蛋白去甲基化酶及其應(yīng)用的制作方法一種和痛癥有關(guān)的組蛋白去甲基化酶及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)械本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的，本發(fā)明涉及一種癌癥相關(guān)的組蛋白去甲基化酶及其應(yīng)用。背聚拔術(shù)在真核細(xì)胞的細(xì)胞核中，核小體是染色質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)元件。核小體主要由四種組蛋白(H2A,H2B,H3和H4)構(gòu)成。這四種組蛋白和纏繞于組蛋白的DNA共同組成了核小體。每個(gè)組蛋白都有進(jìn)化上保守的N端拖尾伸出核小體外。這些拖尾是許多信號(hào)傳導(dǎo)通路的耙位點(diǎn)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后修飾。該類修飾包括組蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等過程。尤其是組蛋白乙?；?、甲基化修飾能為相關(guān)調(diào)控蛋白提供其在組蛋白上的附著位點(diǎn)，改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和活性。一般來說，組蛋白乙酰化能選擇性的使某些染色質(zhì)區(qū)域的結(jié)構(gòu)從緊密變得松散，開放某些棊因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)其表達(dá)水平。而組蛋白甲基化既可抑制也可增強(qiáng)基因表達(dá)。組蛋白作為DNA纏繞成蛋白不可缺少的一個(gè)部分，同時(shí)也對(duì)基因的表達(dá)起到一種調(diào)控作用。組蛋白可以被甲基化和去甲基化。組蛋白的甲基化在調(diào)控染色體動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)以及其轉(zhuǎn)錄功能上起到了重要的作用。組蛋白H3的K4、K9、K27、K36、K79和H4的K20均可被甲基化。組蛋白H3第9位賴氨酸的甲基化與基因的失活相關(guān)連；組蛋白H3第4位賴氨酸和第36位氨基酸的甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄異常相關(guān)連;組蛋白H3第27位賴氨酸的甲基化與同源盒基因沉默、X染色體失活、基因印記等基因沉默現(xiàn)象有關(guān)；組蛋白H3第79位賴氨酸的甲基化與防止基因失活和DNA修復(fù)有關(guān)。與此同時(shí)，組蛋白的去甲基化也受到廣泛的關(guān)注。組蛋白的甲基化常發(fā)生在精氨酸的胍基或是賴氨酸的e氨基上。每個(gè)賴氨酸有3種不同的甲基化狀態(tài)，即一個(gè)甲基(一甲基)，兩個(gè)甲基(二甲基)或三個(gè)甲基(三甲基)通過化學(xué)價(jià)偶聯(lián)到賴氨酸側(cè)鏈上的e氨基團(tuán)上，精氨酸可以被一甲基化或二甲基化。一直以來組蛋白的甲基化被認(rèn)為是一種穩(wěn)定的修飾，但是近來的研究證明并非如此。直至現(xiàn)在，所有發(fā)現(xiàn)的去甲基化酶都是賴氨酸特異的且只能去除特異賴氨酸的單個(gè)甲基或兩個(gè)甲基(見表1)，人們不知是否有一個(gè)能去除特異賴氨酸的所有三個(gè)甲基的組蛋白去甲基化酶存在。<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>*高濃度才有活性因此，本領(lǐng)域有必要尋找和研究更多的組蛋白去甲基化酶，并對(duì)其作用機(jī)制、疾病相關(guān)性以及應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)一步研究。發(fā)明內(nèi)審本發(fā)明的目的在于提供一種去甲基化酶。本發(fā)明的另一目的在于提供所述去甲基化酶的疾病相關(guān)性及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種JARID1蛋白或其活性片段或活性衍生物的用途，用作去甲基化酶或用于制備去甲基化酶制劑組合物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的去甲基化酶是組蛋白去甲基化酶。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的JARID1蛋白選自JARID1A(RBP-2)蛋白，JARID1B(PLU-1)蛋白，JARID1C(SMCX)蛋白，或JARID1D(SMCY)蛋白。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的去甲基化酶去除甲基化的組蛋白亞基3(H3)第4位賴氨酸(K4)上的甲基。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的甲基化的組蛋白亞基3第4位賴氨酸上含有1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)甲基。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的組蛋白亞基3第4位賴氨酸的甲基化導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄異常。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的基因轉(zhuǎn)錄異常(活性變化)導(dǎo)致癌癥。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的JARID1蛋白的活性片段或活性衍生物包含JARIDl的JmjC結(jié)構(gòu)域，Arid結(jié)構(gòu)域，JmjN結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)域和PHD結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的制劑組合物中還包括抗壞血酸維生素C(AA)，ct翻戊二酸(ciKG)，和二價(jià)鐵離子(Fe2+)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的去甲基化酶用于制備調(diào)控雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性的制劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的去甲基化酶用于制備檢測癌癥的制劑或試劑盒。在本發(fā)明的第二方面，提供一種去甲基化酶制劑組合物，所述去甲基化酶制劑組合物含有(a)有效i的JARIDl蛋白；(b)有效量的抗壞血酸維生素C，ci酮戊二酸，和二價(jià)鐵離子；和(c)生物學(xué)上相容的載體。在本發(fā)明的第三方面，提供一種JARID1蛋白、其活性片段或活性衍生物、或它們的激動(dòng)劑或拮抗劑的用途，用于制備調(diào)控雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性的制劑；或用于制備預(yù)防或治療癌癥的藥物。在本發(fā)明的第四方面，提供一種JARID1蛋白的用途，用于制備檢測癌癥的制劑或試劑盒。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的癌癥是前列腺癌。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1A:人源的含有JmjC結(jié)構(gòu)域的蛋白。在PubMed數(shù)據(jù)庫搜索得到了30個(gè)人源的含有J依jC結(jié)構(gòu)域的蛋白。在VectorNTI軟件中，應(yīng)用ClustalW算法進(jìn)行分析可以得到如圖所示的結(jié)果。圖1B:JARID1家族結(jié)構(gòu)示意圖。JARID1家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹以及蛋白的保守結(jié)構(gòu)域由NCBICDD的搜索引擎和VectorNTIClustalW算法分析得到，可見JARID1家族各蛋白在結(jié)構(gòu)上較為保守。圖2:JARID1B為H3K4去甲基化酶。該圖為免疫組化反應(yīng)的結(jié)果材料為已被Myc-JARIDlB轉(zhuǎn)染或未被轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞(混合體系)；抗體為抗H3K4、H3K9、H3K27或H3K36的單甲基化、二甲基化或三甲基化的抗體，以及抗Myc抗體。其中，第l、2、3列分別為DAPI染色、抗Myc抗體染色和抗甲基化賴氨酸抗體染色(A中第1、2、3行分別為H3K4三甲基化(H3K4me3)、H3K9三甲基化和H3K36三甲基化;B中第l、2、3行分別為H3K4二甲基化(H3K4me2)、H3K9二甲基化(H3K9me2)和H3K27(H3K27me2)二甲基化；C中第l、2、3行分別為H3K4單甲基化(H3K4mel)、H3K9單甲基化(H3K9mel)和H3K36單甲基化(H3K36mel)。