專利名稱：間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測馬動脈炎病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于馬動脈炎病毒感染的檢測技術(shù)，是一種采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的檢測方法。
背景技術(shù)：
馬動脈炎病毒(Equine Arteritis Virus，EAV)是馬病毒性動脈炎的病原，馬病毒性動脈炎是引起馬的散發(fā)性呼吸系統(tǒng)和繁殖系統(tǒng)的接觸性傳染病，可導(dǎo)致病變器官的小動脈中膜變性和壞死。國際獸疫局(OIE)將馬病毒性動脈炎列為B類傳染病，我國農(nóng)業(yè)部宣布其為禁止進(jìn)境的二類動物傳染病。馬動脈炎病毒為套式病毒目(Nidoviales)、動脈炎病毒科(Arteriviridae)成員。1953年美國專家Doll等首次從馬流產(chǎn)胎兒中分離出該病毒，并命名為Bucyrus株。EAV是線性單股正鏈RNA病毒，含有七個(gè)ORF(開放閱讀框架)，編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白核衣殼蛋白N、膜蛋白M、大囊膜糖蛋白GL和小囊膜糖蛋白Gs。大囊膜糖蛋白GL含有EAV最主要的中和抗原決定簇，是EAV的主要保護(hù)性抗原，GL蛋白和M蛋白通過二硫鍵形成二聚體復(fù)合物，是病毒顆粒的主要組成單位。
在EAV流行地區(qū)，馬匹一般呈隱性感染或出現(xiàn)比較輕的感染癥狀，如果在牧場發(fā)生流行可造成妊娠母馬的高流產(chǎn)率。持續(xù)感染的種公馬雖然沒有明顯的臨床癥狀，但是精液中的病毒可傳播給雌馬，引起EAV的傳播。該病呈世界性分布，血清學(xué)試驗(yàn)證實(shí)，中國也存在此病。由于目前還無法區(qū)別自然感染產(chǎn)生的抗體和免疫接種產(chǎn)生的抗體，許多國家為了出口的需要，禁止使用疫苗接種來控制本病。
本發(fā)明在做出之前，對馬動脈炎病毒的檢驗(yàn)檢疫方法，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定其方法包括血清中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝和血凝抑制試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。
血清中和試驗(yàn)(SNT)動物受到病毒感染后，體內(nèi)產(chǎn)生特異性的中和抗體，并與相應(yīng)的病毒粒子呈現(xiàn)特異性結(jié)合，因而阻止病毒對敏感細(xì)胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和試驗(yàn)是以測定病毒的感染力為基礎(chǔ)，比較病毒受免疫血清中和后的感染力為依據(jù)，來判定免疫血清中和病毒的能力。中和試驗(yàn)常用的有兩種方法一種是固定病毒量與等量系列稀釋的血清混合，另一種是固定血清用量與等量系列對數(shù)稀釋的病毒混合；然后把血清-病毒混合物置適當(dāng)條件下作用一定時(shí)間后，接種于敏感細(xì)胞、雞胚或動物，測定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效價(jià)。如果接種血清-病毒混合物的宿主與對照一樣都出現(xiàn)病變或死亡，則說明血清中沒有相應(yīng)的中和抗體。中和試驗(yàn)不僅能定性而且能定量。
補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)補(bǔ)體是一組正常血清蛋白成分，可被免疫復(fù)合物激活產(chǎn)生具有裂解細(xì)胞壁的因子。如果該過程發(fā)生在紅細(xì)胞表面則導(dǎo)致紅細(xì)胞裂解而出現(xiàn)溶血。利用這種反應(yīng)來檢測血清中的抗體或抗原，稱作補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test，CFT)。CFT包括兩種系統(tǒng)，第一個(gè)為反應(yīng)系統(tǒng)，已知抗原(抗體)，被檢血清(或抗原)和補(bǔ)體。第二個(gè)系統(tǒng)為指示系統(tǒng)(又稱溶血系統(tǒng))，即溶血素+綿羊紅細(xì)胞，溶血素即為抗綿羊紅細(xì)胞抗體，補(bǔ)體常用豚鼠血清，它對紅細(xì)胞有較強(qiáng)的裂解能力。但補(bǔ)體只有和抗原抗體復(fù)合物結(jié)合后被激活才能夠產(chǎn)生溶血作用。因此，如果試驗(yàn)中的抗原和抗體是對應(yīng)的，形成免疫復(fù)合物，定量的補(bǔ)體就被結(jié)合，這時(shí)加入指示系統(tǒng)，由于沒有游離的補(bǔ)體，就不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，即為陽性反應(yīng)。反之試驗(yàn)中缺乏抗原或特異性抗體，就不能形成免疫復(fù)合物，補(bǔ)體就游離于反應(yīng)液中，就被指示系統(tǒng)，即綿羊紅細(xì)胞和溶血素免疫復(fù)合物激活，而出現(xiàn)溶血，即陰性反應(yīng)。
