專利名稱：雙鏈dna量的測定方法以及用于測定的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及以簡單和容易的方式精確地電化學測定試樣中的雙鏈 DNA含量的方法以及用上述測定方法測定雙鏈DNA量的試劑盒。當生命活 動在分子化學水平上為人們所了解并且應用于醫(yī)學科學、農(nóng)業(yè)等的技術 t艮時，越來越需要測定雙鏈DNA量的有效方法和測定用的試劑盒。
背景技術：
迄今，測定DNA的極大重點放在了檢測具有特定核苷酸序列的DM 上，而實際上很少將努力放在用簡單和容易的方式精確地測定試樣中雙 鏈DNA量的技術的M上。
盡管紫外區(qū)中的吸光度比率(260/280nm)常常用于DM的簡單測定， 但是它極大地受雜質和雙鏈DNA以外的核酸成分的影響，因此測定雙鏈 DNA的精度低。
同時，測定雙鏈DNA的方法通常只不過是測定能夠與雙鏈DNA特定 結合的物質的熒光強度變化的那些方法。然而，它們的問題在于其背景 高并且可測定的濃度范圍窄，因此使測量數(shù)據(jù)的處理變得復雜。
除了這些常規(guī)的簡單測定方法以外，已經(jīng)開發(fā)出利用電化學技術測 定雙鏈DNA的方法。例如，存在的一種方法是其中向雙鏈DM增補能夠 與雙鏈DM特定結合的物質以便檢測雙鏈DNA與該雙鏈DNA結合物質的 復合物的電化學行為，以及一種方法是其中電化學測定沒有與雙鏈DM 結合的殘余雙鏈DM結合物質的量(例如參見專利文獻1和2 )。
根據(jù)專利文獻1中公開的方法，將過量的雙鏈DNA結合物質加入到 含雙鏈DNA的試樣中，然后測定沒有與雙鏈DNA結合的游離DNA結合物 質的電極氧化電流的量以便得到雙鏈DNA的量。該方法要求高水平的電 極制造技術，因為該電極必須始終精確地保持其表面積不變以便檢測微弱的氧化電流。
根據(jù)專利文獻2中公開的方法，為了在電極上放大微弱的氧化電流， 使用固定化酶電極。然而，該方法仍然要求高水平的電極制造技術，而 且仍然存在的問題是它要求試樣溶液具有復雜的組成，因為由固定化酶 催化的氧化-還原反應必須與另一反應共軛以便反應可逆地進行。
專利文獻l:特開2002-218998號乂>凈艮
專利文獻2:特開2004-257993號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題
考慮到上述情況，本發(fā)明的目的在于提供一種電化學測定雙鏈DNA 量的方法，該方法簡單和容易而且精確度優(yōu)異但是不需要任何昂貴的測 量電極例如固定化酶電極或者制造精確保持其表面積均一的電極的任何 高水平技術，本發(fā)明的目的也在于提供釆用上述方法的測定用試劑盒。
解決問題的手段
作為勤勉研究以解決電化學測定方法中的上述問題的結果，本發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)以下現(xiàn)象在含有特定緩沖物質的溶液中測定的某些雙鏈DNA結 合物質的電位-電流曲線的氧化波的電位(即氧化波電位)根據(jù)該雙鏈DM 結合物質的濃度而變化，從而完成本發(fā)明。
換句話說，本發(fā)明涉及如下列(1)至(10)中所述的基于測定的氧 化波電位的變化來電化學測定雙鏈DM量的方法以及用所述測定方法測 定雙鏈DNA量的試劑盒，其中通過使雙鏈DNA和能夠與該雙鏈DNA結合 的物質(即雙鏈DNA結合物質)反應然后電化學測^X應溶液中游離的 雙鏈DNA結合物質的殘余量來測定雙鏈DM量，其特征在于向反應溶液 中加入緩沖物質，所述緩沖物質具有如下性質允許在含有該緩沖物質 的溶液中測定的雙鏈DNA結合物質的電位-電流曲線的氧化波電位才艮據(jù)溶 液中雙鏈DM結合物質的濃度而變化。