箭頭表示JARID1B表達(dá)的細(xì)胞。圖3:JmjN,Arid,JmjC，PHD和鋅指是JARID1B去甲基化酶活性所必需的結(jié)構(gòu)域。其中A，結(jié)構(gòu)域去餘實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)圖；B和D，抗甲基化H3K4的免疫組化實(shí)驗(yàn)含myc-JARID1BC端缺失突變體(JARIDlBAC)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞(B)，含myc-JARID1BPHD1(APHD1)，JmjN(AJmjN)，Arid(AArid)，鋅指(△ZF)或JmjC(△JmjC)結(jié)構(gòu)域缺失突變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞(D);第l、2、3列分別為DAPI染色、抗Myc抗體染色和抗甲基化H3K4抗體染色(B，上圖H3K4三甲基化；中圖H3K4二甲基化；下圖H3K4單甲基化；D，右側(cè)H3K4二甲基化)。箭頭所示為表達(dá)突變體的細(xì)胞。C，不同突變體蛋白表達(dá)的Western印跡檢測。圖4:JARID1B是依賴于二價(jià)鐵離子和a-酮戊二酸的雙加氣酶。A，在各種輔助因子存在的情況下，組蛋白與純化過的JARID1BAC蛋白(AC片段)發(fā)生反應(yīng)(泳道2，另外泳道1為不加JARID1BAC蛋白時(shí)的對(duì)照)，特異檢測H3K4三、二和單甲基化和特異檢測H3K9三甲基化的Western印跡分析。B，組蛋白與JARIDlBAC蛋白反應(yīng)(泳道2-6)(以不加JARID1BAC蛋白的反應(yīng)作為對(duì)照泳道l)，其中泳道2的反應(yīng)在所有的輔助因子(AA、aKG和Fe(II))存在的情況下發(fā)生；泳道6中加入了EDTA;泳道3-5各缺失了一種反應(yīng)輔助因子；特異檢測H3K4二甲基化的Western印跡也在隨后的實(shí)驗(yàn)中完成。以Histone作為對(duì)照。C，組蛋白與JARID1B△C蛋白反應(yīng)(泳道2-5)(不加JARID1B△C蛋白的反應(yīng)作為對(duì)照泳道l)，其中，泳道3-5的N-乙二酰甘氨酸(N-Oxalylglycine)含量逐漸減少，隨后的Western印跡采用特異檢測H3K4二甲基化的抗體(Anti-H3K4me2);以Histone作為對(duì)照。D，免疫組化反應(yīng)材料為轉(zhuǎn)染了H499A突變體的Hela細(xì)胞；抗體為特異檢測H3K4甲基化的抗體。第l、2、3列分別為DAPI染色、抗Myc抗體染色和抗甲基化H3K4抗體染色(B，上圖H3K4三甲基化；中圖H3K4二甲基化；下圖H3K4單甲基化)。箭頭所示為表達(dá)H499A突變體的細(xì)胞。圖5:JARID1B是前列腺癌治療過程中的一種靶分子。A，本發(fā)明人分析了Oncomine數(shù)據(jù)庫中JARIDlB基因表達(dá)的數(shù)據(jù)。方框內(nèi)的粗橫線是基因表達(dá)的平均水平，封閉的方框代表的覆蓋率為95%。方框上下橫線代表誤差，上下兩點(diǎn)代表基因表達(dá)的范圍。每一組的病例數(shù)分別為良性前列腺組織23例，前列腺癌64例，轉(zhuǎn)移型的前列腺癌25例(P-Value=1.8E-10，correlation=0.561)。B，前列腺組織樣品的Western印跡檢測(BPH(BenignProstateHyperplasia)代表良性前列腺癌增生；癌癥l、癌癥2代表兩例前列腺癌)，以e-actin作為對(duì)照。C，100ngAR和100ngPSA-熒光素酶與梯度增加的JARID1B—同轉(zhuǎn)染入LNCaP細(xì)胞，經(jīng)雄激素R1881(R1881)刺激(設(shè)置不經(jīng)R1881刺激的反應(yīng)作為對(duì)照)兩天后檢測熒光素酶的活性。D,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)泳道l和3是轉(zhuǎn)染了His-JARID1B和HA-AR的293T細(xì)胞裂解液；泳道2和4為轉(zhuǎn)染了His-JARID1B但未轉(zhuǎn)染HA-AR的293T細(xì)胞裂解液。其中，泳道1和2為上樣對(duì)照，3和4為免疫共沉淀試驗(yàn)后的檢測結(jié)果(上圖為anti-HA的檢測結(jié)果，而下圖為anti-His的檢測結(jié)果)。圖6:斑點(diǎn)雜交檢測抗體的特異性。把H3K4不同甲基化形式的合成多肽(H3K4rael、H3K4me2、H3K4me3)點(diǎn)到硝酸纖維膜上，結(jié)合牢固后由特異的抗體(Anti-H3K4mel、Anti-H3K4me2、Anti-H3K4me3)進(jìn)行檢測。上樣量分別為50ngH3K4單甲基化多肽、15ngH3K4雙甲基化多肽和50ngH3K4三甲基化多肽。圖7:JARID1BAC蛋白酶活特異性的檢測。轉(zhuǎn)染了含myc-JARID1BC端缺失突變體(JARID1B△C)的質(zhì)粒的Hela細(xì)胞的免疫組化實(shí)驗(yàn)，所使用的抗體是賴氨酸各種甲基化狀態(tài)的抗體。第l、2、3列分別為DAPI染色、抗Myc染色和抗甲基化賴氨酸染色(它們分別是H3K9單甲基化，H3K9三甲基化，H3K27三甲基化，H3K36三甲基化的檢測結(jié)果)。箭頭所示為表達(dá)突變體的細(xì)胞。圖8:J邁jN，Arid，JmjC，PHD1和鋅指是JARID1B去甲基化酶活性所必需的結(jié)構(gòu)域。免疫組化實(shí)驗(yàn)材料為轉(zhuǎn)化了含myc-JARID1B各種結(jié)構(gòu)域缺失突變體的質(zhì)粒的Hela細(xì)胞，使用的抗體為特異識(shí)別H3K4三甲基化和單甲基化的兩種抗體。第l、2、3列分別為DAPI染色、抗Myc抗體染色和抗甲基化H3K4抗體染色。箭頭所示為表達(dá)突變體的細(xì)胞。圖9:純化后的His-JARIDlBAC蛋白考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。反應(yīng)柱內(nèi)的沉淀或洗脫液都分別進(jìn)行了SDS-PAGE分析并由考馬斯亮藍(lán)染色。圖10:JARID1A，JARID1C和JARID1D都有H3K4去甲基化活性。免疫組化實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化了含myc-JARID1A(上圖)，JARID1C(中圖)和JARID1D(下圖)的質(zhì)粒的Hela細(xì)胞，第l、2、3列分別為DAPI染色、抗Myc抗體染色和抗H3K4三甲基化的抗體染色。圖ll:JARID1A，JARID1C和JARID1D在前列腺組織中的表達(dá)。本發(fā)明人分析了Oncomine數(shù)據(jù)庫中基因表達(dá)的數(shù)據(jù)。方框內(nèi)的粗橫線是基因表達(dá)的平均水平，封閉的方框代表的覆蓋率為95%。方框上下橫線代表誤差，上下兩點(diǎn)代表基因表達(dá)的范圍。每一組的病例數(shù)分別為良性前列腺組織23例，前列腺癌64例，轉(zhuǎn)移型的前列腺癌25例。圖12:JARID1B的蛋白序列，每個(gè)字母代表一個(gè)氨基酸，JARID1B全長1544個(gè)氨基酸。具體實(shí)施方式本發(fā)明人通過深入的生物信息學(xué)和生物化學(xué)的分析，首次揭示JARID1蛋白可用作去甲基化酶或用于制備去甲基化酶制劑組合物。JARID1蛋白可特異性針對(duì)組蛋白亞基3(H3)第4位賴氨酸(K4)發(fā)揮去甲基化作用，并且其能去除甲基化的H3K4上l個(gè)(H3K4mel)、2個(gè)(H3K4me2)或3個(gè)甲基(H3K4me3)。JARID1在細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)可引起H3K4上的三甲基化、二甲基化以及一甲基化的缺失，但卻不影響組蛋白其它賴氨酸位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。并且，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，所述JARID1與癌癥密切相關(guān)，其可作為癌癥診斷和治療的一個(gè)靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上完成本發(fā)明。JARID1蛋白JARID1蛋白是一類存在于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白，JARID1蛋白包括JARID1A蛋白、JARID1B蛋白、JARID1C蛋白、JARID1D蛋白，這些蛋白在結(jié)構(gòu)上類似(見圖1B)，在序列上具有較髙的同源性。JARID1蛋白含有一系列的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域包括JmjN結(jié)構(gòu)域，Bright/Arid結(jié)構(gòu)域，多個(gè)PHD結(jié)構(gòu)域，JmjC結(jié)構(gòu)域，鋅指(ZF)結(jié)構(gòu)域等。這一系列的結(jié)構(gòu)域衍生出其一系列的功能。