專利名稱：白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜及其建立方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種指紋圖譜，特別涉及一種白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜及其建立方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中藥是多種成分針對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)疊加起作用，而目前的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)是以某種特定成分為指標(biāo)，隨著中藥研究的現(xiàn)代化，中藥的質(zhì)量研究逐漸從單一有效成分或指標(biāo)成分的定性定量分析轉(zhuǎn)向有效成分群分析。目前對(duì)白芷的質(zhì)量控制僅限于對(duì)白芷中歐前胡素和異歐前胡素進(jìn)行含量測(cè)定。因此，白芷藥材的質(zhì)量控制，除要建立有效成分歐前胡素、異歐前胡素的含量測(cè)定方法，制定含量測(cè)定限度外，建立有效成分群的指紋圖譜分析方法，更有利于全面掌握藥材的質(zhì)量。中藥指紋圖譜技術(shù)對(duì)增加中藥質(zhì)控含量，提高中藥工業(yè)整體水平，實(shí)現(xiàn)中藥走向世界，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。
指紋圖譜的作用主要是反應(yīng)復(fù)雜成分的中藥及其制劑內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。以指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用為中心，促進(jìn)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)代化。國(guó)家藥監(jiān)局已從中藥注射劑開(kāi)始，要求企業(yè)逐步建立指紋圖譜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并將逐步擴(kuò)大指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用范圍。結(jié)合《中華人民共和國(guó)藥典》(2005年版)，將進(jìn)一步修改和完善中藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，增加中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，體現(xiàn)中藥標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)代化。
目前，白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜，對(duì)白芷藥材質(zhì)量進(jìn)行控制。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述醇提液有效成分群指紋圖譜的建立方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述醇提液有效成分群指紋圖譜的應(yīng)用。
本發(fā)明所用的白芷藥材為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.et Hook.f或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)Shanet Yuan的干燥根，具有散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿等功效，是臨床常用的解表中藥之一。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟(1)白芷藥材的提取精密稱取20g白芷藥材，加入160ml95％乙醇，回流提取1～2h，揮干乙醇，殘?jiān)眉状既芙舛ㄈ葜?0ml，從中取250ul用甲醇稀釋至7.5ml，過(guò)0.45um微孔濾膜，濾液供HPLC(高效液相色譜方法)分析。
(2)白芷藥材指紋圖譜的建立精密吸取濾液20ul，采用高效液相色譜方法進(jìn)行測(cè)定，色譜條件Lichrospher5-C18(250mm×4.6mm)色譜柱；以甲醇-水為流動(dòng)相系統(tǒng)，柱溫30℃，進(jìn)樣量20ul，波長(zhǎng)254nm，將指紋圖譜分為I、II、III區(qū)，得到白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜。
為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)0～5min，5％～20％甲醇；5～15mn，20％甲醇；20～30mn，20％～70％甲醇；20～30mn，70％甲醇；30～40mn，70％～90％甲醇，上述甲醇為體積百分比。
一種白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜通過(guò)上述方法得到。
所述白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜是由13個(gè)共有指紋峰構(gòu)成的；其中11號(hào)峰為歐前胡素，13號(hào)峰為異歐前胡素。
由于11號(hào)峰與相鄰色譜峰分離較好，峰位較為居中，各樣品中所共有且已鑒定出其物質(zhì)名稱(歐前胡素)，因此選取供試品色譜峰中的11號(hào)歐前胡素峰為參照峰，其色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為1。
以11號(hào)峰為參照，所述白芷藥材指紋圖譜的13個(gè)共有指紋峰(特征峰)各相對(duì)保留時(shí)間分別為1號(hào)峰0.031～0.034；2號(hào)峰0.086～0.088；3號(hào)峰0.607～0.649；4號(hào)峰0.658～0.665；5號(hào)峰0.704～0.708；6號(hào)峰0.730～0.739；7號(hào)峰0.749～0.755；8號(hào)峰0.810～0.816；9號(hào)峰0.842～0.847；10號(hào)峰0.856～0.861；11號(hào)峰1； 12號(hào)峰1.085～1.087；13號(hào)峰1.181～1.186。
各共有指紋峰相對(duì)峰面積范圍分別為
1號(hào)峰0.005～0.061；2號(hào)峰0.016～0.132；3號(hào)峰0.050～0.366；4號(hào)峰0.010～0.135；5號(hào)峰0.03～0.148； 6號(hào)峰0.006～0.153；7號(hào)峰0.086～0.328；8號(hào)峰0.047～0.105；9號(hào)峰0.018～0.059；10號(hào)峰0.030～0.113；11號(hào)峰1； 12號(hào)峰0.251～0.492；13號(hào)峰0.304～0.845。
通過(guò)白芷不同提取部位與指紋圖譜相關(guān)的藥理實(shí)驗(yàn)將白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜分為I、II、III區(qū)。所述I區(qū)包括1號(hào)峰、2號(hào)峰；所述II區(qū)包括3號(hào)峰、4號(hào)峰、5號(hào)峰、6號(hào)峰、7號(hào)峰、8號(hào)峰、9號(hào)峰、10號(hào)峰；所述III區(qū)包括11號(hào)峰、12號(hào)峰、13號(hào)峰。所述白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜的有效成分群為II區(qū)和III區(qū)；其中II區(qū)主要與解熱、抗炎、抗內(nèi)毒素血癥作用相關(guān)，III區(qū)的色譜峰主要與鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用相關(guān)。
上述白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜在白芷藥材質(zhì)量控制中的應(yīng)用?？捎糜趯?duì)白芷進(jìn)行整體的質(zhì)量控制，也可作為測(cè)定白芷中化學(xué)組分的方法和白芷藥材的鑒別以及對(duì)白芷醇提液有效成分群進(jìn)行新藥開(kāi)發(fā)。
本發(fā)明建立了白芷藥材醇提液的指紋圖譜，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其主要的藥效——鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗內(nèi)毒素血癥作用進(jìn)行研究，明確了白芷共有指紋峰與藥效學(xué)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，建立了能體現(xiàn)白芷藥效的有效成分群指紋圖譜，使白芷藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)更具科學(xué)性。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果1、通過(guò)對(duì)13批不同產(chǎn)地白芷藥材進(jìn)行測(cè)定，制定了白芷指紋圖譜相應(yīng)的技術(shù)參數(shù)，以歐前胡素色譜峰(11峰)作為參照物，計(jì)算了其相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)峰面積值，并總結(jié)出了每個(gè)共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間范圍，相對(duì)峰面積范圍，可作為白芷指紋圖譜分析法的參考數(shù)據(jù)。
2、從藥材整體色譜圖入手，選取特征峰，并大致判斷其峰位和比例關(guān)系，構(gòu)成白芷藥材特有的色譜指紋圖譜全貌，使白芷藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)從原有的某幾個(gè)成份含量的測(cè)定，上升為對(duì)整個(gè)藥品內(nèi)在品質(zhì)的檢測(cè)，避免了單一的化學(xué)成分檢測(cè)的缺陷。
3、譜效學(xué)的研究使指紋圖譜與藥效結(jié)果相對(duì)應(yīng)起來(lái)，白芷鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用主要與醇提液指紋圖譜III區(qū)的色譜峰相關(guān)，解熱、抗炎、抗內(nèi)毒素血癥作用主要是醇提液指紋圖譜II區(qū)白芷成分的特征峰的作用。
4、本發(fā)明所建立的體現(xiàn)白芷藥效的有效成分群指紋圖譜，為全面評(píng)價(jià)白芷藥材提供了有力的根據(jù)。