血凝和血凝抑制試驗(yàn)其基本原理是某些病毒或者病毒的血凝素，能選擇性的使幾種動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝。當(dāng)病毒的懸液中加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲貢r(shí)，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑|。這時(shí)紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，成為血凝抑制反應(yīng)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是簡單快速，但是由于它檢測的是病毒抗體，而抗體必須在感染后相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)才能產(chǎn)生，因此，該方法的應(yīng)用范圍受到限制。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。該酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判斷有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量成呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測儀(酶標(biāo)儀)來測定。
上述方法因敏感性、特異性、確診時(shí)間過長或環(huán)境污染等問題，很難滿足進(jìn)出口貿(mào)易中快速、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)的需求。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的是采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的檢測技術(shù)，建立一種敏感、特異、快速、準(zhǔn)確的檢測方法，并應(yīng)用于馬動脈炎病毒的檢驗(yàn)檢疫，以提高檢測方法的敏感性、特異性，縮短檢測時(shí)間，降低檢測成本，保護(hù)和促進(jìn)我國畜牧業(yè)和對外貿(mào)易的發(fā)展。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方案完成的，其檢測方法是分析馬動脈炎病毒GL蛋白的抗原性，設(shè)計(jì)引物并克隆GL蛋白的抗原域編碼基因，構(gòu)建GL蛋白原核表達(dá)載體pET-GL1，將pET-GL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21宿主菌，高效表達(dá)EAV GL蛋白，Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)產(chǎn)物的大小約為26kD，His-Bind柱純化蛋白，優(yōu)化馬動脈炎病毒抗體的iGL1-ELISA方法的反應(yīng)條件，并建立結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)，分析該檢測方法的特異性，對待檢血清分別用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、以及西班牙的INGEZIM-ARTERITIS試劑盒這3種方法進(jìn)行檢測，比較檢測結(jié)果的符合率。
分析馬動脈炎病毒GL蛋白的抗原性根據(jù)GenBank上登陸的EAVBucyrus的基因序列(NC-002532)，應(yīng)用DNAstar軟件分析GL蛋白的抗原性，結(jié)果表明GL蛋白54Aa-98Aa抗原指數(shù)較高。
設(shè)計(jì)引物并克隆GL蛋白的抗原域編碼基因用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，目標(biāo)擴(kuò)增基因?yàn)镋AV GL蛋白的54Aa-98Aa區(qū)域。在引物P1中加入Bam HI酶切位點(diǎn)，引物P2中加入Xho I酶切位點(diǎn)。引物序列為P15′-CGTGGATCCTACAACTGTTCCGCCAGTAA-3′，劃線部分是Bam HI酶切位點(diǎn)；
P25′-ATACTCGAGCGGACCATGCGCCTGTTC-3′，劃線部分是Xho I酶切位點(diǎn)。
取病毒懸液，提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取5μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒回收。
構(gòu)建GL蛋白原核表達(dá)載體pET-GL1將回收的目的片段和pET-32a質(zhì)粒分別用Bam HI、Xho I酶切，用膠回收試劑盒回收純化的目的產(chǎn)物。將目的片段和載體按用T4DNA連接酶連接。氯化鈣法制備BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物。自氨芐(Amp)平板上挑取單菌落，接種于LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)14-16h，堿裂解法提取質(zhì)粒用Bam HI和Xho I雙酶切鑒定。將陽性質(zhì)粒命名為pET-GL1，測序。