在本發(fā)明中，所用的JARID1蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自動(dòng)物組織或細(xì)胞。此外，所述的JARID1蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來生產(chǎn)重組JARID1蛋白或全人工合成或半合成。優(yōu)選的，本發(fā)明可采用重組的JARID1蛋白。任何適合的JARID1蛋白均可用于本發(fā)明。所述的JARID1蛋白包括全長的JARID1蛋白或其生物活性片段。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的JARID1蛋白是JARID1B蛋白，其氨基酸序列可以與GenBank登錄號(hào)NP—006609所示的序列基本上相同，例如其氨基酸序列見圖12所示(SEQIDN0:12)。此外，JARID1A、JARID1C和JARID1D的氨基酸序列可分別與GenBank登錄號(hào)NP一00136068、GenBank登錄號(hào)NP一004178和GenBank登錄號(hào)NP一004644所示的氨基酸序列基本上相同。經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氣基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的JARID1蛋白的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。JARID1蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域的公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識(shí)到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個(gè)氨基酸基本上不會(huì)改變生物活性。見Watson等MolecularBiologyofTheGene，第四版，1987，TheBenjamin/Cu咖ingsPub.Co.P224。任何一種JARID1蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，JARID1蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的JARID1蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長JARID1蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長JARID1蛋白的60先、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。作為一種優(yōu)選的方式，所述的JARIDl蛋白的生物活性片段至少包括JmjC結(jié)構(gòu)域；更優(yōu)選的，所述的JARIDl蛋白的生物活性片段包括JmjC結(jié)構(gòu)域，Arid結(jié)構(gòu)域，JmjN結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)域，和PHD結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的JARID1蛋白(JARID1蛋白的衍生物)，比如，可采用為了促進(jìn)其半衰期、有效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的JARID1蛋白。所述經(jīng)過修飾或改良的JARID1蛋白可以是一種JARID1蛋白的共軛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述經(jīng)過修飾或改良的JARID1蛋白或者基因可以是與天然存在的JARID1蛋白或基因具有一定的不同點(diǎn)，但也能發(fā)揮本發(fā)明所述的特異性去甲基化作用，且不會(huì)帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響JARID1蛋白的生物活性或者說是基因的生物功能的變化形式都可用于本發(fā)明中。任何與所述的JARID1蛋白同源性高(比如與JARID1蛋白的同源性為70先或更高，優(yōu)選的，同源性為80%或更高，更優(yōu)選的，同源性為90%或更高)的、且具有JARID1蛋白相同功能的蛋白也包括在本發(fā)明內(nèi)。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例，提供一種人的JARID1B蛋白，它是一條具有1544個(gè)氨基酸的蛋白，其蛋白序列參見GenBank登錄號(hào)NP—006609，其蛋白序列為圖12所示(SEQIDNO:12)。JARID1的用途本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，JARID1可用作去甲基化酶或用于制備去甲基化酶制劑組合物。更優(yōu)選的，所述的去甲基化酶是組蛋白去甲基化酶。進(jìn)一步的研究顯示，JARID1可特異性去除組蛋白亞基3(H3)中賴氨酸上的甲基；更優(yōu)選地，JARID1可去除組蛋白亞基3(H3)第4位賴氨酸(K4)。更有甚者，JARID1不僅可去除一甲基化的H3K4上的甲基，還可去除二甲基化的H3K4或者三甲基化的H3K4上的所有甲基。高水平的H3K4me3和H3K4me2與幾乎所有活化的基因的5'端翻譯區(qū)有密切關(guān)聯(lián)，與轉(zhuǎn)錄率、活化的聚合酶n的分布幾率以及組蛋白的乙?；蕉汲烧韵嚓P(guān)。因此可見，針對(duì)于H3K4me3和H3K4me2的去甲基化酶具有抑制轉(zhuǎn)錄的活性。此外，本發(fā)明人在研究中還發(fā)現(xiàn)，在JARID1的各個(gè)結(jié)構(gòu)域中，JmjC結(jié)構(gòu)域，JmjN結(jié)構(gòu)域，Arid結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)域，和raD結(jié)構(gòu)域是JARIDl發(fā)揮去甲基作用所必需的。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例證明了這一點(diǎn)。當(dāng)選擇性地缺失JmjC結(jié)構(gòu)域，JmjN結(jié)構(gòu)域，Arid結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)域，或PHD結(jié)構(gòu)域時(shí)，JARID1喪失了去甲基化酶的活力。此外，本發(fā)明人在研究中還發(fā)現(xiàn)，JARID1是一種癌癥相關(guān)的蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中證明，在良性的前列腺增生中JARID1B的表達(dá)很低，前列腺癌越嚴(yán)重，JARID1B的表達(dá)就越高。此外，在良性前列腺增生組織中，JARID1A和JARID1C的表達(dá)有限，在前列腺癌中也是有限的，然而其表達(dá)量在轉(zhuǎn)移型前列腺癌中明顯升高。這說明JARID1與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)聯(lián)。因此提示JARID1可作為癌癥診斷和治療的一個(gè)靶位點(diǎn)。此外，本發(fā)明人還鑒定了JARID1B可與雄激素受體(AndrogenRec印tor，AR)之間發(fā)生相互作用以及可調(diào)節(jié)雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性。調(diào)節(jié)JARID1B的表達(dá)可調(diào)控雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性，并且呈劑量依賴性。通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，JARID1B與雄激素受體可發(fā)生直接的相互作用?；诒景l(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供JARID1蛋白(包括JARID1A蛋白、JARID1B蛋白、JARID1C蛋白、JARID1D蛋白，或它們的活性片段或活性衍生物)的用途，用作去甲基化酶或用于制備去甲基化酶制劑組合物。作為本發(fā)明的更優(yōu)選的方式，所述的去甲基化酶是組蛋白去甲基化酶。作為本發(fā)明的更優(yōu)選的方式，所述的去甲基化酶去除甲基化的組蛋白亞基3(H3)第4位賴氟酸(K4)上的甲基。作為本發(fā)明的更優(yōu)選的方式，所述的甲基化的組蛋白亞基3第4位賴氨酸上含有l(wèi)個(gè)(H3K4mel)、2個(gè)(H3K4me2)或3個(gè)甲基(H3K4me3)。并且，由于所述的JARID1蛋白是一種癌癥相關(guān)的蛋白，其還可用于制備檢測癌癥的制劑或試劑盒。作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，其可用于制備檢測前列腺癌的制劑或試劑盒。