專利名稱：三七皂苷體內(nèi)五種活性成分的同時(shí)定量分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三七總皂苷中微量物質(zhì)的分析技術(shù)，尤其是同時(shí)對(duì)這些微量物質(zhì)進(jìn)行定量分 析并用于藥代動(dòng)力學(xué)研究的技術(shù)。
背景技術(shù)：
眾所周知，由于中藥(單方或復(fù)方)成份的復(fù)雜性、各成分含量差異較大、成份之間存 在復(fù)雜的相互作用，給中藥血藥濃度的監(jiān)測(cè)及藥代動(dòng)力學(xué)研究帶來(lái)很大的困難。三七總皂苷 是多組份中藥中的典型代表，文獻(xiàn)報(bào)道三七總皂苷中所含的皂苷類成份多達(dá)60多種"，最近 幾年來(lái)國(guó)內(nèi)有些學(xué)者開展了三七皂苷及其不同制劑的含量測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究，但多數(shù)是
借助高效液相色譜儀對(duì)單一皂苷成分如Rgl或Rbl進(jìn)行研究P"41。由于皂苷類成份的低紫外吸 收使得現(xiàn)有研究方法靈敏度極低沒法滿足生物樣品的測(cè)定要求41。使得三七總皂苷在機(jī)體內(nèi) 的藥代動(dòng)力學(xué)研究受到很大的限制。
研究?jī)?nèi)容
根究三七總皂苷的研究現(xiàn)狀，為更好地評(píng)價(jià)三七總皂苷的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征，本發(fā)明建立 了一種高靈敏度的高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)分析方法,不僅克服了傳統(tǒng)分析方 法中由于皂苷類物質(zhì)低紫外吸收帶來(lái)的低靈敏度分析技術(shù)問(wèn)題，而且還對(duì)多種微量的皂苷類 成份進(jìn)行了定量分析，為三七總皂苷在機(jī)體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究提供了研究基礎(chǔ)，也為中藥多組 份同時(shí)定量分析提供了技術(shù)參考。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是采用正丁醇液-液萃取方法對(duì)血漿樣品進(jìn)行 處理；建立血漿樣品中三七皂苷R1、 Rgl、 Rd、 Re和Rbl同時(shí)測(cè)定的色譜條件為色譜柱 Luna-ds柱，150x2.0mm(ID.)， 5pm(Phenomenex， USA)，柱溫40°C;流動(dòng)相水相(A相)， 0.5mM的氯化銨溶液；有機(jī)相(B相)，乙腈，梯度洗脫，流速為0.2mli;1。質(zhì)譜條件為干 燥氣(氮?dú)?流速為1.5LmirT、曲型脫溶劑裝置(CDL)溫度為250°C;加熱塊(Block)'C為200°C; 檢測(cè)器電壓為1.6kV;探針(probe)電壓為4.5kV;裂解器電壓為-70V。離子化方式電噴霧離 子化，負(fù)離子方式；選擇性離子(SIM)檢測(cè)各成份荷-質(zhì)(m/z)比分別為967.75、 835.40、 981.80、 981.80和1143.65。在上述條件基礎(chǔ)上對(duì)三七總皂苷在血漿樣品中的專屬性、線性 關(guān)系、回收率、日內(nèi)(間)差、穩(wěn)定性和最低定量限進(jìn)行了考察，并利用所建立的方法進(jìn)行了 體內(nèi)三七總皂苷的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
本發(fā)明的有益效果是同時(shí)對(duì)血漿中三七皂苷R1、 Rgl、 Rd、 Re和Rbl進(jìn)行定量分析， 方法可靠、簡(jiǎn)便，分析時(shí)間短，為三七總皂苷的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了分析技術(shù)保障，也為
中藥多組份定量分析研究提供了技術(shù)上的參考。
具體實(shí)施例方式
1、含三七總皂苷血漿100W，精密加入濃度為500ngml^的內(nèi)標(biāo)地高辛溶液10.0^1，漩
渦混勻器上混勻30s，加入l.Oml的水飽和正丁醇，繼續(xù)混勻3min，將混勻物置于離心機(jī)中，
8000rpm離心5min，取上層有機(jī)相0.8ml至干凈的Eppendorf管中，真空減壓濃縮干燥器上
