專利名稱：檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的近紅外熒光探針及合成方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)及臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的近紅外熒光探針；本發(fā)明還涉及該熒光探針的合成方法；另外，本發(fā)明還涉及該熒光探針的用途。
背景技術(shù)：
鋅離子是生物體中第二富集的過(guò)渡金屬。大量的鋅離子集中在神經(jīng)組織中，如在腦組織中的濃度是0.1-0.5nM。鋅離子通過(guò)金屬調(diào)整蛋白直接參與調(diào)整基因表達(dá)，如鋅作為鋅指蛋白的組成，可通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)或通過(guò)中斷DNA的合成來(lái)影響基因表達(dá)。生物體內(nèi)大部分的鋅離子都與蛋白質(zhì)緊緊結(jié)合，某些細(xì)胞中存在著“游離鋅池”。鋅離子在金屬蛋白中作為一種構(gòu)造因子。鋅可以抑止超氧自由基的產(chǎn)生以及消除超氧自由基的毒害作用。鋅離子能夠從突觸囊中釋放出來(lái)并通過(guò)電位調(diào)控型鈣離子信道進(jìn)入細(xì)胞，這表明游離鋅離子還具有神經(jīng)調(diào)節(jié)功能。同時(shí)，生物體內(nèi)外的大量證據(jù)都說(shuō)明鋅在細(xì)胞凋亡中是一種重要的調(diào)整元素。
現(xiàn)有許多方法，包括原子吸收光譜法，電子順磁共振，Electron ProbeMicronalysis等，已經(jīng)被用于細(xì)胞內(nèi)的金屬離子的檢測(cè)，但是這些方法所用儀器昂貴，不能夠?qū)ι矬w內(nèi)金屬離子進(jìn)行實(shí)時(shí)、原位動(dòng)態(tài)檢測(cè)，并且這些方法測(cè)定時(shí)樣品的預(yù)處理比較復(fù)雜，所以應(yīng)用受到一定的限制。
目前，已有的能夠進(jìn)行細(xì)胞鋅離子檢測(cè)用的熒光探針主要有以下幾類TSQ(Frederickson，C.J.；Kasarkis，E.J.；Ringo，D.；Frederickson，R.E.J.Neurosci.Methods，1987，20，91-103.)、Zinquin乙酯(Tsuda，M.Neurosci.，17，6678，1997)丹磺酰基氨基乙基環(huán)楞胺(Koike，T.；Watanabe，T.；Aoki，S.；Kimura，E.；Shiro，M.，J.Am.Chem.Sic.，118，12696-12703，1996)zinpyr(Burfrtte，S.C.；Frederickson，C.J.；Bu，W.；Lippard，S.J.，J.Am.Chem.Soc.，2003，125，1778-1787.)及ZnAF(Hirano，T.；Kikuchi，K.；Urano，Y.；Higuchi，T.；Nagano，T.J.Am.Chem.Soc.，2002，124，6555-6562.)等，但這些探針缺點(diǎn)在于其激發(fā)波長(zhǎng)處于紫外區(qū)(～350nm)，激發(fā)時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，且由于其發(fā)射波長(zhǎng)位于紫外或者可見區(qū)，生物本體自熒光干擾嚴(yán)重，對(duì)pH變化比較敏感，使其受到了一定的限制。另外存在的問(wèn)題就是這類探針?lè)肿雍铣善饋?lái)一般比較困難，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，實(shí)際應(yīng)用會(huì)有一定困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的改進(jìn)現(xiàn)有的用于細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)的熒光探針的性能和結(jié)構(gòu)上的不足，設(shè)計(jì)合成出性能優(yōu)良、適用于鋅離子檢測(cè)的基于花菁熒光染料的探針?lè)肿幼鳛檠芯磕繕?biāo)。
本發(fā)明的目的之一旨在克服現(xiàn)有技術(shù)熒光探針的性能和結(jié)構(gòu)上的不足之處，提供一種性能優(yōu)良、適用于鋅離子檢測(cè)的基于花菁熒光染料的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的近紅外熒光探針；目的之二是提供工藝簡(jiǎn)單、成本低、操作方便的該近紅外熒光探針的合成方法；目的之三是提供該熒光探針的用途。
本發(fā)明的目的之一可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)該花菁染料熒光探針具有下列結(jié)構(gòu)通式 通式中R＝-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH2CH2CH2CH2SO3-。
