專利名稱：一種地龍指紋圖譜的建立方法和地龍藥材的鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種地龍指紋圖譜地建立方法和地龍藥材的鑒別方法，具體來說，是采用高效液相色譜法(HPLC)來建立地龍藥材指紋圖譜以及用指紋圖譜來鑒別地龍藥材。
背景技術(shù)：
地龍作為傳統(tǒng)中藥，具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿之功效，為中國藥典所收載。中國藥典收載的地龍藥材品種有四種，其中作為藥用主要品種為鉅引科動物參環(huán)毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))，習(xí)稱廣地龍。地龍的主藥成分為蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、酶、糖類等。對地龍中蛋白質(zhì)、氨基酸等成分的定性、定量研究已有報道。其中小分子成分主要為次黃嘌呤及含氮化合物。
地龍藥材成分復(fù)雜，如果單用其中個別活性成分來說明地龍藥材內(nèi)在質(zhì)量，具有一定的片面性。要控制地龍藥材質(zhì)量，最好采用它的物質(zhì)群整體予以控制。中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，對于有效控制中藥材或中成藥的質(zhì)量，具有重要的意義。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在20世紀80年代就已經(jīng)在企業(yè)內(nèi)部采用高效液相指紋圖譜控制質(zhì)量。德國、法國在對銀杏葉提取物聯(lián)合開發(fā)的過程中，發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物的醫(yī)療作用是提取物所得物質(zhì)群的整體作用結(jié)果，而對這樣一個整體的質(zhì)量控制，亦采用高效液相指紋圖譜方法。美國FDA最近幾年制定的植物草藥指南中已經(jīng)明確把指紋圖譜作為混合物質(zhì)群的質(zhì)量控制方法(FDA.Guidance of IndustryBotanical Drug(Draft).2000 August)。指紋圖譜作為中草藥及其提取物質(zhì)量控制方法，目前已經(jīng)成為國際共識。

發(fā)明內(nèi)容
截至目前，關(guān)于地龍指紋圖譜的建立方法卻未見報道。為此，發(fā)明人對地龍指紋圖譜的建立方法進行了研究，對地龍10批藥材進行了測定，建立起地龍指紋圖譜測定方法。
本發(fā)明的目的是通過對地龍水溶性提取物HPLC指紋圖譜的研究，摸索出一種地龍藥材質(zhì)量控制的方法，確立建立地龍的標準指紋圖譜的方法，借此可將地龍指紋譜作為質(zhì)量控制及真?zhèn)舞b別的指標之一。本發(fā)明還同時提供了地龍的標準指紋圖譜。
本發(fā)明通過下列步驟實施
一種地龍指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟
(1)地龍藥材溶液的制備取地龍藥材適量，精密稱重，以氯化鈉溶液作為溶劑，優(yōu)選用生理鹽水，進行提取，提取液經(jīng)微孔濾膜過濾，作為地龍藥材溶液；
(2)參照物溶液的制備取次黃嘌呤對照品適量，精密稱重，用流動相溶解、稀釋，制成參照物溶液；
(3)測定分別精密吸取地龍藥材溶液與參照物溶液，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，制定地龍指紋圖譜，其中高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為磷酸鹽-水-甲醇梯度洗脫液，檢測波長為220nm～300nm，其中，磷酸鹽優(yōu)選用磷酸二氫鉀。
其中，所述的地龍藥材，可以為粗粉或地龍段，例如能全部通過篩孔內(nèi)徑為2000±70um或10目篩、但混有能通過篩孔內(nèi)徑為355±13um或50目篩不超過20％的最粗粉，或者長度為1cm的地龍段，其中優(yōu)選使用1cm地龍段。
其中，所述的提取可以為冷浸提取或常溫(室溫)浸泡提取，其中優(yōu)選使用常溫(室溫)浸泡提取。提取時間可以為12～36小時，優(yōu)選為室溫浸泡提取16小時。