將有機(jī)相正丁醇揮干，殘?jiān)尤?00.0^1甲醇，漩渦器上震蕩融解2min，將溶解液置于高速
低溫冰箱中22000rpm離心10min，取上清液10.0^1上清液注入HPLC-MS儀進(jìn)行分析。
2、分析的色譜條件如下色譜柱Luna-ds柱，150x2.0mm(ID.)， 5/im(Phenomenex, USA)，
柱溫4(TC;流動(dòng)相水相(A相)，0.5mM的氯化銨溶液；有機(jī)相(B相)，乙腈。梯度洗脫程
序見下表，流速為0.2mlU1。
時(shí)間(分鐘) ^ Sl
3、分析的質(zhì)譜條件如下島津2010型LC-MS電噴霧離子源參數(shù)如下干燥氣(氮?dú)?流 速為1.5Lmin人曲型脫溶劑裝置(CDL)溫度為250°C;加熱塊(Block)"C為200°C;檢測(cè)器電 壓為1.6kV;探針(probe)電壓為4.5kV;裂解器電壓為-70V。離子化方式電噴霧離子化，負(fù) 離子方式；選擇性離子(SIM)檢測(cè)各成份荷-質(zhì)(m/z)比分別為967.75、 835.40、 981.80、 981. 80和1143.65。
4對(duì)三七總皂苷在血漿樣品中的專屬性、線性、回收率、日內(nèi)(間)差、穩(wěn)定性和最低定 量限進(jìn)行分析
專屬性取空白血漿和含三七總皂苷的血漿，按實(shí)施方式1方法處理血漿樣品，在上述 色譜和質(zhì)譜條件下分析生物樣品，觀察血槳內(nèi)源性物質(zhì)是否干擾樣品峰的出現(xiàn)。
線性取1.5ml的Eppendorf管，加入90^1的空白血漿，精密吸取10.0^1的各皂苷混合 工作液，配成含三七皂苷Rl濃度為775.00、 387.50、 96.88、 48.44、 24.22、 12.11、 6.06和3.03 ngmL1; Rgl、 Rd、 Re濃度為1025.00、 512.52、 128.13、 64.06、 32.03、 16.02、 8.01、 4.00 ng mi;1; Rbl濃度為710.00、 355.00、 88.75、 44.38、 22.19、 11.09、 5.55、 2,77 ng mU1的標(biāo)準(zhǔn) 濃度血槳，漩渦混勻30s，按實(shí)施方式l方法處理血漿樣品，同時(shí)測(cè)定上述五種物質(zhì)，以三七 皂苷Rl、 Rgl、 Rd、 Re、 Rbl的標(biāo)準(zhǔn)濃度(C)為橫坐標(biāo)，三七皂苷Rl、 Rgl、 Rd、 Re、 Rbl 與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(y^^/A')為縱坐標(biāo)，按1"2權(quán)重進(jìn)行線性回歸，考察5只空白血漿的線性。
4
0.03 1.5 2.03 3.5 4.0 5.0 6.2 10.0
25% 45% 90% 90% 1
25% 0 0
M隨g儲(chǔ)換M換止
杉杉杉秒刀秒刀.？
有有有有哲有哲俜
泵泵泵泵g泵雄泵
回收率取1.5ml的Eppendorf管，加入90/^1的空白血漿，精密吸取lO.O;d的各皂苷混 合工作液，配成含三七皂苷Rl濃度為387.50、 96.88、 12.11 ng mU1; Rgl、 Rd、 Re濃度為 512.52、 128.13、 16.02ngmL"; Rbl濃度為355-00、 88.75、 11.09ngmi;1的高、中、低三種 不同濃度的血漿樣品各5份，按實(shí)施方式1方法處理血漿樣品，取上清液10.0 #1注入 HPLC/ESI/MS儀，同時(shí)測(cè)定上述五種物質(zhì)，計(jì)算三七皂苷R1、 Rgl、 Rd、 Re和Rbl與內(nèi)標(biāo) 地高辛峰面積的比值(Aso/Aio);
另取1.5ml的Eppendorf管，精密量取不同量的三七皂苷Rl、人參皂苷Rgl、 Rd、 Re和 Rbl對(duì)照品系列工作液，甲醇分別配制含三七皂苷R1濃度為387.50、 96.88、 12.11 ngmL—1; Rgl、 Rd、 Re濃度為512.52、 128.13、 16.02ng mL1; Rbl濃度為355.00、 88.75、 11.09 ng mL懇1 的高、中、低三種不同濃度的血漿樣品各5份，按實(shí)施方式1方法處理血漿樣品，取上清液 10.0/il注入HPLC/ESI/MS儀，同時(shí)測(cè)定上述五種物質(zhì)，計(jì)算三七皂苷R1、人參皂苷Rgl、 Rd、 Re和Rbl與內(nèi)標(biāo)地高辛峰面積的比值(ASi/AiO，按下式計(jì)算樣品提取回收率，