本發(fā)明的目的之二可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)該合成方法按如下步驟進(jìn)行a.以花菁染料Cy.7∶絡(luò)合基團(tuán)＝1∶5～10的重量份配比為原料加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后在惰性氣體保護(hù)和60～70℃下反應(yīng)2-5小時(shí)；b.將a工序所得反應(yīng)混合物室溫下冷卻至10～20℃，減壓蒸干，后用乙醚溶解，再加入水萃取至分層，取萃取液I加入乙酸乙酯萃取至分層，得萃取液II；c.取b工序所得萃取液II加無(wú)水硫酸鎂干燥，后在30～40℃下減壓蒸干，蒸除乙酸乙酯，得產(chǎn)品。
本發(fā)明的目的之二還可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)a工序所述的花菁染料Cy.7是具有近紅外熒光光譜的花菁類染料；a工序所述的絡(luò)合基團(tuán)選自二(2-吡啶甲基)胺、喹啉磺酰胺或4，7，10-三甲基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷基；b工序所述的水∶乙醚＝1∶1～1.5的重量份；所述的乙酸乙酯∶萃取液I＝1∶1～1.5的重量份；所述的萃取均在室溫下進(jìn)行；b、c工序中所述的減壓蒸干是指油泵減壓，35～45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。
本發(fā)明代表性的化合物顯示在下面的合成方案中。
在惰性氣體保護(hù)下，花菁熒光染料與二(2-吡啶甲基)胺在N，N-二甲基甲酰胺中反應(yīng)得到探針?lè)肿?，最后?jīng)過(guò)萃取分離得到探針純品。
本發(fā)明的熒光探針在使用時(shí)沒(méi)有特殊的限制，通常，可以將探針?lè)肿尤芙庠谏睇}水、緩沖液或由乙醇、乙腈、二甲亞砜等水溶性有機(jī)溶劑中，然后加入含有細(xì)胞組織的適當(dāng)緩沖液中進(jìn)行測(cè)試。
本發(fā)明的目的之三可通過(guò)如下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)將本發(fā)明的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的近紅外熒光探針用于化學(xué)模擬生物體系中鋅離子的檢測(cè)，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的鋅離子的分析檢測(cè)和熒光成像檢測(cè)，以及臨床醫(yī)學(xué)上病變組織中鋅離子的檢測(cè)。
細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)的一般方法是將培養(yǎng)好的細(xì)胞放于含有探針?lè)肿拥木彌_溶液中孵化，將一部分細(xì)胞用激光共聚焦顯微鏡成像得到空白圖像，然后將剩下的細(xì)胞一部分浸入含有鋅離子及對(duì)鋅離子選擇性的離子載體中，分別用培養(yǎng)液沖洗后，進(jìn)行激光共聚焦顯微成像。然后將含有絡(luò)合物的細(xì)胞浸入含有N，N，N’，N’-四(2-吡啶甲基)乙二胺(TPEN)的溶液中，進(jìn)行激光共聚焦顯微成像。
本發(fā)明具有如下積極效果該熒光探針?lè)肿訉儆诮t外熒光探針，可以有效避免細(xì)胞自發(fā)熒光的干擾，提高檢測(cè)方法的選擇性和靈敏度，減少對(duì)生命體的損傷，有利于活體檢測(cè)。探針?lè)肿蛹ぐl(fā)在720-730范圍內(nèi)，發(fā)射在780-790范圍內(nèi)，對(duì)溶劑極性不敏感，有較大的Stokes位移，并且化學(xué)-光穩(wěn)定性好；本發(fā)明熒光探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)基于分子內(nèi)誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)原理，熒光探針?lè)肿咏j(luò)合鋅離子前熒光量子產(chǎn)率低于0.1，絡(luò)合鋅離子后熒光量子產(chǎn)率高于0.4，鋅離子絡(luò)合前后量子產(chǎn)率至少有20幾倍的增長(zhǎng)；熒光探針?lè)肿訉?duì)鋅離子有很好的選擇性，鈉、鉀、鈣、鎂、鐵、鈷、鎳、銅、汞等金屬離子對(duì)檢測(cè)沒(méi)有影響；熒光探針?lè)肿訉?duì)pH變化不敏感，當(dāng)pH值在6到8范圍內(nèi)，pH值變化對(duì)熒光發(fā)射沒(méi)有影響；熒光探針?lè)肿优c鋅離子之間的絡(luò)合常數(shù)在微摩爾到皮摩爾濃度范圍內(nèi)，可以檢測(cè)納摩爾濃度的細(xì)胞鋅離子；熒光探針?lè)肿蛹?xì)胞滲透性好，對(duì)細(xì)胞本身沒(méi)有毒副作用，適于細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度變化的檢測(cè)。