(1) 一種電化學測定雙鏈DNA量的方法，其包括向含有雙鏈DM的溶液中相對所述雙鏈DNA過量加入能夠與該雙鏈DNA結合的物質以便相 互反應，然后電化學測定沒有與雙鏈DNA結合的游離雙鏈DNA結合物質 的殘余量以便測定所述反應溶液中雙鏈DNA的含量，其中所述反應溶液 包含具有以下性質的物質作為緩沖物質允許在含有所述緩沖物質的反 應溶液中測定的雙鏈DM結合物質的電位-電流曲線的氧化波電位根據(jù)反 應溶液中游離雙鏈DNA結合物質的濃度而變化。
(2 )根據(jù)(1)的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述緩沖物 質是具有以下性質的物質允許在含有該緩沖物質的反應溶液中測定的 雙鏈DNA結合物質的電位-電流曲線的氧化波電位隨著反應溶液中游離雙 鏈DNA結合物質濃度的降低而向較低電位移動。
(3 )根據(jù)(1)的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述緩沖物 質是具有以下性質的物質允許在含有該緩沖物質的反應溶液中測定的 雙鏈DM結合物質的電位-電流曲線的氧化波電位具有兩個或更多個峰并 且允許所述峰中的兩個之間的電位差隨著反應溶液中游離雙鏈DNA結合 物質濃度的降低而減小。
(4)根據(jù)(1)的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述緩沖物 質是烷基磺酸衍生物。
(5 )根據(jù)(4 )的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述烷基磺 酸衍生物是選自3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)和N-三(羥甲基)甲基-3-絲 丙磺酸(TAPS)中的一種或多種。
(6 )才艮據(jù)(1)的電化學測定雙鏈DM量的方法，其中所述能夠與 雙鏈DNA結合的物質是雙鏈DNA的嵌入劑。
(7 )根據(jù)(6 )的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述嵌入劑 是吖哽衍生物。
(8)根據(jù)(7)的電化學測定雙鏈DM量的方法，其中所述吖咬衍 生物是9-氨基吖啶。
(9 )根據(jù)(1)的測定雙鏈DM量的方法，其中所述雙鏈DNA由RNA 的逆轉錄反應制成。
(10 )用根據(jù)(1)至(9 )任一項的電化學測定雙鏈DNA量的方法測定雙鏈DNA量的試劑盒。 發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，能夠以簡單和容易的方式精確地電化學測定雙鏈DNA 量而無需任何昂貴的測量電極例如固定化酶電極或者制造精確保持表面 積均一的電極的任何高水平技術。
本發(fā)明的最佳實施方式
用于本發(fā)明的緩沖物質可以是具有以下性質的物質允許在含有該 緩沖物質的反應溶液中測定的雙鏈DNA結合物質的電位-電流曲線的氧化 波電位根據(jù)反應溶液中游離雙鏈DNA結合物質的濃度而變化。特別優(yōu)選 地，該緩沖物質是具有以下性質的物質允許所述氧化波電位隨著該雙 鏈DNA結合物質濃度的降低而向較低電位移動。
具有上述性質的緩沖物質優(yōu)選是烷基磺酸衍生物，特別優(yōu)選3-嗎啉 基丙磺酸(以下簡寫成"MOPS")或N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(以 下簡寫成"TAPS")。
