專利名稱：自身抗體平行檢測液相芯片及其制備方法與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉一種液相芯片及其制備方法與應用，尤其涉及一種用于自身免疫性疾病診斷的自身抗體檢測平行檢測液相芯片及其制備方法與應用，屬于免疫技術(shù)及臨床檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病在人群中的發(fā)病率是3-5％，尤其是在老年人中發(fā)病率最高。這類疾病最普遍的特點是血清中出現(xiàn)自身抗體，而且不同的自身抗體譜可以區(qū)分這類疾病中的各種疾病。目前國際上通用的自身免疫性疾病的診斷標準除了相應的臨床癥狀外，其診斷主要還依據(jù)患者的血清中檢測到自身抗體。風濕病在早期很難診斷，但是在疾病的晚期，全身多個器官系統(tǒng)都會被累及，給病人造成巨大的痛苦，所以需要一種靈敏度高而全面的診斷方法，而目前自身抗體的檢測主要采用免疫學方法，常用的有免疫印記、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附實驗等，這些方法一次只能檢測一個抗體，在實際應用過程中對于抗體譜的檢測既繁瑣又需要相對大量的試劑和臨床標本，臨床檢測費用高，因此如果能將運用新的技術(shù)將這些抗體進行同時檢測，將會對這一類疾病的診療提供極大的方便。目前日益成熟的生物芯片技術(shù)的高通量的特點可以實現(xiàn)把多種自身抗體一次性的聯(lián)合檢。液相芯片技術(shù)是生物芯片的一種，它除了可以同時檢測多種自身抗體以外，還具有較ELISA反應更加充分的液相反應特點，又具有定量性好，省時省力的優(yōu)點。因此，研制和開發(fā)一種自身抗體平行檢測液相芯片是目前臨床診斷的必需。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)自身免疫性疾病多表現(xiàn)為多樣化的自身抗體譜的出現(xiàn)的臨床特點，針對現(xiàn)有自身抗體目前采用的ELISA檢測、免疫熒光等單個檢測一次只能檢測一種自身抗體技術(shù)的不便和臨床診斷的需要，本發(fā)明要解決的問題是提供一種自身抗體平行檢測液相芯片及其制備方法與應用，為自身免疫性疾病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療提供一種方便的、準確的臨床檢測方法以及檢測試劑盒。
本發(fā)明的自身免疫性疾病平行檢測液相芯片，主要由微球，自身抗原，生物素化的二抗，鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，其特征是，所述微球是28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92號微球；所述自身抗原是ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，環(huán)狀聚絲蛋白(CCP)，組蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，α-胞襯蛋白多肽，角蛋白；所述生物素化的二抗是經(jīng)活化的生物素標記的羊抗人IgG；所述自身抗原和生物素化的二抗均能特異與其相應的自身抗體結(jié)合。
其中所述ANAs抗原與28號微球形成偶聯(lián)體，dsDNA與32號微球形成偶聯(lián)體，SSA/Ro-60與36號微球形成偶聯(lián)體，SSA/Ro-52與38號微球形成偶聯(lián)體，SSB/La與46號微球形成偶聯(lián)體，Jo-1與48號微球形成偶聯(lián)體；Scl-70與56號微球形成偶聯(lián)體，PCNA與58號微球形成偶聯(lián)體，環(huán)狀聚絲蛋白(CCP)與66號微球形成偶聯(lián)體，組蛋白與68號微球形成偶聯(lián)體，CENP-B與76號微球形成偶聯(lián)體，rRNP78號微球形成偶聯(lián)體，U1RNP與86號微球形成偶聯(lián)體，α-胞襯蛋白多肽與88號微球形成偶聯(lián)體，角蛋白與92號微球形成偶聯(lián)體；所述偶聯(lián)體是一種球形基質(zhì)。