圖1為13個(gè)不同產(chǎn)地白芷藥材醇提液指紋圖譜。
圖2為歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品圖。
圖3為異歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品圖。
圖4為白芷不同提取部位對(duì)熱致痛小鼠痛閾的影響圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1(1)供試品的制備方法精密稱取20g白芷藥材，加入160ml95％乙醇，回流提取2h，揮干乙醇，殘?jiān)眉状既芙舛ㄈ葜?0ml，從中取250ul用甲醇稀釋至7.5ml，過(guò)0.45um微孔濾膜，濾液作為供試品溶液供HPLC分析。分別制得13個(gè)不同產(chǎn)地(見(jiàn)表10)的白芷藥材的供試品溶液。
(2)白芷藥材指紋圖譜的建立精密吸取供試品溶液20ul，采用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定，以甲醇-水為流動(dòng)相系統(tǒng)，柱溫30℃，進(jìn)樣量20ul，波長(zhǎng)254nm，0～5min，5％～20％甲醇，5～15min，20％甲醇20～30min 20％～70％甲醇，20～30min 70％甲醇，30～40min 70％～90％甲醇，流速1ml/min，Lchrospher5-C18(250mm×4.6mm)色譜柱，記錄時(shí)間40min為最佳色譜條件，建立了13個(gè)不同產(chǎn)地白芷醇提液的指紋圖譜，確立了13個(gè)共有指紋峰。如圖1所示。
表1流動(dòng)相梯度