試樣中所含DM的:f和種類而變^匕。用于試樣中的濃度只是必須與預先 用于制備校準曲線的濃度相同，在生物化學研究或檢驗中通常采用的濃 度(適宜地1-200 mM)下可以令人滿意地進行測定。
用于本發(fā)明的能夠與雙鏈DNA結合的物質可以與雙鏈DNA以任何方 式結合，且優(yōu)選是可以嵌入雙鏈DNA中的嵌入劑。作為這樣的嵌入劑， 例如，適宜地使用吖咬衍生物例如9-氨基吖啶、3，6-二(二甲^JJ吖咬 和3，6-二M-2，7-二甲基吖啶。其中，尤其更適宜地使用9-氨基吖咬 (以下簡寫成"9AA")。
用于本發(fā)明的能夠與雙鏈DNA結合的物質的量應當相對于溶液中所 含的雙鏈DNA過量。例如，當吖咬衍生物9AA等用來與雙鏈DNA合并時， 沒有與雙鏈DNA結合的殘余游離雙鏈DM結合物質的濃度優(yōu)選為1-500 juM，更優(yōu)選10-200 pM。在本發(fā)明中，"游離的雙鏈DNA結合物質"是指在溶液中實質上沒有與雙鏈DNA結合的雙鏈DNA結合物質。
可以由本發(fā)明的方法電化學測定的雙鏈DNA包括例如以游離形式 存在于溶液中的一般的雙鏈DM，由栽體固定的單鏈探針DM和具有互補 核苷酸序列的試樣DNA形成的雙鏈DNA,以及由RNA病毒(例如SRSV) 的RNA、 mRNA、 rRNA等逆轉錄的cDNA制成的雙鏈DNA?？梢粤钊藵M意地 采用任何雙鏈DNA。
在本發(fā)明中，氧化波電位的變化是指例如相對于銀參比電極為約 5 V電位的氧化波以依賴9AA濃度的方式變化的現(xiàn)象。更具體地，它 是當9AA濃度降低時氧化波電位向較低電位移動的現(xiàn)象。認為9AA的這 種現(xiàn)象是包括9AA分子間的堆疊現(xiàn)象、與緩沖物質的相互作用以及在電 ^面上擴散在內(nèi)的濃度依賴現(xiàn)象的總和。
在本發(fā)明中，氧化波電位受有待測定的試樣溶液的組成影響；然而， 可以通過在包含有待用于測定的雙鏈DNA結合物質和緩沖物質的體系中 預先作出雙鏈DNA量相對于氧化波電位變化的校準曲線來令人滿意地測 定雙鏈DNA的量。氧化波顯示為電位-電流曲線的電流值的峰。對應于該 峰頂點的電位可以看作是氧化波電位。然而，從測定精度的觀點來看， 優(yōu)選將對應于選自該峰電流值50-90%范圍內(nèi)的特定電流值的電位用作氧 化波電位。當使用在氧化波中顯示出兩個或更多個峰的物質、例如9AA 時，優(yōu)選將這些峰中以最依賴濃度的方式變化的峰電位用作氧化波電位。 在這種情況下，可以通過測量兩個峰之間電位的差值并且利用該差值的 變化來測定雙鏈DNA的量。
作為用于本發(fā)明的電化學測定的工作電極，可以適宜地使用貴金屬 電極例如金電極、濺射金的電極和鉑電極。作為參比電極，可以使用銀 電極、銀-氯化銀電極和其它電極，只要其電位在測定過程中穩(wěn)定即可。 諸如金、鉑、不銹鋼和碳的材料用于對電極，也可以令人滿意地使用其 它導電材料。
可以將常用的電化學技術用于根據(jù)本發(fā)明的雙鏈DNA結合物質量的 電化學測定。對其沒有特別限制只要可以基于電位和電流間的關系測定 雙鏈DNA結合物質的氧化波電位即可。作為根據(jù)本發(fā)明的電化學測定，可以使用循環(huán)伏安法(以下簡寫成
"CV")、線性掃描伏安法(以下簡寫成"LSV")和其它電化學測定， 由此可以基于雙鏈DNA結合物質氧化波電位的變化來定量測定雙鏈DM 的量。