并且，由于JARID1與雄激素受體可發(fā)生相互作用且可調(diào)控雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性，因此其可用于制備調(diào)控雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性的制劑。已有的研究已經(jīng)表明，前列腺痛的發(fā)生或發(fā)展與雄激素受體的活性密切相關(guān)；并且，目前在本領(lǐng)域中通常都采用調(diào)節(jié)雄激素受體的藥物來治療前列腺癌。因此提示，可通過調(diào)節(jié)JARID1的生物學(xué)活性來調(diào)節(jié)雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而可以達(dá)到治療前列腺癌的效果。JARID1蛋白的調(diào)節(jié)劑及其用途任何可調(diào)節(jié)JARID1蛋白的活性、調(diào)節(jié)JARID1蛋白的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)JARID1蛋白的表達(dá)、調(diào)節(jié)JARID1蛋白有效作用時(shí)間、或調(diào)節(jié)JARID1蛋白的轉(zhuǎn)錄或翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為調(diào)節(jié)JARID1蛋白活性或表達(dá)的有效物質(zhì)。通過調(diào)節(jié)JARID1蛋白活性或表達(dá)來調(diào)節(jié)甲基化的組蛋白特定亞基的特異位點(diǎn)上的甲基數(shù)量，從而可調(diào)節(jié)諸如基因的轉(zhuǎn)錄等事件；或者，通過調(diào)節(jié)JARID1蛋白活性或表達(dá)來調(diào)節(jié)雄激素受體的轉(zhuǎn)錄狀況；或者，通過改變JARID1的活性或表達(dá)可以達(dá)到治療痛癥的效果。組合物本發(fā)明提供了一種組合物，它含有有效量(如0.0001-20%;優(yōu)選的，為0.001-10%)的所述的JARID1B蛋白，以及生物學(xué)上相容的載體。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，所述的JARID1B蛋白發(fā)揮酶活需要外源的抗壞血酸維生素C、二價(jià)鐵離子(Fe(II)離子)、或a酮戊二酸作為輔因子。因此，更優(yōu)選地，本發(fā)朋所述的組合物中還含有有效量(如0.00001-10%;優(yōu)選的，為0.0001-5。/。)的抗壞血酸維生素C，a酮戊二酸，F(xiàn)e(II)離子，或它們的組合；最優(yōu)選的，所述的組合物中同時(shí)含有抗壞血酸維生素C，ct酮戊二酸和Fe(II)離子。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和生物學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。術(shù)語"有效i"或"有效劑董"是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。術(shù)語"生物學(xué)上相容"的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語"生物學(xué)上相容的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。試劑盒本發(fā)明還提供一種檢測癌癥或檢測雄激素受體的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增JARID1基因、轉(zhuǎn)錄本的引物；或檢測JARID1蛋白表達(dá)水平的制劑(如抗JARID1蛋白的特異性抗體)。作為一種優(yōu)選的方式，所述的癌癥是前列腺癌。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、對(duì)照液、顯色液、洗液、抗體等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書。本發(fā)明的主耍優(yōu)點(diǎn)在于(1)首次揭示JARID1蛋白可用作去甲基化酶或用于制備去甲基化酶制劑組合物。并且JARID1可特異性去除三甲基化、二甲基化或單甲基化的H3K4上的甲基。本發(fā)明還克服了現(xiàn)有技術(shù)中沒有找到針對(duì)三甲基化的H3K4的去甲基化酶的缺陷。(2)首次發(fā)現(xiàn)JARID1與癌癥(特別是前列腺癌)密切相關(guān)，可作為一種新的癌癥診斷和治療的靶點(diǎn)。(3)首次發(fā)現(xiàn)JARID1B可調(diào)控雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性，因此可通過調(diào)節(jié)JARID1B的表達(dá)或活性來調(diào)節(jié)雄激素受體的活性，從而可以改變癌癥的生長和治療效果。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。I.材料和方法本發(fā)明具體實(shí)施方式中使用到以下的材料和方法，這些材料和方法并非用于對(duì)本發(fā)明的限制。并且，常規(guī)的PCR、連接、感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和提取、免疫沉淀、免疫組化等操作可參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南?？贵w及其來籌H3K4單甲基化抗體(Abeam8895)、H3K4二甲基化抗體(Abeam7766)、H3K4三甲基化抗體(Abeam8580)、H3K9單甲基化抗體(Abeam9045)、H3K9二甲基化抗體(Upstate07-212)、H3K9三甲基化抗體(Abeam8898)、H3K27單甲基化抗體(Upstate07-448)、H3K27二甲基化抗體(Upstate07-452)、H3K36單甲基化抗體(Abeam9048)、H3K36二甲基化抗體(Upstate07-274)、H3K36三甲基化抗體(Abeam9050)、抗H3抗體(Abeam1791)、抗Flag抗體(SigmaF7425-0.2MG)、抗Myc抗體(CalbiochemOP10)和(Sigmac-3956)、抗AR(N-20)抗體(SantaCruz，sc-816)、羊抗兔IgG(Jackson)、羊抗鼠IgG(Jackson)、驢抗兔(MolecularProbesAlexa594)和羊抗鼠(MolecularProbesAlexa488)、a-FlagM2親和膠(SigmaA2220)?；瘜W(xué)試荊無水a(chǎn)-酮戊二酸二鈉鹽(SigmaCattt75892)，N-oxalyglycine(AlexisBiochemicalsCat共270-412-M010)、抗壞血酸(SigmaCat#F1543)、Ni-NTA柱(25ml)(QiagenCatH30210)。質(zhì)粒枸建pcDNA，JARIDlB(JARIDlBcDNA克隆于pcDNA3.1(-)/MYC-HisA),由英國癌癥研究中心的JoyceTaylor-P,dimitriou提供(或參見文獻(xiàn)TheJournalofBiologicalChemistry274:15633)。含有缺失突變體的質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下(所有PCR擴(kuò)增片段和片段插入位點(diǎn)均已經(jīng)過測序確認(rèn))質(zhì)粒pcDNA-JARID1B經(jīng)過EcoRV和XhoI雙酶切并線形化處理后，補(bǔ)平后經(jīng)自連接環(huán)化，形成含JARID1BC端缺失突變體的質(zhì)粒。以pcDNA-JARID1B為模板，PCR擴(kuò)增-132到93的基因片段，引物序列如下GTACATGACCTTACGGG(SEQIDNO:1);ATAGCGGCCGCTCGGGTGGAGGCAGGAACT(SEQIDNO:2)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoI和NotI雙酶切后，連入經(jīng)過XhoI和NotI雙酶切處理的pcDNA-JARID1B，形成含JARID1BJmjN功能域缺失突變體的質(zhì)粒。以pcDNA-JARID1B為模板，PCR擴(kuò)增-132到933和1066到1800兩段基因片段，引物序列分別如下-132到933片段引物GTACATGACCTTACGGG(SEQIDNO:1);ATAGGATCCGACATACAGGTCCACAGCAT(SEQIDNO:3)。1066到1800片段引物ATAGGATCCTGTTTGGCTCAGGAATGTAG(SEQIDNO:4);GCAGAAGTTAACAGCCTCAG(SEQIDNO:5)。PCR擴(kuò)增片段先分別亞克隆到T載體，分別經(jīng)Xba1/BaniHI(對(duì)應(yīng)于含有-132到933片段)和BamHI/HpaI(對(duì)應(yīng)于含有1066到1800片段)雙酶切后，連入經(jīng)過XbaI和HpaI雙酶切處理的pcDNA-JARIDlB，三片段連接，形成含JARID1BraD功能域缺失突變體的質(zhì)粒。