以紅色激光激發(fā)球形基質(zhì)上的紅色分類熒光，依據(jù)球形基質(zhì)的色彩不同確定類型；所述生物素化二抗與鏈霉親和素-藻紅蛋白結(jié)合，以綠色激光激發(fā)藻紅蛋白，測定球形基質(zhì)上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球形基質(zhì)上結(jié)合的自身抗體的含量。
本發(fā)明共確定了15種用于自身免疫性疾病診斷的自身抗體檢測的自身抗原，并利用所述抗原分別檢測其相應的抗體，分別是ANAs抗體，dsDNA抗體，SSA/Ro-60抗體，SSA/Ro-52抗體，SSB/La抗體，Jo-1抗體，抗Scl-70抗體、抗PCNA抗體，抗CCP抗體，抗組蛋白抗體，抗著絲點抗體(ACA，RA33抗體)，抗rRNP抗體，抗U1RNP抗體，α-胞襯蛋白抗體，抗角蛋白抗體。本發(fā)明所涉及的15種自身抗體，是在大量臨床應用的基礎(chǔ)上，證實確有與自身免疫性疾病的發(fā)生有密切關(guān)系而選擇的。
優(yōu)選的，所述生物素化的二抗是生物素化山羊抗人IgG(H+L)。
優(yōu)選的，所述28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92號微球是經(jīng)洗滌、活化的羧基微球。
生物素化的二抗是用于識別自身抗體的另一類抗體，其作用是將液相芯片微球體結(jié)合的自身抗體與檢測熒光偶聯(lián)，間接將結(jié)合的標記物的濃度與檢測熒光的強度結(jié)合起來，從而實現(xiàn)對每種自身抗體的濃度進行定量測定。生物素化山羊抗人IgG(H+L)通過生物素與avidin-R-PE結(jié)合，最后通過Luminex100檢測系統(tǒng)對每一種自身抗體進行定性定量檢測。
本發(fā)明的設(shè)計思路是選擇自身免疫性疾病產(chǎn)生的自身抗體所針對的抗原，分別與不同色號的微球偶聯(lián)，制備出可對上述自身抗體進行一次性平行檢測的液相芯片，在應用時，加入待檢血清，使血清中的自身抗體被微球上的抗原捕獲，再與生物素標記的二抗共同孵育，然后與鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PA)反應，通過Luminex100檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)對上述自身抗體一次性定量檢測。
本發(fā)明所述自身免疫性疾病平行檢測液相芯片的制備方法，其步驟是(1)自身抗原與微球偶聯(lián)形成偶聯(lián)體分別選取28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92號羧基微球，洗滌；活化羧基微球；以上述順序分別對應地加入ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，環(huán)狀聚絲蛋白(CCP)，組蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，a-胞襯蛋白，角蛋白；混勻；室溫下，以200～250rpm的轉(zhuǎn)速放在搖床上孵育30～120分鐘；重復1～2次；用PBS-TBN洗滌2～3次；ANAs抗原與28號微球形成偶聯(lián)體，dsDNA與32號微球形成偶聯(lián)體，SSA/Ro-60與36號微球形成偶聯(lián)體，SSA/Ro-52與38號微球形成偶聯(lián)體，SSB/La與46號微球形成偶聯(lián)體，Jo-1與48號微球形成偶聯(lián)體；Scl-70與56號微球形成偶聯(lián)體，PCNA與58號微球形成偶聯(lián)體，環(huán)狀聚絲蛋白(CCP)與66號微球形成偶聯(lián)體，組蛋白與68號微球形成偶聯(lián)體，CENP-B與76號微球形成偶聯(lián)體，rRNP78號微球形成偶聯(lián)體，U1RNP與86號微球形成偶聯(lián)體，α-胞襯蛋白多肽與88號微球形成偶聯(lián)體，角蛋白與92號微球形成偶聯(lián)體；計數(shù)每種微球偶聯(lián)體的單位體積數(shù)，確定濃度，分別于4℃條件下避光保存；使用時，依據(jù)檢測項目選擇混合；