-x 100%
日內(nèi)(間)差按線性操作方法，配制含三七皂苷Rl濃度為387.50、 96.88、 12.11 ngmL—1; Rgl、 Rd、 Re濃度為512.50、 128.13、 16.02ngmi;、 Rbl濃度為355.00、 88.75、 11.09 ngmi;1 的高、中、低三種不同濃度的樣品進(jìn)行測(cè)定， 一天內(nèi)每個(gè)濃度各測(cè)定5次，分別以化E免和 C.V免表示日內(nèi)方法的準(zhǔn)確度和精密度；按上述方法操作，每天將三七皂苷Rl、 Rgl、 Rd、 Re禾卩Rbl的高、中、低三種不同濃度的血漿樣品各做5份，同時(shí)測(cè)定上述五種物質(zhì)，連續(xù)3 天分別以R.E免和C.V免表示日間方法的準(zhǔn)確度和精密度。
穩(wěn)定性配制與日內(nèi)(間)差相同濃度的樣品，在上述條件下測(cè)定，分別進(jìn)行三七皂苷R1、 Rgl、 Rd、 Re和Rbl在室溫12h、 -20°〇存放4周、-2(TC凍溶3次及4°C自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)放置時(shí) 的穩(wěn)定性考察。
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權(quán)利要求
1、一種血漿中三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re和Rb1同時(shí)定量分析方法，包括上述五種物質(zhì)的提取方法，色譜和質(zhì)譜參數(shù)，方法學(xué)的考察，藥代動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用。其特征為正丁醇液-液萃取血漿樣品中的三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re和Rb1，建立相應(yīng)的色譜和質(zhì)譜方法，對(duì)上述樣品在血漿中的專屬性、線性、回收率、日內(nèi)(間)差、穩(wěn)定性和最低定量限進(jìn)行考察并用于體內(nèi)三七總皂苷的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
全文摘要
建立了同時(shí)定量分析血漿樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rd、Re和Rb1的高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用分析技術(shù)方法。正丁醇提取血漿樣品，色譜柱為L(zhǎng)una-C18柱(150×2.0mm，5μm)，柱溫40℃，流動(dòng)相由乙腈和0.5mM的氯化銨組成；流速為0.2ml/min，乙腈按如下比例進(jìn)行梯度洗脫0.03min∶25％；1.5min∶45％；2.03-3.5min∶90min；4.0-10.0min∶25％；10.03∶stop。島津2010LC-MS對(duì)上述五種物質(zhì)檢測(cè)的荷-質(zhì)(m/z)比分別為967.75、835.40、981.80、981.80和1143.65。在上述條件下五種物質(zhì)的最低定量限分別為3.03、4.00、4.00、4.00和2.77ng/ml，所建立的方法專屬性好，靈敏度高，適用于血漿樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rd、Re和Rb1的藥代動(dòng)力學(xué)研究，解決了中藥多組份同時(shí)定量分析的技術(shù)難點(diǎn)，為多組份中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了新的思路。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101354382SQ20071002532
公開日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2007年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月24日
發(fā)明者孫建國(guó), 李曉宇, 燕 梁, 王廣基, 林 謝, 郝海平 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)