以pcDNA-JARID1B為模板，PCR擴(kuò)增-132到1464的基因片段，引物序列如下GTACATGACCTTACGGG(SEQIDNO:1);ATACAACCAAGGMGTTTC(SEQIDNO:6)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XbaI和HpaI雙酶切后，連入經(jīng)過XbaI和HpaI雙酶切處理的pcDNA-JARID1B，形成含JARID1BJmjc功能缺失突變體的質(zhì)粒。以pcDNA-JARIDlB為模板，PCR擴(kuò)增-132到1502和1491到1800兩段基因片段，引物序列分別如下--132到1502片段引物GTACATGACCTTACGGG(SEQIDNO:1);TCAATTGCCCAACAGAATGAAGAAAAGCACATTCC(SEQIDNO:7)。1491到1800片段引物TTGGGCMTTGAAGACCACTGGAGC(SEQIDNO:8);GCAGAAGTTAACAGCCTCAG(SEQIDNO:9)。PCR擴(kuò)増片段先亞克隆到T載體，經(jīng)Xba1/MfeI(對(duì)應(yīng)于含有-132到1502片段)和MfeI/HpaI(對(duì)應(yīng)于含有1491到1800片段)雙酶切后，連接到經(jīng)XbaI和HpaI雙酶切處理的pcDNA-JARID1B，三片段連接，形成H499A功能域缺失突變體。細(xì)胞轉(zhuǎn)染和曹estern印跡Hela、LNCaP、293T細(xì)胞(購自ATCC)在Iscove，sDMEM(10%FBS)培養(yǎng)基中生長。細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine2000(Invitrogen)。前列腺組織由上海第六人民醫(yī)院提供(已經(jīng)得到院組織評(píng)定組許可)。Western印跡細(xì)胞或組織用SDS上樣緩沖液制成勻漿，經(jīng)SDS-PAGE膠分離后，用相應(yīng)的抗體染色后由ECL曝光成像。免疫組化Hela細(xì)胞被培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72h后，細(xì)胞由PBS清洗一次后，4%多聚甲醛浸泡10min,然后再由預(yù)冷的PBS清洗，后經(jīng)含有0.2%TritonX-100的預(yù)冷PBS浸泡5min。細(xì)胞由封閉緩沖液(含有1%BSA的PBS)清洗三次后封閉1個(gè)小時(shí)，而后與一抗混合反應(yīng)30min。PBS清洗三次后，細(xì)胞與二抗混合反應(yīng)l個(gè)小時(shí)。PBS清洗，DAPI(1:4000)染色。PBS清洗兩次后熒光萃滅封片劑(VectorLaboratories)封片，熒光顯微鏡觀察。His-JARID1BAC蛋白的表達(dá)純化以pcDNA-JARIDlB為模板，PCR擴(kuò)增1到2250的基因片段，引物序列如下ATAGGATCCATGGAGGCGGCCACCACACT(SEQIDNO:10);和ATACTCGAGAAGCTTCAATGCATTCATC(SEQIDNO:11)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切后，連入經(jīng)過XhoI和BamHI雙酶切處理的pET28a(+)(Novagen),形成含His-ACJARID1B的pET28a(+)-△C-JARID1B。該cDNA轉(zhuǎn)入Rosetta大腸桿菌菌株(Novagen)，37°C、250轉(zhuǎn)/秒培養(yǎng)。當(dāng)OD達(dá)至lj0.5-0.6時(shí)加入0.05mM，OlmM，0.5mM,lmM的IPTG在16'C誘導(dǎo)蛋白表達(dá)過夜。收集菌體并重懸于裂解緩沖液，200W超聲25次(超聲2s，停15s)。將上清裝入平衡過的鎳柱，用2ml漂洗緩沖液l(50mMNaH2P04、300mMNaCl、20mM咪唑，pH8.0)洗2次，0.5ml漂洗緩沖液2(50mMNaH2P04、300raMNaCl、40raM咪哇，pH8.0)洗4次，0.5ml漂洗緩沖液3(50mMNaH2P04、300mMNaCl、60nAI咪唑，pH8.0)洗l次。重組蛋白用0.lml洗脫緩沖液(50mMNaH2P04、300idMNaCl、250mM咪唑，pH8.0)分12次洗脫。去甲基化檢,組蛋白或者具有不同甲基化形式的合成多肽和His-JARID1BAC蛋白在去甲基化緩沖液(20mMTris-HC1pH7.3，150mMNaCl，50uM(NH。2Fe(S04)2+6(H20)，lmMa-酮戊二酸，2mM抗壞血酸)中反應(yīng)3個(gè)小時(shí)(37°C)。5-10ug的His-JARID1BAC蛋白與2.5-5ug的組蛋白在如上所述的100u1體系中進(jìn)行去甲基化反應(yīng)，經(jīng)SDS-PAGE上樣緩沖液終止后由Western印跡檢測。II.實(shí)據(jù)例實(shí)施擁l運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法鑒別包含JmjC結(jié)構(gòu)域的人源蛋白本發(fā)明人運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了人源的包含JmjC結(jié)構(gòu)域的蛋白基因序列，因?yàn)镴mjC結(jié)構(gòu)域己經(jīng)被證明是組蛋白去甲基化酶催化活性結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明人從PubMed上找到30個(gè)候選基因，將它們分成七大組，見圖1A。除了那些己經(jīng)被證明具有組蛋白去甲基化活性的蛋白家族(第二組中的JHDMl，第三組中的JHDM2，以及第六組中的JMJD2)(圖1A或表1)，本發(fā)明人預(yù)測第五組的JARID1蛋白家族是一組新型的區(qū)別于以往已鑒定的去甲基化酶具有不同賴氨酸特異性的去甲基化酶。在JARID1蛋白家族有四個(gè)蛋白(見圖1B)中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)JARID1B具有可去除H3K4三甲基、二甲基和一甲基的功能，JARID1A，JARID1C和JARID1D也有同樣的功能，具體的驗(yàn)證見后續(xù)的實(shí)施例。實(shí)施倒2JARID1B的體內(nèi)去甲基化活性為了證明本發(fā)明人的假設(shè)，把帶Myc標(biāo)記的JARIDlB載體(pcDNA-JARID1B)轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞，然后運(yùn)用特異抗H3K4三甲基(H3K4me3)抗體通過免疫組化的方法來檢測組蛋白賴氨酸的甲基化狀況是否受到影響。與相鄰沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，外源表達(dá)的Myc-JARID1B導(dǎo)致了H3K4me3完全丟失，見圖2A第1行。然而JARID1B的高表達(dá)卻不能影響H3K9me3(圖2A第2行)以及H3K36me3(圖2A第3行)的水平。這些數(shù)據(jù)表明，JARID1B是一個(gè)H3K4me3特異的去甲基化酶。為了檢測JARID1B是否也具有去除H3K4的一甲基和二甲基作用，本發(fā)明人用其它抗組蛋白修飾的特異抗體免疫染色了Myc-JARID1B轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)JARID1B高表達(dá)的細(xì)胞也能導(dǎo)致H3K4二甲基(H3K4me2)(圖2B第1行)以及H3K4—甲基(H3K4mel)(圖2C第1行)的甲基丟失，而相鄰沒有轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞發(fā)出的強(qiáng)烈的H3K4me2和H3K4rael信號(hào)作為陰性對(duì)照。該去甲基化酶針對(duì)于H3K4的去二甲基化和去一甲基化是特異性的，因?yàn)楦弑磉_(dá)的JARID1B對(duì)H3K9me2(圖2B第2行)，H3K27me2(圖2B第3行)，H3K9mel(圖2C第2行)以及H3K36mel(圖2C第3行)沒有作用。綜上結(jié)果表明，JARID1B是一個(gè)H3K4特異的能去除三、二以及一甲基的組蛋白去甲基化酶。JARID1B具有去除H3K4三甲基、二甲基以及一甲基的去甲基化能力是非常令人驚奇的，因?yàn)橐酝需b定的組蛋臺(tái)去甲基化酶僅僅能從特異的賴氨酸去除一個(gè)甲基或二個(gè)甲基。為了進(jìn)一步確認(rèn)本發(fā)明人使用的抗體是特異的，運(yùn)用合成的具有特異甲基化狀態(tài)的短肽作為抗原，用前述使用的抗體做了點(diǎn)免疫印記反應(yīng)，結(jié)果顯示針對(duì)于不同甲基化狀態(tài)的短肽抗體是特異的，見圖6。此外，本發(fā)明人還用不同批號(hào)的抗體，運(yùn)用免疫組化的方法來進(jìn)一步鑒定，證明所使用的甲基化特異的抗體是特異的。實(shí)施例3JmjN,Arid,JmjC,PHD和鋅指結(jié)構(gòu)域是酶活所必須的JARIDIB是一個(gè)具有1544個(gè)氨基酸的蛋白，由一系列的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(見圖3A)。