以11號(hào)峰為參照，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)峰面積，見(jiàn)表2、表3、表4表2各共有指紋峰相對(duì)峰面積值

表3各共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間值


表4指紋圖譜中共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積范圍

實(shí)施例2 譜效學(xué)的研究白芷不同部位的提取 取5號(hào)四川遂寧(未硫熏原藥材)白芷干燥根1kg(5號(hào)白芷是道地藥材，且未被硫熏，做藥效比較有代表性)分別以環(huán)己烷、乙酸乙酯、丙酮、95％乙醇、甲醇、水2L依次回流提取3小時(shí)，每次回流提取后過(guò)濾，揮去溶劑，分別得到六個(gè)部位，分別是環(huán)己烷部位、乙酸乙酯部位、丙酮部位、95％乙醇部位、甲醇部位、水提部位。超臨界CO2萃取部位單獨(dú)經(jīng)超臨界CO2萃取。95％乙醇、甲醇、水物質(zhì)峰均較少且峰位較低。環(huán)己烷部位主要包括醇提液II區(qū)色譜峰，乙酸乙酯部位主要包括醇提液III區(qū)色譜峰。
鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)研究熱板實(shí)驗(yàn)即白芷不同提取部位對(duì)熱致痛小鼠痛閾的影響(圖4)、對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響實(shí)驗(yàn)(表5)。
鎮(zhèn)靜實(shí)驗(yàn)研究對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響實(shí)驗(yàn)(表6)。
抗炎、抗內(nèi)毒素血癥實(shí)驗(yàn)研究小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)(表7)、小鼠中暑內(nèi)毒素血癥實(shí)驗(yàn)即對(duì)小鼠熱暴露生存時(shí)間和肛溫上升速率的影響實(shí)驗(yàn)(表8)、對(duì)小鼠注射性內(nèi)毒素模型的影響即對(duì)注射LPS產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥小鼠存活時(shí)間的影響實(shí)驗(yàn)(表9)。
如圖4所示與吐溫-80對(duì)照組比較，白芷各提取部位對(duì)熱刺激所致小鼠疼痛均有一定的抑制作用。給藥后15min，環(huán)己烷部位就能使小鼠平均痛閾值延長(zhǎng)(P＜0.05)，隨著時(shí)間的推移，作用增強(qiáng)，1個(gè)小時(shí)直到2個(gè)小時(shí)后與吐溫-80對(duì)照組比較有極顯著性差異(P＜0.01)；超臨界CO2萃取部位作用及乙酸乙酯部位作用趨勢(shì)與環(huán)己烷部位相似，但比環(huán)己烷部位稍弱。丙酮部位起效較慢，在90min后與吐溫-80組相比才有顯著性差異(P＜0.01)。
表5白芷不同提取部位對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