將pET-GL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21宿主菌，高效表達(dá)EAV GL蛋白將陽性轉(zhuǎn)化菌接種于含50μ/mL Amp的LB培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日以2％的量接種于2×YT培養(yǎng)基(50μ/mL Amp)震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4-0.5時(shí)分別加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。分別在30℃和37℃的培養(yǎng)條件下用最佳濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。表達(dá)產(chǎn)物的大小約為26kD。
Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液處理進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)印及反應(yīng)，一抗為抗馬動脈炎病毒陽性血清，二抗為羊抗馬IgG-HRP。顯色用DAB試劑。
His-Bind柱純化蛋白根據(jù)Novagen公司的His·BindPurificationKit說明書進(jìn)行，取不同時(shí)間的洗脫液進(jìn)行電泳鑒定分析。
優(yōu)化馬動脈炎病毒抗體的iGL1-ELISA方法的反應(yīng)條件，建立結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行iGL1-ELISA方陣滴定，選取某一P/N(陽性血清OD值/陰性血清OD值)最大且P在1.0左右的抗原和血清稀釋度，確定抗原最佳包被濃度和抗體適宜稀釋倍數(shù)。結(jié)果表明最佳的抗原最佳稀釋倍數(shù)為1∶40，抗體最佳稀釋倍數(shù)為1∶80，最佳抗原包被濃度為9.65μg/mL。結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)是當(dāng)待檢血清OD490＞0.4，且待檢血清OD490/陰性血清OD490＞2時(shí)，樣品判定為陽性。
分析檢測方法的特異性將馬動脈炎陽性血清、馬動脈炎陰性血清、血清馬鼻肺炎陽性血清、馬鼻肺炎陰性血清、馬傳貧陽性血清、馬傳貧陰性血清從1∶20開始做倍比稀釋，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，利用iGL1-ELISA進(jìn)行檢測。
與病毒中和試驗(yàn)進(jìn)行比較取病毒中和試驗(yàn)檢測過的900份馬血清樣品，應(yīng)用本研究建立的iGL1-ELISA進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果作比較分析。
與西班牙的INGEZIM-ARTERITIS試劑盒進(jìn)行比較將180份待檢馬血清樣品分別用進(jìn)口的試劑盒INGEZIM-ARTERITIS和本研究建立的iGL1-ELISA進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果作比較分析。
本發(fā)明與已有技術(shù)對比其特點(diǎn)是1、通過基因克隆技術(shù)獲取抗原性較高的目的基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可以方便的得到大量質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的重組抗原，與通過細(xì)胞增殖病毒提取抗原相比，iGL1-ELISA與病毒中和試驗(yàn)的符合率達(dá)到94.1％，可以節(jié)省大量人力、物力，效率更高，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過純化后可以作為檢測抗原包被微量板。
2、間接ELISA法可以檢測抗體，而ELISA法檢測抗原。
3、簡便快速。利用該方法，從提取核酸到最后結(jié)果判定，僅需要8小時(shí)。
4、結(jié)果判定準(zhǔn)確，可靠性高。當(dāng)待檢血清OD490＞0.4，且待檢血清OD490/陰性血清OD490＞2時(shí)，樣品判定為陽性。


圖1.EAV GL蛋白分析及目標(biāo)擴(kuò)增基因的編碼蛋白的抗原性分析AEAV GL蛋白；B目標(biāo)擴(kuò)增基因的編碼蛋白圖2.目標(biāo)基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建鑒定1.DL15000；2.Bam HI、Xho I酶切的pET-GL1；3.擴(kuò)增產(chǎn)物；4.DL2000圖3.IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的確定1-5.IPTG濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L，