為了鑒定哪一個(gè)結(jié)構(gòu)域是去甲基化功能所必需的，本發(fā)明人首先鑒定了包含JmjN、Arid、PHD1、JmjC以及鋅指結(jié)構(gòu)域的N末端片段(AC)是否具有酶活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這個(gè)片段的髙表達(dá)導(dǎo)致了H3K4的三甲基、二甲基以及一甲基的丟失(見圖3B);卻對(duì)H3K9mel，H3K9me3,H3K27me3和H3K36me3的甲基化水平?jīng)]有作用(見圖7)，這些結(jié)果表明特異的酶活性是位于該蛋白的N末端，去除C末端不影響其去甲基化酶活性。為了進(jìn)一步定位哪一個(gè)結(jié)構(gòu)域是對(duì)去甲基化活性所必須的，本發(fā)明人構(gòu)建了JARID1B的被預(yù)測具有功能的結(jié)構(gòu)域缺失突變體。不同突變體蛋白(包括AJmjN，AJmjC，厶Arid,△ZF，厶C，APHD1，His499Ala)表達(dá)的Western印跡見圖3C所示。本發(fā)明人通過免疫組化方法檢測了這些突變體的體內(nèi)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JmjN，Arid，JmjC，鋅指和PHD1的缺失突變體(APHD1，AJmjN，AArid，AZF,AJmjC)喪失了去甲基化酶活性(圖3D，圖8)。這些數(shù)據(jù)表明，JmjN，Arid，JmjC，鋅指和raDl結(jié)構(gòu)域是去甲基化酶活性所必需的。所述結(jié)果也說明了JARID1B具有與其它已鑒定包含JmjC結(jié)構(gòu)域去甲基化酶活力相似的結(jié)構(gòu)必需性。實(shí)施例4JARID1B是一個(gè)鐵離子和ci酮戊二酸所依賴的加雙氧化酶為了鑒定酶的化學(xué)機(jī)制，本發(fā)明人運(yùn)用JARID1BAC片段(AC片段)進(jìn)行了體外的生化實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檫@個(gè)片段保留了特異的全酶活性。純化的JARIDIBAC片段(圖9)跟組蛋白孵育后，用免疫印跡分析來檢測對(duì)賴氨酸的去甲基作用。在各種輔因子存在的情況下，JARIDIBAC片斷能降低H3K4的三甲基、二甲基以及一甲基水平，但對(duì)H3K9的三甲基情況沒有影響(圖4A)，這些表明JARIDIB直接催化去甲基化作用，而JARIDIBAC片斷保留了特異的全酶活性。為了溯定JARIDIB是否是一個(gè)屬于Cupin超家族Fe(II)的加雙氧化酶，本發(fā)明人進(jìn)行了每次缺失一種輔因子的情況下進(jìn)行催化反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)在缺失抗壞血酸維生素C(AA)、a酮戊二酸(aKG)、Fe(II)離子或存在EDTA螯合的情況下都會(huì)導(dǎo)致酶活性的劇烈降低(圖4B)。當(dāng)用一種可以替代a酮戊二酸的酶活輔助作用的a酮戊二酸類似競爭物一一N-乙二酰甘氨酸(N-oxalylglycine)加入反應(yīng)體系中，發(fā)現(xiàn)該酶的去甲基化作用得到抑制，而且這種抑制作用是呈劑量依賴性的(圖4C)。這些數(shù)據(jù)揭示了JARIDIB是一個(gè)鐵離子和a酮戊二酸依賴的加雙氧化酶。已有研究顯示，含有JmjC結(jié)構(gòu)域的JMJD2A的晶體結(jié)構(gòu)表明酶催化活性結(jié)構(gòu)域是個(gè)具有八個(gè)e-折疊的果子凍狀(Jellyroll)的結(jié)構(gòu)，其中三個(gè)供螯合鐵離子的氨基酸殘基是保守的而且是去甲基化酶活性所必須的。在JARIDIB中對(duì)應(yīng)的這三個(gè)氨基酸殘基是His499，Glu501和His587。為了鑒定這個(gè)結(jié)構(gòu)是酶活所必須的，本發(fā)明人將His499突變成丙氨酸(His499Ala)。在轉(zhuǎn)染和沒轉(zhuǎn)染該突變體載體的細(xì)胞的H3K4me3、H3K4me2以及H3K4mel的水平均沒有變化(圖4D)，說明His499Ala是去甲基化酶活性需要的。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了JARIDIB是一個(gè)鐵離子依賴的加雙氧化酶。實(shí)施例5在前列腺痛中JARIDIB是上調(diào)的且調(diào)控了雄撖素受體的功能JARIDIB又名PLU-1，在正常成人組織中是極低表達(dá)的。本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，JARIDIB在前列腺癌中也是高表達(dá)的。本發(fā)明人搜索了包含數(shù)萬個(gè)基因芯片癌癥檔案數(shù)據(jù)的Oncomine數(shù)據(jù)庫(參見TheProceedingofNationalAcademyofSciencesUSA101:811和Neoplasia6:1)。Oncomine數(shù)據(jù)庫的分析得出，在良性前列腺增生組織中JARIDIB的表達(dá)是有限的，但在前列腺癌中是顯著上調(diào)表達(dá)的(圖5A)，其表達(dá)量在轉(zhuǎn)移型前列腺癌中更高。此外，本發(fā)明人也檢測了JARID1B在有限的前列腺冰凍組織中的表達(dá)水平，檢測到JARID1B在前列腺癌組織中是高表達(dá)的，相比較而言在良性前列腺增生組織樣品中卻檢測不到JARID1B的表達(dá)(圖5B)。這些數(shù)據(jù)提示，JARID1B與前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)聯(lián)。雄激素受體在前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展中起到了至關(guān)重要的的作用。為了檢測JARID1B是否調(diào)控了雄激素受體，本發(fā)明人運(yùn)用了常規(guī)的熒光素酶報(bào)告基因檢測法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JARID1B的轉(zhuǎn)染增強(qiáng)了雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性而且呈現(xiàn)出劑l:依賴性(圖5C)。此外，本發(fā)明人也采用免疫共沉淀的方法來檢測了JARID1B與雄激素受體在體內(nèi)是相互作用的(圖5D)。因此提示JARID1B是一個(gè)有希望的前列腺癌的治療靶點(diǎn)。實(shí)施例6JARID1A，JARID1C,JARID1D的體內(nèi)去甲基化活性由于JARID1A，JARID1C,JARID1D與JARID1B在氨基酸序列和功能結(jié)構(gòu)域非常相似，在論證了JARID1B的去甲基化功能的同時(shí)，本發(fā)明人預(yù)測JARID1A,JARID1C，JARID1D也會(huì)有與JARID1B相同的組蛋白去甲基化酶活性。為了證明本發(fā)明人的假設(shè)，把帶有Myc標(biāo)記的JARID1A，JARID1C,JARID1D載體轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞，然后運(yùn)用特異性抗H3K4三甲基(H3K4rae3)抗體通過免疫組化的方法來檢測組蛋白賴氨酸的甲基化狀況是否受到影響。在實(shí)驗(yàn)過程中，重組載體的構(gòu)建、細(xì)胞的轉(zhuǎn)染以及免疫組化等方法同前述針對(duì)JARID1B的相應(yīng)方法。與相鄰沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，外源表達(dá)的Myc-JARID1A((圖10第1行)，myc-JARID1C(圖10第2行),myc-JARID1C(圖10第3行)都導(dǎo)致了H3K4me3完全丟失。這些數(shù)據(jù)表明，JARID1A，JARID1C和JARID1D也有和JARID1B同樣的去甲基化酶活性。實(shí)旛樹7JARID1A,JARID1C,JARID1D在前列腺痛中的表達(dá)本發(fā)明人搜索了包含數(shù)萬個(gè)基因芯片癌癥檔案數(shù)據(jù)的Oncomine數(shù)據(jù)庫(參見TheProceedingofNationalAcademyofSciencesUSA101:811和Neoplasia6:1)。Oncomine數(shù)據(jù)庫的分析得出，在良性前列腺增生組織中JARIDIA和JARID1C的表達(dá)是有限的，在前列腺癌中也是有限的(圖11)，但其表達(dá)量在轉(zhuǎn)移型前列腺癌中明顯升高。相反，JARID1D在良性前列腺增生組織有一定的表達(dá)，但隨著痛癥的發(fā)展，其表達(dá)明顯的下調(diào)。上述結(jié)果提示，JARID1A，JARID1C，JARID1D與癌癥的發(fā)生和發(fā)展是有關(guān)聯(lián)的。