(2)將標記有探針的球形基質(zhì)即自身抗原與微球偶聯(lián)的偶聯(lián)體、報告分子即活化的生物素標記的二抗、鏈霉親和素-藻紅蛋白與待測樣品混合，靜置。得到本發(fā)明的自身抗體平行檢測液相芯片。
生物素化二抗的選擇優(yōu)選生物素化山羊抗人IgG(H+L)，用于將鏈霉親和素-藻紅蛋白結(jié)合到微球上。
本發(fā)明所述自身抗體平行檢測液相芯片在制備臨床檢測試劑中的應用。
將標記有探針的球形基質(zhì)即自身抗原與微球偶聯(lián)的偶聯(lián)體、報告分子即活化的生物素標記的二抗、鏈霉親和素-藻紅蛋白與待測樣品混合，靜置，探針可以與相應的目的分子特異性的結(jié)合，帶有綠色報告熒光的報告分子也與目的分子特異性的結(jié)合，將混合物上樣到Luminex 100，采用微流技術(shù)將微球偶聯(lián)體分為單個細胞流，利用紅、綠兩束激光檢測，獲得光信號、處理數(shù)據(jù)就可完成對生物反應的實時、定量分析。
利用本發(fā)明的自身抗體平行檢測液相芯片，可以實現(xiàn)對多種自身抗體的平行檢測，即可同時檢測15種自身抗體，也可以根據(jù)臨床需要選擇性的測量其中的幾個抗體，方便不同的疾病的臨床檢測需要。
本發(fā)明的方法由于將多種自身抗體的檢測在一個反應體系中進行，不同的探針可以和不同的目的分子進行結(jié)合，反應后通過激光檢測球形基質(zhì)的色彩編號可以對不同的檢測反應加以區(qū)分，既具有ELISA檢測的定性定量的優(yōu)點，又具有高通量的特點，因而可更加省時省力，同時節(jié)約了檢測成本。


圖1是實施例3經(jīng)曲線擬合后所得標準曲線，平均熒光強度分別為261.5、908、1475、4422和6654.5，以標準抗體的濃度的對數(shù)值為橫坐標，平均熒光強度值為縱坐標擬合標準曲線。
圖2是實施例4經(jīng)曲線擬合后所得標準曲線，平均熒光強度分別為378、1177、2014、2830.5和7250，以標準抗體的濃度的對數(shù)值為橫坐標，平均熒光強度值為縱坐標擬合標準曲線。
具體實施例方式
實施例1自身抗原與已知編號的微球的偶聯(lián)1.分別選取28，38，48，58，68，78號羧基微球(Luminex公司)，用漩渦震蕩器振蕩微球懸液，時間20秒，使微球混合均勻。
2.分別取上述各號羧基微球大約2×103個，分別轉(zhuǎn)移到離心管中，≥8000×g離心2min，沉淀羧基微球。
3.移走上清，加入100μl dH2O，用漩渦震蕩器振蕩20秒重懸微球，≥8000×g離心2min，沉淀羧基微球。
4.移走上清，加入80μl、100mM、pH＝6.2的磷酸二氫鈉鹽溶液，用漩渦震蕩器振蕩20秒重懸洗滌的羧基微球。
5.加入10μl、50mg/ml的Sulfo-NHS(用dH2O稀釋)，用漩渦震蕩器輕輕的振蕩。
6.加入10μl、50mg/ml的EDC(用dH2O稀釋)，用漩渦震蕩器輕輕的振蕩。室溫孵育20min，每隔10分鐘用漩渦震蕩器輕振一次?！?000×g離心2min，沉淀活化的羧基微球。
7.移走上清，加入250μl、50mM、pH＝5.0的MES，漩渦震蕩器振蕩20秒，重懸活化的羧基微球?！?000×g離心2min，沉淀洗滌后的羧基微球。
8.重復步驟7兩次，用50mM、pH＝5.0的MES洗滌2次。