M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)圖4培養(yǎng)溫度對表達(dá)的影響1. 30℃下E.coli孵育pET-GL1；2. 37℃下E.coli孵育pET-GL1；3. 37℃下E.coli孵育pET-32a；M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)圖5.表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.PET-32a-BL21；2.PET-GL1-BL21圖6.表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.BL21(PET-32a)；2.純化蛋白樣品13.純化蛋白樣品2；4.離心后的裂解上清液具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的馬動脈炎病毒GL蛋白間接ELISA的檢測方法分析馬動脈炎病毒GL蛋白的抗原性，設(shè)計(jì)引物并克隆GL蛋白的抗原域編碼基因，構(gòu)建GL蛋白原核表達(dá)載體pET-GL1，之后將pET-GL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21宿主菌，高效表達(dá)EAV GL蛋白，Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，His-Bind柱純化蛋白，最后優(yōu)化馬動脈炎病毒抗體的iGL1-ELISA方法的反應(yīng)條件，并建立結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)，分析該檢測方法的特異性，對待檢血清分別用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、以及西班牙的INGEZIM-ARTERITIS試劑盒這3種方法進(jìn)行檢測，比較檢測結(jié)果的符合率。
1、分析馬動脈炎病毒GL蛋白的抗原性參照GenBank上登陸的EAV Bucyrus的基因序列(NC 002532)，應(yīng)用DNAstar軟件分析大囊膜蛋白(GL蛋白)的抗原性。具體步驟為(1)打開DNAstar軟件包，選擇“Protean”程序。
(2)在“Protean”程序中，選擇“File”下拉菜單中的“New”，新建一個(gè)文件，并輸入GL蛋白的序列(見核苷酸序列表)。
(3)在界面顯示的信息中，選取Antigenic index-Jameson-wolf指數(shù)信息(見附圖1)，作為分析抗原性的依據(jù)。
經(jīng)過分析，GL蛋白54Aa-98Aa抗原指數(shù)較高，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該區(qū)域的編碼基因，作為目標(biāo)表達(dá)蛋白。選取GL蛋白是因?yàn)镋AV的中和抗體表位主要位于GL上，分析抗原性的目的是找到抗原指數(shù)較高的區(qū)域，以得到較好的抗原。
2、設(shè)計(jì)引物并克隆GL蛋白的抗原域編碼基因用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對引物，目標(biāo)擴(kuò)增基因?yàn)镋AV GL蛋白的主要抗原域編碼基因，對應(yīng)于EAV GP5 163-294bp。在引物P1中加入BamHI酶切位點(diǎn)，引物P2中加入Xho I酶切位點(diǎn)。引物序列為P15′-CGTGGATCCTACAACTGTTCCGCCAGTAA-3′(Bam HI)P25′-ATACTCGAGCGGACCATGCGCCTGTTC-3′(Xho I)取500μL病毒懸液，按TripureTM試劑盒的操作說明提取總RNA。提取的病毒總RNA立即用于RT-PCR。反轉(zhuǎn)錄的體系為病毒總RNA 9.2μL、5×Buffer 4μL、10mmol/L dNTP2μL、25mmol/L MgCl2 0.8μL、Rnasin1.0μL及下游引物P22μL。65℃反應(yīng)15min后取出，冰浴條件下加入反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 1.0μL，37℃、1h，94℃、5min后結(jié)束反應(yīng)，總體系為20μL。取5μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為PCR模板，按常規(guī)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度為56℃，時(shí)間為1min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收。應(yīng)用設(shè)計(jì)的引物RT-PCR擴(kuò)增出大小約為150bp的片段(圖2)。