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>—種和痛癥有關(guān)的組蛋白去甲基化酶及其應(yīng)用<130>070766<160>12<170>Patentlnversion3.3<210>1<211〉17<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc_feature<223>引物<400〉1gtacatgaccttacggg17<210>2<211〉30<212〉DM<213>人工序列<220><221>misc_feature<223〉引物<400〉2atagcggccgctcgggtggaggcaggaact30<210〉3<211〉29<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc_feature<223>引物一<400>3ataggatccgacatacaggtccacagcat29<210〉4<211〉29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400〉4ataggatcctgtttggctcaggaatgtag29<210〉5<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220><221>miscfeature<223>引物<400>5gcagaagttaacagcctcag<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>miscfeature<223>引物<400>6atacaaccaaggaagtttc<210><211>35<212>DNA<213>人工序列<220〉<221〉miscfeature<223>引物<400>tcaattgcccaacag幼tga<210>8<211〉25<212>DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature201935<223>引物<400>8ttgggcaattg幼gaccactggagc25<210>9<211>20<212>■<213〉人工序列<220><221>aiisc_feature<223〉引物<400〉9gcagaagttaacagcctcag<210>10<211>29<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400〉10ataggatccatggaggcggccaccacact<210>11<211>28<212〉■<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400>11atactcgagaagcttc幼tgcattcatc<210>12〈211〉1544<212〉PRT<213〉智人(Homosapiens)<400>12MetiGluAlaAlaThrThrLeuHisProiLeuGlyGlyProGlyProLeuGlyGlu2025ProValPheGluProSerTrpGluGlu3540lieHisLyslieArgProlieAlaGlu5055ArgProProProAspTrpGinProPro6570LeuHisPheThrProArglieGinArg85ThrArgValLysLeuAsnPheLeuAsp100105LeuGinGlySerThrLeuLysliePro115120AspLeuPheGinLeuAsnLysLeuVal130135ValValCysLysAspArgLysTrpThr145150PheAlaProGlyLysAlaValGlySer165ArglieL的AsnProTyrAsnLeuPhe1801852928GlyProArgProAlaLeuPro1015PheLeuProProProGluCys30PheAlaAspProPheAlaPhe45GinThrGlylieCysLysVal60PheAlaCysAspValAspLys7580LeuAsnGluLeuGluAlaGin9095GinlieAlaLysTyrTrpGlu110HisValGluArgLyslieLeu125AlaGluGluGlyGlyPheAla140LyslieAlaThrLysMetGly155160HislieArgGlyHisTyrGlu170175LeuSerGlyAspSerLeuArg190CysLeuGinLysProAsnLeuThrThrAspThrLysAspLysGluTyr195200205LysProHisAsplieProGinArgGinSerYalGinProSerGluThr210215220CysProProAlaArgArgAlaLysArgMetArgAlaGluAlaMetAsn225230235240lieLyslieGluProGluGluThrThrGluAlaArgThrHisAsnLeu245250255ArgArgArgMetGlyCysProThrProLysCysGluAsnGluLysGlu260265270MetLysSerSerlieLysGinGluProlieGluArgLysAspTyrlie275280285ValGluAsnGluLysGluLysProLysSerArgSerLysLysAlaThr2902.95300AsnAlaValAspLeuTyrValCysLeuLeuCysGlySerGlyAsnAsp305310315320GluAspArgLeuLeuLeuCysAspGlyCysAspAspSerTyrHisThr325330335PheCysLeulieProProLeuHisAspValProLysGlyAspTrpArg340345350CysProLysCysLeuAlaGinGluCysSerLysProGinGluAlaPhe355360365GlyPheGluGinAlaAlaArgAspTyrThrLeuArgThrPheGlyGlu370375380MetAlaAspAlaPheLysSerAspTyrPheAsnMetProValHisMet385390395400ValProThrGluLeuValGluLysGluPheTrpArgLeuValSerThr405410415lieGluGluAspValThrValGluTyrGlyAlaAsplieAlaSerLys420425430GluPheGlySerGlyPheProValArgAspGlyLyslieLysLeuSer435440445ProGluGluGkiGluTyrLeuAspSerGlyTrpAsnLeuAsnAsnMet450455460ProValMetGluGinSerValLeuAlaHislieThrAlaAsplieCys465470475480GlyMetLysLeuProTrpLeuTyrValGlyMetCysPheSerSerPhe4肪柳495CysTrpHislieGluAspHisTrpSerTyrSerlieAsnTyrLeuHis500505510TrpGlyGluProLysThrTrpTyrGlyValProGlyTyrAlaAlaGlu515520525GinLeuGluAsnValMetLysLysLeuAlaProGluLeuPheValSer530535540GinProAspLeuLeuHisGinLeuValThrlieMetAsnProAsnThr550555560LeuMetThrHisGluValProValTyrArgThrAsnGinCysAlaGly565570575GluPheVallieThrPheProArgAlaTyrHisSerGlyPheAsnGin580585590GlyPheAsnPheAlaGluAlaValAsnPheCysThrValAspTrpLeu595600605ProLeuGlyArgGinCysValGluHisTyrArgLeuLeuHisArgTyr610615620CysValPheSerHisAspGluMetlieCysLysMetAlaSerLysAla625630635640AspValLeuAspValValValAlaSerThrValGinLysAspMetAla645650655lieMetlieGluAspGluLysAlaLeuArgGluThrValArgLysLeu26660665670GlyVallieAspSerGluArgMetAspPheGluLeuLeuProAspAsp675680685GluArgGinCysValLysCysLysThrThrCysPheMetSerAlalie690695700SerCysSerCysLysProGlyLeuLeuValCysLeuHisHisValLys705710715720GluLeuCysSerCysProProTyrLysTyrLysLeuArgTyrArgTyr725730735ThrLeuAspAspLeuTyrProMetMetAsnAlaLeuLysLeuArgAla740745750GluSerTyrAsnGluTrpAlaleuAsnValAsnGluAlaLeuGluAla755760765LyslieAsnLysLysLysSerLeuValSerPheLysAlaLeulieGlu770775780GluSerGluMetLysLysPheProAspAsnAspLeuLeuArgHisLeu785790795800ArgLeuValThrGinAspAlaGluLysCysAlaSerValAlaGinGin805810815LeuLeuAsnGlyLysArgGinThrArgTyrArgSerGlyGlyGlyLys咖825830