注與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01如表5所示各不同提取部位給藥組均能對(duì)抗醋酸刺激所致的疼痛反應(yīng)，使小鼠扭體次數(shù)明顯減少。其中以環(huán)己烷部位和超臨界CO2萃取部位作用最強(qiáng)，與吐溫-80組相比P＜0.01，其次為乙酸乙酯部位和丙酮部位(P＜0.05)。
表6白芷不同提取部位對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

注與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01如表6所示各提取部位均有鎮(zhèn)靜作用，能顯著抑制小鼠的自發(fā)活動(dòng)，其中環(huán)己烷部位和丙酮部位作用最強(qiáng)，與對(duì)照組相比P＜0.01，其次為超臨界CO2提取部位組和乙酸乙酯提取部位組。
表7白芷不同提取部位對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

注與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01如表7所示腹腔染料滲出法實(shí)驗(yàn)是研究藥物抗炎作用的常用實(shí)驗(yàn)方法，急性炎癥水腫，醋酸能導(dǎo)致小鼠腹腔組織毛細(xì)血管通透性的增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乙酸乙酯提取部位、丙酮提取、環(huán)己烷部位對(duì)醋酸致腹膜炎癥的伊文思藍(lán)滲出均有顯著抑制作用，其中以乙酸乙酯提取部位作用最強(qiáng)，與對(duì)照組比較P＜0.01。超臨界CO2提取部位沒(méi)有抑制醋酸致腹膜炎癥的伊文思藍(lán)滲出作用。
表8白芷不同提取部位對(duì)小鼠熱暴露生存時(shí)間和肛溫上升速率的影響


注與高溫對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與吐溫-80對(duì)照組比較#P＜0.05，##P＜0.01。
如表8所示可以看到白芷的三個(gè)不同提取部位相對(duì)于高溫對(duì)照組和吐溫-80溶劑對(duì)照組在減緩肛溫上升速率和延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間上均表現(xiàn)出很好的效果，其中以乙酸乙酯和丙酮作用最強(qiáng)(P＜0.01)，其次為環(huán)己烷提取部位(P＜0.05)。
表9白芷不同提取部位對(duì)注射LPS產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥小鼠存活時(shí)間的影響

注與內(nèi)毒素對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與吐溫-80對(duì)照組比較#P＜0.05，##P＜0.01。
如表9所示可以看到白芷的環(huán)己烷、乙醇、甲醇提取部位在延長(zhǎng)動(dòng)物生存時(shí)間上，相對(duì)于模型組和吐溫-80組均無(wú)顯著性意義。而水部位、乙酸乙酯和丙酮提取部位相對(duì)于內(nèi)毒素對(duì)照組和吐溫-80溶劑對(duì)照組在延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間上均有顯著性差異，以水部位、乙酸乙酯效果最好(P＜0.01)，其次為丙酮提取部位(P＜0.05)。而超臨界CO2提取部位沒(méi)有延長(zhǎng)注射LPS產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥小鼠存活時(shí)間的作用。
鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用以環(huán)己烷部位最強(qiáng)，解熱抗炎抗內(nèi)毒素血癥作用以乙酸乙酯部位最強(qiáng)。與其對(duì)應(yīng)HPLC圖譜(圖1)聯(lián)系分析，可得出白芷鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用主要與醇提液指紋圖譜III區(qū)的色譜峰相關(guān)，共三個(gè)峰包括歐前胡素和異歐前胡素。而解熱、抗炎、抗內(nèi)毒素血癥作用主要是醇提液指紋圖譜II區(qū)之間的白芷成分的特征峰的作用。
白芷指紋圖譜II、III區(qū)為白芷主要有效成分群，是白芷藥材質(zhì)量控制的重點(diǎn)區(qū)域。
表10實(shí)驗(yàn)用樣品來(lái)源及品系