9.加入100μl、50mM、pH＝5.0的MES，用漩渦震蕩器振蕩20秒。在混勻的微球中分別加入1μg自身抗原ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，環(huán)狀聚絲蛋白(CCP)，組蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，a-胞襯蛋白，角蛋白，用50mM、pH＝5.0的MES定容至500μl，用漩渦震蕩器混勻。
10.在室溫下放在搖床上(200rpm)孵育2小時?！?000×g離心2min，沉淀偶聯(lián)好的微球。
11.移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩渦震蕩器振蕩30秒。在室溫下放在搖床(200rpm)上孵育30分鐘?！?000×g離心2min，沉淀偶聯(lián)好的微球。
12.移走上清，加入1ml PBS-TBN，漩渦震蕩器振蕩30秒。≥8000×g離心2min，沉淀偶聯(lián)好的微球。
13.重復步驟12一次，用PBS-TBN洗滌2次。
14.加入500μl PBS-TBN，重懸偶聯(lián)好和洗滌好的微球，即得ANAs抗原與28號微球的偶聯(lián)體，dsDNA與32號微球的偶聯(lián)體，SSA/Ro-60與36號微球的偶聯(lián)體，SSA/Ro-52與38號微球的偶聯(lián)體，SSB/La與46號微球的偶聯(lián)體，Jo-1與48號微球的偶聯(lián)體；Scl-70與56號微球的偶聯(lián)體，PCNA與58號微球的偶聯(lián)體，環(huán)狀聚絲蛋白(CCP)與66號微球的偶聯(lián)體，組蛋白與68號微球的偶聯(lián)體，CENP-B與76號微球的偶聯(lián)體，rRNP78號微球的偶聯(lián)體，U1RNP與86號微球的偶聯(lián)體，α-胞襯蛋白多肽與88號微球的偶聯(lián)體，角蛋白與92號微球的偶聯(lián)體。
15.用細胞計數(shù)器計數(shù)微球的數(shù)量，換算出每種微球的濃度。
16.把偶聯(lián)好的微球放在4℃避光保存，一般每種抗原偶聯(lián)的微球單獨保存，使用時，依據(jù)檢測項目選擇混合。
實施例2本發(fā)明所述自身免疫性疾病平行檢測液相芯片在臨床檢測中的應用(一)利用本發(fā)明所述自身抗體平行檢測液相芯片檢測自身抗體的技術(shù)流程1.分別取出上述制備的針對每種自身抗原偶聯(lián)微球各500個，按等比例混合，分裝在96孔板中，每一個孔中含有各種自身抗體偶聯(lián)微球各500個，加入待檢血清50μl，37℃孵育2小時。
2.≥8000×g離心2min，移走上清，加入300μl、1％PBS-BSA，漩渦震蕩器振蕩30秒，37℃孵箱封閉1個小時。
3.≥8000×g離心2min。移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩渦震蕩器振蕩30秒?！?000×g離心2min。
4.重復步驟3兩次。
5.加入上述制備的生物素標記的二抗100μl，搖勻，37℃孵箱孵育30分鐘。
6.≥8000×g離心2min，移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩渦震蕩器振蕩30秒。≥8000×g離心2min。
7.重復步驟6兩次。
8.加入鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE)100μl，搖勻，37℃孵箱孵育30分。
9.≥8000×g離心2min，移走上清，加入300μl PBS-TBN，漩渦震蕩器振蕩30秒?！?000×g離心2min。
10.重復步驟9兩次。加入100μl PBS-TBN重懸微球，用于Luminex100進行檢測。
11.Luminex100檢測中，紅色熒光定義微球的種類，綠色熒光測定微球結(jié)合的SA-PE的平均熒光強度，根據(jù)標準曲線，確定待測樣品的自身抗體的濃度。