本發(fā)明涉及的探針?lè)肿泳哂袠O其重要的應(yīng)用價(jià)值。特別是該系列探針?lè)肿悠浼ぐl(fā)波長(zhǎng)位于近紅外區(qū)，有很大的Stokes位移，對(duì)pH變化極不敏感，響應(yīng)時(shí)間極短，測(cè)定靈敏度極其高，對(duì)細(xì)胞的滲透性和毒副作用小，使得這類探針作為正確測(cè)定生物體內(nèi)鋅離子的試劑是極其有用的。另外該系列探針?lè)肿咏Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，合成方法簡(jiǎn)單且效率高，使得極易推廣實(shí)際應(yīng)用。


圖1是本發(fā)明的熒光探針?lè)肿訉?duì)鋅離子具有良好的選擇性；橫坐標(biāo)為各種離子，縱坐標(biāo)為加入金屬離子與未加金屬離子的探針?lè)肿尤芤旱臒晒鈴?qiáng)度的比值。
圖2是本發(fā)明的熒光探針?lè)肿拥臒晒鈴?qiáng)度和鋅離子濃度的關(guān)系；橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(nm)縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
圖3是本發(fā)明的熒光探針?lè)肿訜晒鈴?qiáng)度與pH變化關(guān)系；橫坐標(biāo)為pH，縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光強(qiáng)度。
圖4是本發(fā)明的熒光探針?lè)肿友芯啃∈蟮木奘杉?xì)胞(RAW264.7)的激光共聚焦顯微成像。
具體實(shí)施例方式
參照附圖1～4做進(jìn)一步說(shuō)明探針對(duì)鋅離子選擇性使用上述合成的化合物評(píng)價(jià)對(duì)鋅離子的選擇性。將1μM的化合物加到各種金屬離子的pH7.4的羥乙基哌秦乙硫磺酸緩沖溶液中(0.1mM)，探針激發(fā)波長(zhǎng)為731nm，發(fā)射波長(zhǎng)為780nm，測(cè)試結(jié)果顯示于圖2中。圖1中，對(duì)于縱軸的熒光強(qiáng)度，不添加金屬離子時(shí)的熒光強(qiáng)度設(shè)為1，用數(shù)值表示添加各種金屬離子時(shí)的熒光強(qiáng)度。從圖1中可以看到，化合物對(duì)鋅離子具有很高的靈敏，鋅離子的加入產(chǎn)生很大的熒光增強(qiáng)，另外對(duì)鋅離子也有很好的選擇性，鈉、鉀、鈣、鎂、鐵、鈷、鎳、銅、汞等金屬離子對(duì)檢測(cè)沒(méi)有影響。
探針對(duì)pH的不敏感性使用上述合成的化合物評(píng)價(jià)探針對(duì)pH的敏感性從圖3中可以看出在pH6到8范圍內(nèi)，pH變化對(duì)熒光發(fā)射基本沒(méi)有影響。因此探針可用于生理?xiàng)l件下鋅離子的檢測(cè)。
細(xì)胞培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞由高糖的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，成像前，細(xì)胞貼壁于蓋波片上，然后加入1μM探針的緩沖液中，37℃中孵育30分鐘，然后將一部分細(xì)胞用激光共聚焦顯微鏡成像得到空白圖像，然后將剩下的細(xì)胞一部分浸入含有鋅離子及對(duì)鋅離子選擇性的離子載體中，分別用培養(yǎng)液沖洗后，進(jìn)行激光共聚焦顯微成像。然后將含有絡(luò)合物的細(xì)胞浸入含有TPEN的溶液中，進(jìn)行激光共聚焦顯微成像。
激光共聚焦成像利用激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)，研究小鼠的正常巨噬細(xì)胞(RAW264.7)內(nèi)鋅離子濃度變化對(duì)探針熒光強(qiáng)度的影響。通過(guò)圖4(a)探針?lè)跤^(guò)的巨噬細(xì)胞，可以看到有微弱的熒光；通過(guò)圖4(b)當(dāng)外加鋅離子后，可以觀察到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有很強(qiáng)的熒光；通過(guò)圖4(c)在此基礎(chǔ)上向其中加入對(duì)鋅離子有極強(qiáng)絡(luò)合性的TPEN后，熒光淬滅；圖4(d)為亮場(chǎng)圖像，以表明細(xì)胞在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中仍保持良好的細(xì)胞活力。