SerGinAsnGinLeuThrValAsnGluLeuArgGinPheValThrGin835840845LeuTyrAlaLeuProCysValLeuSerGinThrProleuLeuLysAsp850855860LeuLeuAsnArgValGluAspPheGinGinHisSerGinLysLeuLeu865870875880SerGluGluThrProSerAlaAlaGluLeuGinAspLeuLeuAspVal.885890895SerPheGluPheAspValGluLeuProGinLeuAlaGluMetArglie900905910ArgLeuGluGinAlaArgTrpLeuGluGluValGinGinAlaCysLeu915920925AspProSerSerLeuThrLeuAspAspMetArgArgLeulieAspLeu930935940GlyValGlyLeuAlaProTyrSerAlaValGluLysAlaMetAlaArg945950955960LeuGinGluLeuLeuThrValSerGluHisTrpAspAspLysAlaLys965970975SerLeuLeuLysAlaArgProArgHisSerLeuAsnSerLeuAlaThr980985990AlaValLysGlulieGluGlulieProAlaTyrLeuProAsnGlyAla99510001005AlaLeu1010LysAspSerValGin1015ArgAlaArgAspTrp1020LeuGinAspValGlu1025GlyLeuGinAlaGly1030GlyArgValProVal1035LeuAspThrLeulie1040GluLeuValThrArg1045GlyArgSerliePro1050ValHisLeuAsnSer1055LeuProArgLeuGlu1060ThrLeuValAlaGlu1065ValGinAlaTrpLys腦GluCysAlaValAsn1075ThrPheLeuThrGlu1080AsnSerProTyrSer1085LeuUuGluValLeu1090CysProArgCysAsp1095lieGlyUuLeuGly1100LeuLysArgLysGin1105ArgLysLeuLysGlu1110ProLeuProAsnGly1115LysLysLysSerThr1120LysLeuGluSerLeu1125SerAspLeuGluArg1130AlaLeuThrGluSer1135LysGluThrAlaSer1140AlaMetAlaThrLeu1145GlyGluAlaArgLeu固ArgGluMetGluAla1155LeuGinSerLeuArg1160L<euAlaAsnGluGly1165LysLeuLeuSerPro1170LeuGinAspValAsp1175lieLyslieCysLeu腦CysGinLysAlaPro1185AlaAlaProMetliell恥GinCysGluLeuCys1195ArgAspAlaPheHis1200ThrSerCysValAla1205ValProSerlieSer1210GinGlyLeuArglie1215TrpLeuCysProHis1220CysArgArgSerGlu1225LysProProLeuGlu1230LyslieLeuProLeu1235LeuAlaSerLeuGin1240ArglieArgValArg1245LeuProGluGlyAsp1250AlaLeuArgTyrMet1255lieGluArgThrVal1260AsnTrpGinHisArg1265AlaGinGinLeuLeu1270SerSerGlyAsnLeu1275LysPheValGinAsp1280ArgValGlySerGly1285LeuLeuTyrSerArg1290TrpGinAlaSerAla1295GlyGinValSerAsp薦ThrAsnLysValSer1305GinProProGlyThr1310ThrSerPheSerLeu1315ProAspAspTrpAsp1320AsnArgThrSerTyr1325LeuHisSerProPhe1330SerThrGlyArgSer1335CyslieProLeuHis1340GlyValSerProGlu1345ValAsnGluLeuLeu1350MetGluAlaGinLeu1355LeuGinValSerLeu1360ProGlulieGinGlu1365LeuTyrGinThrLeu1370LeuAlaLysProSer1375ProAlaGinGinThr1380AspArgSerSerPro1385ValArgProSerSer1390GluLysAsnAspCys1395CysArgGlyLysArg1400AspGlylieAsnSer1405LeuGluArgLysLeu1410LysArgArgLeuGlu1415ArgGluGlyLeuSer1420SerGluArgTrpGlu1425ArgValLysLysMet1430ArgThrProLysLys1435LysLyslieLysLeu1440SerHisProLysAsp1445M6tAsnAsnPheLys1450LeuGluArgGluArg1455SerTyrGluLeuVal函ArgSerAlaGluThr1465HisSerLeuProSer1470AspThrSerTyrSer1475GluGinGluAspSer1480GluAspGluAspAla1485lieCysProAlaVal1490SerCysLeuGinPro1495、GluGlyAspGluVal1500AspTrpValGinCys1505AspGlySerCysAsn1510GinTrpPheHisGin1515ValCysValGlyVal1520SerProGluMetAla1525GluLysGluAspTyr1530lieCysValArgCys1535ThrValAspAla1540ProSerArgLys權(quán)利要求1.一種JARID1蛋白或其活性片段或活性衍生物的用途，其特征在于，用作去甲基化酶或用于制備去甲基化酶制劑組合物。2.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的JARID1蛋白選自JARID1A蛋白，JARID1B蛋白，JARID1C蛋白，或JARID1D蛋白。3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的去甲基化酶去除甲基化的組蛋白亞基3第4位賴氨酸上的甲基。4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的甲基化的組蛋白亞基3第4位賴氨酸上含有1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)甲基。5.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的組蛋白亞基3第4位賴氨酸的甲基化導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄異常。6.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的JARID1蛋白的活性片段或活性衍生物包含JARIDl的JmjC結(jié)構(gòu)域，Arid結(jié)構(gòu)域，JmjN結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)域，和PHD結(jié)構(gòu)域。7.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的制劑組合物中還包括-抗壞血酸維生素C,ci酮戊二酸，和二價(jià)鐵離子。8.—種去甲基化酶制劑組合物，其特征在于，所述組合物含有(a)有效Jt的JARIDl蛋白；(b)有效量的抗壞血酸維生素C,ci酮戊二酸，和二價(jià)鐵離子；和(c)生物學(xué)上相容的載體。9.一種JARID1蛋白及其活性片段或活性衍生物、或它們的激動(dòng)劑或拮抗劑的用途，其特征在于，用于制備調(diào)控雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性的制劑；或用于制備預(yù)防或治療癌癥的藥物。10.—種JARID1蛋白的用途，其特征在于，用于制備檢測癌癥的制劑或試劑盒。全文摘要本發(fā)明公開了一種JARID1蛋白(包括JARID1A，JARID1B，JARID1C和JARID1D)的用途，用作去甲基化酶或用于制備去甲基化酶制劑組合物；用于制備調(diào)控雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性的制劑；或用于制備檢測癌癥或雄激素受體的試劑盒；或用于設(shè)計(jì)和制備癌癥治療藥物。本發(fā)明首次揭示JARID1蛋白是一種去甲基化酶，可去除三甲基化、二甲基化或單甲基化H3K4上的甲基，并且與癌癥密切相關(guān)。文檔編號(hào)G01N33/68GK101239181SQ20071003732公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2007年2月8日優(yōu)先權(quán)日2007年2月8日發(fā)明者陳德桂,陽項(xiàng)申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院