根據(jù)本發(fā)明的測定的溫度范圍是OX:-85匸，在該溫度范圍內(nèi)DNA的 雙鏈結構得以保持并且雙鏈DNA結合物質與雙鏈DNA的結合狀態(tài)得以保 持。然而， 一般期望在410-45"的溫度下進行測定以便防止由于水分蒸 發(fā)而引起的濃度變化、低溫下凍結以及因而的對測定試樣的破壞。
根據(jù)本發(fā)明，可以通過例如下列過程測定試樣中所含雙鏈DNA的量 用含有選自MOPS和TAPS的一種或多種的緩沖溶液稀釋含有未知量雙鏈 DNA的試樣；加入恒定且過度量的9AA;在其中直接插入由工作電極、對 電極和參比電極組成的測量電極；以及電化學測定沒有與雙鏈DNA結合 的游離9AA。
如下舉例說明本發(fā)明的具體過程用pH 8. 5的10 mM TAPS和50 mM KC1緩沖溶液制備已知雙鏈DNA濃度(例如，0-50 ng/ jn L)的DNA溶液； 加入恒定且過度量(例如，相當于50 nM)的9AA;插入三個電極，即 作為工作電極和對電極的金電極以及作為參比電極的銀電極；進行CV或 LSV。在該實例中，由于當銀電極用作參比電極時通過向測定溶液中加入 氯離子使銀電位更加穩(wěn)定化，因此加入KC1。然而，如果使用穩(wěn)定的電極， 則不必加入KC1。
在CV中，以500 mV/s或更小的掃描速率從自然電位進行掃描至相 對參比電極電位為-2V，然后立即以相同速率掃描直至相對參比電極為 2V。如果電極的自然電位穩(wěn)定，可以進行LSV測定，其中以500 mV/s或 更小的掃描速率從自然電位進行掃描至相對參比電極為2V。
在這種情況下，測定氧化波的峰電位。在水分解的電流曲線上相對 銀參比電極電位為IV-1. 6V處檢測氧化波。可以測量峰頂點作為氧化波 的峰電位；然而，由于它可能受緩沖溶液成分的濃度、雜質等影響，應 當在峰電流值的一定百分比下，例如該峰電流值的50%-90%的預定電流值 處測量電位。作為替代，可以使用其中基于在一定條件下獲得的電位-電流曲線的微分值測量電位的方法。
基于如此獲得的電位，相對于在例如0 ng/ m L的DNA濃度下測定的 基準電位，使用各試樣表現(xiàn)出的電位變化和雙鏈DNA濃度作出校準曲線 作為標準。
利用該校準曲線，從相對于基準電位的電位變化測定雙鏈DNA的濃 度，其中以與上i^f目同的方式得到有待檢驗的試樣的電位變化。
當有待檢驗的試樣的雙鏈DNA濃度高時，可以在測定前用上述的測 定溶液(緩沖溶液和9AA溶液)稀釋試樣。當烷^^磺酸衍生物例如TAPS 和MOPS充足包含在試樣溶液中時，不必加入烷基磺酸衍生物。當試樣溶 液中不含烷基磺酸衍生物時，適當加入一定量(例如，相當于10mM)的 TAPS、 M0PS等，由此可以良好地進行測定。
用于根據(jù)本發(fā)明測定雙鏈DNA的試劑盒可以包含，例如包括能夠與 雙鏈DNA結合的物質和緩沖物質的測量試劑，以及諸如電極的電化學測 量裝置。作為緩沖物質，使用下列物質具有允許在含有該緩沖物質的 溶液中測定的雙鏈DNA結合物質的電位-電流曲線的氧化波電位根據(jù)溶液 中游離雙鏈DNA結合物質的濃度而變化的性質的物質。
更具體地，通過使用由烷基磺酸衍生物和吖咬衍生物組成的測量試 劑以及由三個電極、即作為工作電極的貴金屬電極例如金或鉬電極、參 比電極和對電極組成的測量電極，可以形成和提供利用本發(fā)明方法以簡 單和容易的方式精確地測定雙鏈DNA的試劑盒。
具體的試劑盒的構成是，例如作為測量試劑的100 juM 9AA水溶液 和20 mM TAPS緩沖溶液、和具有在樹脂片上賊射金的對電極和工作電極 的測量電極、以及具有由印刷銀骨形成的參比電極的電極。該試劑盒可 以帶有作為標準物的雙鏈DNA。此外，該試劑盒可以包括用于將測量試劑 與試樣溶液混合的試管、小瓶容器、微量板等以及用于液體采樣的微量 吸液管等。