3、構(gòu)建GL蛋白原核表達(dá)載體pET-GL1將回收的目的片段和pET-32a質(zhì)粒分別用Bam HI、Xho I酶切，用膠回收試劑盒回收純化的目的產(chǎn)物。將目的片段和載體按3∶1的摩爾比用進(jìn)行T4 DNA連接酶進(jìn)行4℃過夜連接。按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的氯化鈣法制備BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物。自氨芐(Amp)平板上挑取單菌落，接種于含50μ/mL Amp的LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)14-16h，堿裂解法提取質(zhì)粒用Bam HI和Xho I雙酶切鑒定。將陽性質(zhì)粒命名為pET-GL1，送大連TaKaRa公司測序。測序結(jié)果表明擴(kuò)增片段為目的基因，編碼EAV GL蛋白55位Asn和97位Gly的密碼子AAT和GGA分別突變?yōu)榇竽c桿菌偏嗜性密碼子AAC和GGT。雙酶切鑒定的電泳結(jié)果(圖2)表明目的片段已成功插入表達(dá)載體。在本步驟中應(yīng)用的表達(dá)載體為pET-32a，是Novagen公司研制的一種新型融合表達(dá)載體，該載體含有轉(zhuǎn)錄功能強(qiáng)大的T7啟動子，在多克隆位點(diǎn)的上游含有大腸桿菌硫氧還原蛋白的編碼基因，該蛋白可促進(jìn)目標(biāo)蛋白的融合表達(dá)。
4、將pET-GL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21宿主菌，高效表達(dá)EAV GL蛋白將陽性轉(zhuǎn)化菌接種于含50μ/mL Amp的LB培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日以2％的量接種于2×YT培養(yǎng)基(50μ/mL Amp)震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4-0.5時(shí)分別加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。分別在30℃和37℃的培養(yǎng)條件下用最佳濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳的結(jié)果(圖3)表明，0.2-1.0mmol/L的IPTG均可有效誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá)，0.8mmol/L的IPTG的誘導(dǎo)效果最佳。表達(dá)產(chǎn)物的大小約為26kD。不同溫度條件下的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果(圖4)表明，在30℃和37℃條件下目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)量沒有明顯的差別，均可高效表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物。
5、Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物將經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)印及反應(yīng)，一抗為抗馬動脈炎病毒陽性血清，二抗為羊抗馬IgG-HRP。顯色用DAB試劑。經(jīng)Western-blot檢測，在目標(biāo)條帶所處的位置(26kD左右)出現(xiàn)一棕紅色印跡(圖5)，表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。
6、His-Bind柱純化蛋白將發(fā)酵的菌體進(jìn)行超聲波裂解，收集包涵體，變性液溶解后，根據(jù)Novagen公司的His·BindPurification Kit層析柱純化說明書進(jìn)行，取不同時(shí)間的洗脫液進(jìn)行電泳鑒定分析。見圖6，目標(biāo)蛋白有較高的濃度，盡管存在極少量的雜蛋白，但目標(biāo)蛋白占有絕對多的含量，表明純化效果達(dá)到預(yù)期的目的。pET-32a表達(dá)載體的載體閱讀框編碼了6個(gè)連續(xù)的His作為親和標(biāo)簽，使得表達(dá)的重組蛋白能通過金屬離子(Ni2+)配體親和層析，為快速純化目的蛋白提供了便利的條件。
7、優(yōu)化馬動脈炎病毒間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的反應(yīng)條件、建立結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)抗原抗體的某一稀釋孔其OD490值為1.0左右，且P/N最大的原則確定抗原抗體的最佳稀釋度。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1，結(jié)果表明最佳的抗原最佳稀釋倍數(shù)為1∶40，抗體最佳稀釋倍數(shù)為1∶80，最佳抗原包被濃度為9.65μg/mL。分析數(shù)據(jù)、進(jìn)行結(jié)果判斷，是依據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)待檢血清OD490＞0.4，且待檢血清OD490/陰性血清OD490＞2時(shí)，樣品判定為陽性。
表1EAV間接ELISA方陣滴定結(jié)果

第1-8列A-H排為陽性血清；第9-12列A-D排為陰性血清；第9-12列E-H排為空白對照。