實(shí)施例1探針的合成 在100ml三口燒瓶中，加入0.3克(5mmol)具有近紅外熒光光譜的丙基花菁染料Cy.7和2克二(2-吡啶甲基)胺，加入約60ml N，N-二甲基甲酰胺至完全溶解，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)和66℃下反應(yīng)4小時(shí)，室溫下冷卻至15℃，后經(jīng)減壓油泵減壓、35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至蒸干，冷卻后用乙醚溶解成溶解液，再加入乙醚的1.2倍重量份的水于室溫下萃取至分層，取萃取液I，然后再加入萃取液I的0.8倍重量份的乙酸乙酯萃取至分層，得萃取液II，最后向萃取液II中加入無(wú)水硫酸鎂干燥，后經(jīng)減壓油泵減壓、35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸除乙酸乙酯，得產(chǎn)品0.15克。產(chǎn)率50％。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.97(t，6H，J＝6.4Hz)1.61(m，2H，J＝5.5Hz)1.68(s，12H)1.72-1.82(m，4H)2.73(t，4H，J＝5.6Hz)4.02(s，4H)4.20(t，4H，J＝6.8Hz)6.34(d，2H，J＝14.0Hz)7.31(t，2H，J＝7.32Hz)7.48(m，4H)7.64(t，2H，J＝7.08Hz)7.80-8.17(m，6H)8.21(d，2H，J＝14.0Hz)8.66(d，2H，J＝5.1Hz)ESI-MS cal for[M]+＝702.5，found 702.5。
實(shí)施例2用喹啉磺酰胺替換二(2-吡啶甲基)胺，其余同實(shí)施例1。
實(shí)施例3用4，7，10-三甲基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷基替換二(2-吡啶甲基)胺，其余同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的近紅外熒光探針，其結(jié)構(gòu)特征在于該花菁染料熒光探針具有下列結(jié)構(gòu)通式 通式中R＝-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH2CH2CH2CH2SO3-。
2.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的近紅外熒光探針的合成方法，其特征在于該合成方法按如下步驟進(jìn)行a.以花菁染料Cy.7∶絡(luò)合基團(tuán)＝1∶5～10的重量份配比為原料加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后在惰性氣體保護(hù)和60～70℃下反應(yīng)2-5小時(shí)；b.將a工序所得反應(yīng)混合物室溫下冷卻至10～20℃，減壓蒸干，后用乙醚溶解，再加入水萃取至分層，取萃取液I加入乙酸乙酯萃取至分層，得萃取液II；c.取b工序所得萃取液II加無(wú)水硫酸鎂干燥，后在30～40℃下減壓蒸干，蒸除乙酸乙酯，得產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于a工序所述的花菁染料Cy.7是具有近紅外熒光光譜的花菁類染料。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于a工序所述的絡(luò)合基團(tuán)選自二(2-吡啶甲基)胺、喹啉磺酰胺或4，7，10-三甲基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷基。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于b工序所述的水∶乙醚＝1∶1～1.5的重量份；所述的乙酸乙酯∶萃取液I＝1∶1～1.5的重量份；所述的萃取均在室溫下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于b、c工序中所述的減壓蒸干是指油泵減壓，35～45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。
7.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的近紅外熒光探針用于化學(xué)模擬生物體系中鋅離子的檢測(cè)，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的鋅離子的分析檢測(cè)和熒光成像檢測(cè)，以及臨床醫(yī)學(xué)上病變組織中鋅離子的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的近紅外熒光探針及合成方法和用途，該合成方法按如下步驟進(jìn)行a.以花菁染料Cy.7∶絡(luò)合基團(tuán)＝1∶5～10的重量份配比為原料加入N，N－二甲基甲酰胺溶解，然后在惰性氣體保護(hù)和60～70℃下反應(yīng)2－5小時(shí)；b.將a工序所得反應(yīng)混合物室溫下冷卻至10～20℃，減壓蒸干，后用乙醚溶解，再加入水萃取至分層，取萃取液I加入乙酸乙酯萃取至分層，得萃取液II；c.取b工序所得萃取液II加無(wú)水硫酸鎂干燥，后在30～40℃下減壓蒸干，蒸除乙酸乙酯，得產(chǎn)品。該近紅外熒光探針細(xì)胞滲透性好，對(duì)細(xì)胞本身沒(méi)有毒副作用，特別適于細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1844119SQ20061004387
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月26日
發(fā)明者唐波, 黃輝, 徐克花, 陳蓁蓁, 李普明, 劉霞 申請(qǐng)人:山東師范大學(xué)