(二)自身抗體的標準曲線繪制分別根據(jù)各種自身抗體的血清學濃度的范圍，配備15種自身抗體的標準品，每個標準品設(shè)6個稀釋度，然后等比例混合，使各自的終濃度為所需的濃度，每孔50μl，反應步驟與待測樣品的步驟完全相同，根據(jù)測定結(jié)果，運用Luminex100儀器分析系統(tǒng)提供的方程擬合各種自身抗體的標準曲線，根據(jù)標準曲線，檢測系統(tǒng)自動分析出各個待測樣品中自身抗體的濃度，實現(xiàn)對15種自身抗體的一次性定量分析。
實施例3自身抗體的標準曲線繪制舉例一按實施例1和2所述方法，將SSA/Ro-52(R052)包被到38號微球，包被后取1000個微球加入PE標記的鼠抗人IgG反應30分鐘，經(jīng)Luminex100檢測，熒光值達到23000，而沒有包被SSA/Ro-52的微球加入PE標記的鼠抗人IgG反應30分鐘，經(jīng)Luminex100檢測，熒光值只有100，說明我們包被的微球能夠滿足芯片開發(fā)的要求。
取標準SSA/Ro-52抗體，按0EU/ml、6.25EU/ml、12.5EU/ml、25EU/ml和50EU/ml的梯度稀釋，按所述方法反應后，經(jīng)Luminex100檢測，平均熒光強度分別為261.5、908、1475、4422和6654.5。所得標準曲線見圖1。并檢測血清標本一例，測得結(jié)果為1EU/ml，與ELISA結(jié)果0.8EU/ml一致實施例4自身抗體的標準曲線繪制舉例二在實施例3同樣的梯度條件下重復試驗一次，Luminex100檢測，平均熒光強度分別為378、1177、2014、2830.5和7250。所得標準曲線見圖2。并同時檢測血清標本3例，所得結(jié)果分別為72.4436EU/ml、81.2831EU/ml和67.6083EU/ml，與ELISA檢測結(jié)果92.931EU/ml、89.513EU/ml和100.743EU/ml相比，結(jié)果一致。
以上實施例結(jié)果表明本發(fā)明所述自身抗體平行檢測液相芯片一個反應就可同時檢測15種自身抗體，較目前的分項的ELISA及免疫熒光方法的效率提高了15倍。
權(quán)利要求
1.一種自身抗體平行檢測液相芯片，主要由微球，自身抗原，生物素化的二抗，鏈霉親和素-藻紅蛋白組成，其特征是，所述微球是28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92號微球；所述自身抗原是ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，環(huán)狀聚絲蛋白，組蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，α-胞襯蛋白多肽，角蛋白；所述生物素化的二抗是經(jīng)活化的生物素標記的羊抗人IgG；所述自身抗原和生物素化的二抗均能特異與其相應的自身抗體結(jié)合；其中所述ANAs抗原與28號微球形成偶聯(lián)體，dsDNA與32號微球形成偶聯(lián)體，SSA/Ro-60與36號微球形成偶聯(lián)體，SSA/Ro-52與38號微球形成偶聯(lián)體，SSB/La與46號微球形成偶聯(lián)體，Jo-1與48號微球形成偶聯(lián)體；Scl-70與56號微球形成偶聯(lián)體，PCNA與58號微球形成偶聯(lián)體，環(huán)狀聚絲蛋白與66號微球形成偶聯(lián)體，組蛋白與68號微球形成偶聯(lián)體，CENP-B與76號微球形成偶聯(lián)體，rRNP78號微球形成偶聯(lián)體，U1RNP與86號微球形成偶聯(lián)體，α-胞襯蛋白多肽與88號微球形成偶聯(lián)體，角蛋白與92號微球形成偶聯(lián)體；所述偶聯(lián)體是一種球形基質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的自身抗體平行檢測液相芯片，其特征是，所述生物素化的二抗是生物素化山羊抗人IgG(H+L)。