使用本發(fā)明的試劑盒，可以通過下列過程以簡單和容易的方式精確 地測定試樣中的雙鏈DM含量將測量試劑與試樣溶液混合；將一部分 混合溶液滴在測量電極上；用市售的電位施加設備例如恒電位儀進行掃描；以及測定電位-電流曲線的氧化波電位與空白試驗值的差。 實施例
以下，將通過實施例和比較例詳細說明本發(fā)明。然而，本發(fā)明不限 于這些實施例。 實施例1
制備含0-40 ng/ m L雙鏈DNA的TAPS緩沖溶液(10 mM TAPS, 50 inM KC1， pH 8. 5)。作為雙鏈DNA, 4吏用>$^對為80-4900電泳標記物用雙 鏈DNA。向47. 5 jnL雙鏈DNA溶液中加入2. 5 p L 9AA 7jC溶液(1 mM)， 然后進行電化學測定。電化學測定根據(jù)從自然電位至2V的LSV測定，其 使用銀線作為參比電極并使用濺射金的電極(電M面積lmm2)作為工 作電極和對電極。在相對于銀參比電極為約1. 2V的氧化波的80%電流值 下測定氧化波電位。將雙鏈DNA濃度為0 ng/juL時的氧化波電位(E。) 作為基準，測定該電位(E。)與各個雙鏈DNA濃度下的氧化波電位(En) 之間的差值(AE)，并且作出AE相對雙鏈DNA濃度的校準曲線(R^0. 96 )。 然后，將5 pL TAPS緩沖溶液(100 mM TAPS, 500 mM KC1, pH 8.5) 和2. 5 n L 9AA水溶液(1 mM)加入到42. 5 p L具有未知雙鏈DNA濃度 的試樣中，并以與上^i目同的方式進行電化學測定。測出相對于E。的電 位差AE?；谠撔是€，發(fā)現(xiàn)該試樣的雙鏈DNA濃度為20±2ng/|iL (n=4)。
實施例2
用MOPS緩沖溶液(10 mM MOPS, 50 mM KCl， pH 8. 5 )代替實施例1 中的TAPS緩沖溶液作出校準曲線。與上面相似，將5 MOPS緩沖溶 液(100mMMOPS， 500 mM KCl, pH 8. 5 )和2. 5 n L 9AA水溶液(1 mM) 加入到42. 5 mL與實施例1所用相同的未知濃度試樣中。通過進行與上 勤目同的電化學測定測出相對于E。的電位差AE?；谛是€，發(fā)現(xiàn)該 試樣的雙鏈DNA濃度為20 ng/pL。
實施例3
用含有10-50 9AA的10 mM TAPS緩沖溶液(pH 8.5)進行從自然電位至2V (相對銀參比電極)的LSV測定。使用濺射金的電極(lmm2) 作為對電極和工作電極。
將含有50 pM 9AA的溶液的氧化波電位作為基準，測定各個9AA濃 度下氧化波電位向較低電位移動的量。在9AA濃度與電位移動量之間發(fā) 現(xiàn)相關性(R2=0. 98)(

圖1)。
然后，制^0-30ng/jiL入DNA的TAPS緩沖溶液(pH 8. 5 )，并 且向各個溶液中加入相當于50 pM的9AA。以與上i^目同的方式進行LSV 測定，并且基于不含入DNA的溶液的氧化波電位測定移動量。在人DM量 與電位移動量之間發(fā)現(xiàn)相關性(R2=0. 96 )(圖2 )。
實施例4
用含有10-50 niM 9AA的10 mM TAPS緩沖溶液(pH 8.5)進行從自 然電位至2V (相對銀參比電極)的LSV測定。使用賊射金的電極(lmm2) 作為對電極和工作電極。在相對銀參比電極為約1. 2V和約0. 65V的氧化 波的90%電流值下測定氧化波電位。隨后，測出該兩個氧化波電位間的差 值。