如上所述，可較好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟(1)白芷藥材的提取精密稱取20g白芷藥材，加入160ml 95％乙醇，回流提取1～2h，揮干乙醇，殘?jiān)眉状既芙舛ㄈ葜?0ml，從中取250ul用甲醇稀釋至7.5ml，過(guò)0.45um微孔濾膜，得到濾液；(2)白芷藥材指紋圖譜的建立精密吸取濾液20ul，采用高效液相色譜方法進(jìn)行測(cè)定，色譜條件以甲醇-水為流動(dòng)相系統(tǒng)，柱溫30℃，進(jìn)樣量20ul，波長(zhǎng)254nm，Lichrospher5-C18(250mm×4.6mm)色譜柱，將指紋圖譜分為I、II、III區(qū)，即得到白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)0～5min，5％～20％甲醇；5～15min，20％甲醇；20～30min，20％～70％甲醇；20～30min，70％甲醇；30～40min，70％～90％甲醇，上述甲醇是否為體積百分比。
3.一種白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜通過(guò)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的建立方法得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述白芷藥材指紋圖譜是由13個(gè)共有指紋峰構(gòu)成的，其中11號(hào)峰為歐前胡素，13號(hào)峰為異歐前胡素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述白芷藥材指紋圖譜的13個(gè)共有指紋峰的各共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間分別為1號(hào)峰0.031～0.034； 2號(hào)峰0.086～0.088；3號(hào)峰0.607～0.649；4號(hào)峰0.658～0.665； 5號(hào)峰0.704～0.708；6號(hào)峰0.730～0.739；7號(hào)峰0.749～0.755； 8號(hào)峰0.810～0.816；9號(hào)峰0.842～0.847；10號(hào)峰0.856～0.861；11號(hào)峰1； 12號(hào)峰1.085～1.087；13號(hào)峰1.181～1.186；各共有指紋峰相對(duì)峰面積范圍分別為1號(hào)峰0.005～0.061； 2號(hào)峰0.016～0.132； 3號(hào)峰0.050～0.366；4號(hào)峰0.010～0.135； 5號(hào)峰0.03～0.148； 6號(hào)峰0.006～0.153；7號(hào)峰0.086～0.328； 8號(hào)峰0.047～0.105；9號(hào)峰0.018～0.059；10號(hào)峰0.030～0.113；11號(hào)峰1； 12號(hào)峰0.251～0.492；13號(hào)峰0.304～0.845。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述I區(qū)包括1號(hào)峰、2號(hào)峰；所述II區(qū)包括3號(hào)峰、4號(hào)峰、5號(hào)峰、6號(hào)峰、7號(hào)峰、8號(hào)峰、9號(hào)峰、10號(hào)峰；III區(qū)包括11號(hào)峰、12號(hào)峰、13號(hào)峰。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜的有效成分群為II區(qū)和III區(qū)；所述II區(qū)的色譜峰與解熱、抗炎、抗內(nèi)毒素血癥作用相關(guān)，III區(qū)的色譜峰與鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用相關(guān)。
8.權(quán)利要求3所述的白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜在白芷藥材質(zhì)量控制中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜及其建立方法和應(yīng)用，該方法包括白芷藥材的提取和醇提液有效成分群指紋圖譜的建立，得到白芷藥材醇提液有效成分群指紋圖譜，將指紋圖譜分為三區(qū)，II區(qū)、III區(qū)為主要有效成分群。其中II區(qū)主要與解熱、抗炎、抗內(nèi)毒素血癥作用相關(guān)，III區(qū)的色譜峰主要與鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用相關(guān)。本發(fā)明建立的指紋圖譜重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，與藥效聯(lián)系密切，既可作為測(cè)定白芷中化學(xué)組分的方法，也可作為白芷藥材的鑒別和質(zhì)量控制方法，還可以對(duì)白芷醇提液中的有效成分群進(jìn)行新藥開(kāi)發(fā)。
文檔編號(hào)G01N30/06GK1904606SQ20061003694
公開(kāi)日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2006年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月4日
發(fā)明者聶紅, 張慧 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)