3.如權(quán)利要求1所述的自身抗體平行檢測液相芯片，其特征是，所述28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92號微球是經(jīng)洗滌、活化的羧基微球。
4.權(quán)利要求1所述自身抗體平行檢測液相芯片的制備方法，其特征是，步驟如下(1)微球與自身抗原偶聯(lián)形成偶聯(lián)體分別選取28，32，36，38，46，48，56，58，66，68，76，78，86，88，92號羧基微球，洗滌；活化羧基微球；以上述順序分別對應地加入ANAs、dsDNA、SSA/Ro-60、SSA/Ro-52、SSB/La、Jo-1；Scl-70，PCNA，環(huán)狀聚絲蛋白，組蛋白，CENP-B，rRNP，U1RNP，a-胞襯蛋白，角蛋白；混勻；室溫下，以200～250rpm的轉(zhuǎn)速放在搖床上孵育30～120分鐘；重復1～2次；用PBS-TBN洗滌2～3次；得ANAs抗原與28號微球形成偶聯(lián)體，dsDNA與32號微球形成偶聯(lián)體，SSA/Ro-60與36號微球形成偶聯(lián)體，SSA/Ro-52與38號微球形成偶聯(lián)體，SSB/La與46號微球形成偶聯(lián)體，Jo-1與48號微球形成偶聯(lián)體；Scl-70與56號微球形成偶聯(lián)體，PCNA與58號微球形成偶聯(lián)體，環(huán)狀聚絲蛋白與66號微球形成偶聯(lián)體，組蛋白與68號微球形成偶聯(lián)體，CENP-B與76號微球形成偶聯(lián)體，rRNP78號微球形成偶聯(lián)體，U1RNP與86號微球形成偶聯(lián)體，α-胞襯蛋白多肽與88號微球形成偶聯(lián)體，角蛋白與92號微球形成偶聯(lián)體；計數(shù)單位體積每種微球偶聯(lián)體的數(shù)，分別于4℃條件下避光保存；使用時，依據(jù)檢測項目選擇混合；(2)將自身抗原與微球偶聯(lián)的偶聯(lián)體、活化的生物素標記的二抗、鏈霉親和素-藻紅蛋白與待測樣品混合，靜置，得到本發(fā)明的自身抗體平行檢測液相芯片。
5.權(quán)利要求1所述自身抗體平行檢測液相芯片在制備自身免疫性疾病臨床診斷檢測試劑中的應用。
6.如權(quán)利要求5所述自身抗體平行檢測液相芯片的應用，其特征是，將標記有探針的自身抗原與微球偶聯(lián)的偶聯(lián)體球形基質(zhì)、作為報告分子的活化的生物素標記的二抗、鏈霉親和素-藻紅蛋白與待測樣品混合，靜置，探針與相應的目的分子特異性的結(jié)合，帶有綠色報告熒光的報告分子也與目的分子特異性的結(jié)合，將混合物上樣到Luminex 100，采用微流技術(shù)將微球偶聯(lián)體分為單個細胞流，利用紅、綠兩束激光檢測，獲得光信號、處理數(shù)據(jù)就可完成對生物反應的實時、定量分析。
全文摘要
自身抗體平行檢測液相芯片及其制備方法與應用，屬于免疫技術(shù)及臨床檢測技術(shù)領(lǐng)域。主要由微球，自身抗原，生物素化的二抗，鏈霉親和素－藻紅蛋白組成，所述自身抗原分別與相應的各號微球形成偶聯(lián)體，以紅色激光激發(fā)其球形基質(zhì)上的紅色分類熒光，依據(jù)其球形基質(zhì)的色彩不同確定自身抗原的類型；所述生物素化的二抗與鏈霉親和素－藻紅蛋白結(jié)合，以綠色激光激發(fā)藻紅蛋白，測定球形基質(zhì)上結(jié)合的報告熒光分子的數(shù)量，用于間接確定球形基質(zhì)上結(jié)合的各種自身抗體的含量。本發(fā)明還公開了所述自身抗體平行檢測液相芯片在制備自身免疫性疾病臨床診斷檢測試劑中的應用。
文檔編號G01N21/84GK1866013SQ200610044358
公開日2006年11月22日 申請日期2006年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日
發(fā)明者高雪芹, 張華寧, 韓金祥, 徐華 申請人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心