8、分析檢測方法的特異性利用iGL1-ELISA檢測馬動脈炎陽性血清、馬動脈炎陰性血清、馬鼻肺炎陽性血清、馬鼻肺炎陰性血清、馬傳貧陽性血清、馬傳貧陰性血清。只有馬動脈炎陽性血清樣品OD490值與馬動脈炎陰性血清樣品OD490值的比值遠(yuǎn)大于2，其余樣品的OD490值與馬動脈炎陰性血清樣品OD490值的比值均小于2。建立的iGL1-ELISA具有較好的特異性。
9、iGL1-ELISA與病毒中和試驗(yàn)檢測結(jié)果的比較應(yīng)用iGL1-ELISA對病毒中和試驗(yàn)檢測過的900份馬血清樣品進(jìn)行了檢測。結(jié)果病毒中和試驗(yàn)檢測為陽性的138份血清，iGL1-ELISA結(jié)果也全為陽性(待檢血清OD490/陰性血清OD490＞2)；病毒中和試驗(yàn)檢測為陰性的762份血清中iGL1-ELISA結(jié)果為陰性的為729份(待檢血清OD490/陰性血清OD490＜2)，但有53份為陽性(待檢血清OD490/陰性血清OD490＞2)。在900份馬血清樣品中，病毒中和試驗(yàn)檢測陽性率為15.3％，iGL1-ELISA檢測為陽性的樣品有171份，陽性率19％。
iGL1-ELISA與病毒中和試驗(yàn)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，在900份馬血清樣品中iGL1-ELISA與中和試驗(yàn)的結(jié)果相符合的樣品為867份，兩種方法的檢測符合率為94.1％。
iGL1-ELISA結(jié)果為陰性的729份馬血清的OD490的平均值為0.243±0.067。因此，初步確定iGL1-ELISA檢測結(jié)果的陽性標(biāo)準(zhǔn)為待檢血清OD490＞0.4，且待檢血清OD490/陰性血清OD490＞2。
10、iGL1-ELISA與INGEZIM-ARTERITIS比較試驗(yàn)結(jié)果對該檢測方法與西班牙INGEZIM-ARTERITIS試劑盒進(jìn)行了比較，按照實(shí)施例7的方法，及西班牙INGEZIM-ARTERITIS試劑盒說明書，對180份待檢血清進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，iGL1-ELISA檢測結(jié)果的陽性率為18.3％，INGEZIM-ARTERITIS試劑盒檢測結(jié)果的陽性率17.2％。本研究制備的iGL1-ELISA試劑盒與INGEZIM-ARTERITIS試劑盒的檢測符合率為95.6％(表2)。
表2本檢測方法與西班牙檢測試劑盒比較試驗(yàn)結(jié)果

核苷酸序列表<110>山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120>間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測馬動脈炎病毒的方法<160>3<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>768<212>RNA<213>馬動脈炎病毒(Arterivirus SP.)<221>CDS<222>(11146)…(11913)<400>1atgttatcta tgattgtatt gctattcttg ctttggggtg cgccatcaca tgcttacttc 60tcatactaca ccgctcagcg cttcacagac ttcaccttgt gtatgctgac ggatcgcggc 120gttattgcca atttgctgcg atatgatgag cacactgctt tgtacaattg ttccgccagt 180aaaacctgtt ggtattgcac attcctggac gaacagatta tcacgtttgg aaccgattgt 240gatgacacct acgcggtccc agttgctgag gtcctggaac aggcgcatgg accgtacagt 300gcgctgtttg atgacatgcc cccttttatt tactatggcc gtgaattcgg catagttgtg 360ttggatgtgt ttatgttcta tcccgtttta gttctgtttt tcttatcagt actaccctat 420gctacgctta ttcttgaaat gtgtgtatct attctgttta taatctatgg catttacagc 480ggggcctact tggccatggg catatttgcg gccacgcttg ctatacattc aattgtggtc 540ctccgccaat tactgtggtt atgcctggct tggcgatacc gctgtacgct tcacgcgtcc 600tttatatcag ctgaggggaa agtgtacccc gtagaccccg gactcccggt tgccgccgtg 660ggcaatcggt tgttagtccc aggtaggccc actatcgatt atgcagtggc ctacggcagc 720aaagtcaacc ttgtgaggtt gggggcagct gaggtatggg agccatag 768<210>2<211>29
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增馬動脈炎病毒的正鏈引物。