將含有50 juM 9AA的溶液的兩個氧化波電位間的差值作為基準，測 定各個9AA濃度下兩個氧化波電位間差值減小的量。在9AA濃度與兩個 電位間差值的變化之間發(fā)現(xiàn)相關性(R2=0.98)。
然后，制M0-30ng/ML入DNA的TAPS緩沖溶液(pH 8.5)，并 且向各個溶液中加入相當于50 |i M的9AA。以與上W目同的方式進行LSV 測定，并且基于不含入DNA的溶液的氧化波電位間的差值測定各個電位差 值的減小量。在入DNA量與氧化波電位間差值的減小量之間發(fā)現(xiàn)相關性 (R2=0. 95)。
實施例5
(a)將l jiL pSPTetRNA (Life Sciences, Inc.的產(chǎn)品)溶、^>入 到19 jliL含5 mMMgCl2、 10 mM TAPS-NaOH ( pH 8. 5 ) 、 50mMKCl、 1 mM dNTP、 2. 5 jaM隨機9mer引物(random 9mer primer )和0. 25 U/ pL AMV 逆轉錄酶(Takara Bio， Inc.的產(chǎn)品)的逆轉錄反應溶液中。為了防止 逆轉錄反應初期發(fā)生的模板RNA和逆轉錄的DNA低聚物的熱變性，首先在30匸進行逆轉錄反應10分鐘然后在45匸進行15分鐘。此后，將反應
溶液在99t:加熱10分鐘然后用冰冷卻以便使變得不必要的逆轉錄酶的
活性失活。
(b) 然后，將20 jnL上述(a)中制成的反應溶液加入到80 pL 含如下成分的PCR反應溶液中:3. 2 mM MgCl2、 12. 5 mM TAPS-NaOH( pH 8. 5 )、 62. 5mMKCl、 0. 03 U/pL DM聚合酶、0.25 pM上游引物(sense primer )
(5， -CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3，)和0. 25 pM下游引物(antisense primer) (5， -CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3，)。接著，將50 ^L該溶
液在95x:加熱2分鐘。在不將其冷卻的情況下，進行聚合物sm反應
(PCR)，其中分別在951C、 601C和721C下進行變性、退火和鏈延長。 重復該循環(huán)30次。
(c) 采用50 yL沒有用于上述(b)的PCR反應的殘余反應溶液， 用測量電極進行從自然電位至2V的LSV測定，并且得到氧化波電位E。。 然后，以同樣方式測定進行過PCR的反應試樣溶液，得到氧化波電位E,。 測量電極由作為在聚對苯二甲酸乙二醇酯樹脂膜上濺射金的電極的工作 電極和對電極、以及作為印有^l艮青的電極的參比電極組成。E。與Ei之間 的電位差AE為35mV。使用入DM在組成與上述反應溶液相同的液體中的 溶液預先作出入DNA校準曲線。從該入DNA校準曲線中，證實作為入DNA 當量的由pSPTetRNA產(chǎn)生的雙鏈DNA的量為25 ng/jiL。
工業(yè)應用性
根據(jù)本發(fā)明的測定雙鏈DNA量的方法以及測定用的試劑盒使得能夠 基于電位-電流曲線的電位變化定量測定。因此，本發(fā)明使高度精確的測 定成為可能，其不像基于電流量變化的常規(guī)電化學測定方法那樣依賴于 電極的表面積。本發(fā)明不需要任何昂貴的測量電極例如固定化酶電極或 保持均一表面積精確度的高水平電極制造技術。可以按簡單和容易的方 式精確地進行本發(fā)明以便測定合成或提取的雙鏈DNA或者由PCR等擴增 的雙鏈DNA的量。附圖簡述