<400>2CGTGGATCCT ACAACTGTTC CGCCAGTAA 29<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)PCR反應(yīng)要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增馬動脈炎病毒的負(fù)鏈引物。
<400>3ATACTCGAGC GGACCATGCG CCTGTTC2權(quán)利要求
1.一種間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測馬動脈炎病毒的方法，其特征在于它的程序是分析馬動脈炎病毒GL蛋白的抗原性，設(shè)計(jì)引物并克隆GL蛋白的抗原域編碼基因，構(gòu)建GL蛋白原核表達(dá)載體pET-GL1，將pET-GL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21宿主菌，高效表達(dá)EAV GL蛋白，Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，His-Bind柱純化蛋白，優(yōu)化馬動脈炎病毒抗體的iGL1-ELISA方法的反應(yīng)條件，建立判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)，分析該檢測方法的特異性，對待檢血清分別用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、以及西班牙的INGEZIM-ARTERITIS試劑盒這3種方法進(jìn)行檢測，比較檢測結(jié)果的符合率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測馬動脈炎病毒的方法，其特征在于所述的分析馬動脈炎病毒GL蛋白的抗原性，設(shè)計(jì)引物克隆GL蛋白的抗原域編碼基因，其步驟是根據(jù)GenBank上登陸的EAV Bucyrus的基因序列NC-002532，應(yīng)用DNAstar軟件分析GL蛋白的抗原性，其中GL蛋白54Aa-98Aa抗原指數(shù)較高，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對引物擴(kuò)增該區(qū)域，引物序列為P15′-CGTGGATCCTACAACTGTTCCGCCAGTAA-3′，劃線部分是Bam HI酶切位點(diǎn)；P25′-ATACTCGAGCGGACCATGCGCCTGTTC-3′，劃線部分是Xho I酶切位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測馬動脈炎病毒的方法，其特征在于所述的高效表達(dá)EAV GL蛋白，其程序是將陽性轉(zhuǎn)化菌接種于LB培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)過夜，次日以2％的量接種于含有50μ/mL Amp的2×YT培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4-0.5時(shí)，加入0.8mmol/L的IPTG，在30℃和37℃的培養(yǎng)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)，SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物的大小約為26kD。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測馬動脈炎病毒的方法，其特征在于所述的建立了判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)，其標(biāo)準(zhǔn)是當(dāng)待檢血清OD490＞0.4，且待檢血清OD490/陰性血清OD490＞2時(shí)，樣品判定為陽性。
全文摘要
一種間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測馬動脈炎病毒的方法，其操作程序是分析馬動脈炎病毒GL蛋白的抗原性，設(shè)計(jì)引物并克隆GL蛋白的抗原域編碼基因，構(gòu)建GL蛋白表達(dá)載體pET－GL1，將pET－GL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL－21宿主菌，高效表達(dá)GL蛋白，純化重組GL蛋白作為檢測抗原，建立了檢測馬動脈炎病毒抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(iGL1－ELISA)。iGL1－ELISA與病毒中和試驗(yàn)、西班牙INGEZIM－ARTERITIS試劑盒的檢測結(jié)果符合率分別達(dá)到94.1％、95.6％。iGL1－ELISA方法檢測馬動脈炎病毒，特異性好、靈敏度高，可提高檢測效率，降低檢測成本，具有很強(qiáng)的推廣性和實(shí)用性。
文檔編號G01N33/531GK1851463SQ20061004443
公開日2006年10月25日 申請日期2006年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日
發(fā)明者梁成珠, 岳志芹, 朱來華, 高宏偉, 吳華 申請人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心