圖1是顯示9AA濃度與反應混合物中氧化波電位移動量之間關系的 坐標圖；以及
圖2是顯示雙鏈DNA濃度與氧化波電位移動量之間關系的坐標圖。
權利要求
1.一種電化學測定雙鏈DNA量的方法，其包括向含有雙鏈DNA的溶液中相對所述雙鏈DNA過量加入能夠與該雙鏈DNA結合的物質以便相互反應，然后電化學測定沒有與雙鏈DNA結合的游離雙鏈DNA結合物質的殘余量以便測定所述反應溶液中雙鏈DNA的含量，其中所述反應溶液包含具有以下性質的物質作為緩沖物質允許在含有所述緩沖物質的反應溶液中測定的雙鏈DNA結合物質的電位-電流曲線的氧化波電位根據(jù)反應溶液中游離雙鏈DNA結合物質的濃度而變化。
2. 權利要求1的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述緩沖物 質是具有以下性質的物質允許在含有該緩沖物質的反應溶液中測定的 雙鏈DNA結合物質的電位-電流曲線的氧化波電位隨著反應溶液中游離雙 鏈DNA結合物質濃度的降低而向較低電位移動。
3. 權利要求1的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述緩沖物 質是具有以下性質的物質允許在含有該緩沖物質的反應溶液中測定的 雙鏈DM結合物質的電位-電流曲線的氧化波電位具有兩個或更多個峰而 且允許所述峰中的兩個之間的電位差隨著反應溶液中游離雙鏈DNA結合 物質濃度的降低而減小。
4. 權利要求l的電化學測定雙鏈DM量的方法，其中所述緩沖物 質是烷基磺酸衍生物。
5. 權利要求4的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述烷基磺 酸衍生物是選自3-嗎啉基丙磺酸(MOPS)和N-三(羥甲基)甲基-3-^ 丙磺酸(TAPS)中的一種或多種。
6. 權利要求1的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述能夠與 雙鏈DNA結合的物質是雙鏈DNA的嵌入劑。
7. 權利要求6的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述嵌入劑 是吖咬衍生物。
8. 權利要求7的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述吖咬衍 生物是9-氨基吖啶。
9. 權利要求1的電化學測定雙鏈DNA量的方法，其中所述雙鏈DNA 由RNA的逆轉錄反應制成。
10. 用權利要求1-9任一項的電化學測定雙鏈DNA量的方法測定雙 鏈DNA量的試劑盒。
全文摘要
提供了一種以簡單方式并以優(yōu)異的精確度電化學測定雙鏈DNA量的方法，該方法不需要任何昂貴的測量電極例如固定化酶電極或者能夠保持均一表面積精確度的任何高水平電極制造技術；并且提供了采用該方法的測定用試劑盒。公開了電化學測定試樣溶液中雙鏈DNA量的方法，其基于過量加入到該溶液中的能夠與該雙鏈DNA結合的物質的殘余量；以及采用所述方法的測定用試劑盒。在該方法或試劑盒中，向試樣溶液中加入緩沖物質。該緩沖物質是如下物質，其能夠允許在含有該緩沖物質的溶液中測定的能夠與雙鏈DNA結合的物質的電位-電流曲線的氧化波電位根據(jù)溶液中能夠與雙鏈DNA結合的游離物質的濃度而變化。
文檔編號G01N33/483GK101310176SQ20068004274
公開日2008年11月19日 申請日期2006年11月16日 優(yōu)先權日2005年11月16日
發(fā)明者坂本齊 申請人:三菱瓦斯化學株式會社