其中，流動相為磷酸鹽-水-甲醇不同比例溶液，優(yōu)選用磷酸二氫鉀水溶液和甲醇水溶液按梯度配比作為流動相。
其中，檢測波長可以選用230nm、254nm、294nm三中波長，其中優(yōu)選使用254nm。
其中，建立地龍標準指紋圖譜的方法，包括如下步驟
(1)地龍藥材溶液的制備取地龍最粗粉或地龍段適量，精密稱重，以0.9％生理鹽水作為溶劑室溫浸泡16小時，離心，取上清液用微孔濾膜(0.45um)過濾，作為地龍藥材溶液；
(2)參照物溶液的制備取次黃嘌呤對照品適量，精密稱重，用流動相溶解、稀釋，制成參照物溶液；
(3)測定分別精密吸取地龍藥材溶液與參照物溶液，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄50分鐘色譜，其中高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液(A)和50％甲醇(B)的梯度洗脫液，檢測波長為254±1nm。
其中，所述的流動相梯度為按體積比計算，A0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，B50％甲醇
其中，柱溫為室溫；流速為0.8～1ml/min，優(yōu)選為0.8ml/min，理論板數(shù)按次黃嘌呤峰計算應(yīng)不低于9000。
其中，上述所述的地龍標準指紋圖譜建立方法，得到的地龍標準指紋圖譜中，共有特征指紋峰有9個，其峰面積總和占總峰面積的90％以上。非共有峰的峰面積占總峰面積小于10％。
以次黃嘌呤的色譜峰(標號為S)的相對保留時間和相對峰面積為1，所得到的地龍標準指紋圖譜中共有特征指紋峰為
3號峰相對保留時間0.528～0.557，相對峰面積0.089～0.657；
4號峰相對保留時間0.596～0.639，相對峰面積0.023～0.126；
5號峰相對保留時間0.779～0.799，相對峰面積0.017～0.188；
S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；
6號峰相對保留時間1.198～1.209，相對峰面積0.062～0.514；
7號峰相對保留時間1.332～1.433，相對峰面積0.097～0.445；
9號峰相對保留時間1.609～1.790，相對峰面積0.040～2.927；
10號峰相對保留時間1.678～1.835，相對峰面積0.049～1.281；
12號峰相對保留時間2.054～2.263，相對峰面積0.024～0.367。
優(yōu)選，以次黃嘌呤的色譜峰(標號為S)的相對保留時間和相對峰面積為1，所得到的地龍標準指紋圖譜中共有特征指紋峰為
3號峰相對保留時間0.543，相對峰面積0.284；
4號峰相對保留時間0.618，相對峰面積0.070；
5號峰相對保留時間0.792，相對峰面積0.067；
S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；
6號峰相對保留時間1.204，相對峰面積0.198；
7號峰相對保留時間1.386，相對峰面積0.243；
9號峰相對保留時間1.700，相對峰面積1.066～1.560；
10號峰相對保留時間1.753，相對峰面積0.468；
12號峰相對保留時間2.164，相對峰面積0.137。
其中，3號峰非常穩(wěn)定，峰形良好；4、5號峰比較穩(wěn)定，但峰值較??；6號峰基本穩(wěn)定，峰形良好，有時峰值??；S號峰非常穩(wěn)定，峰形極好；7號峰在理論板數(shù)9500以下時有一肩峰；9號峰非常穩(wěn)定，峰形極好；10號峰為一未分開峰，積分面積合并計算；12號峰較穩(wěn)定，有時峰值小。
作為本發(fā)明的另一目的，本發(fā)明還提供了一種地龍藥材的鑒別方法，包括如下步驟
(1)測定待測地龍樣品的指紋圖譜；
(2)將待測地龍樣品的指紋圖譜與地龍標準指紋圖譜對比，篩選符合地龍標準指紋圖譜的地龍藥材；
其中，步驟(1)是按照上述所述的地龍標準指紋圖譜建立方法進行測定，步驟(2)的地龍標準指紋圖譜即為上述所述的地龍標準指紋圖譜。
本發(fā)明的優(yōu)點主要有
(1)以地龍水溶性提取物、優(yōu)選地龍生理鹽水提取物建立起來的HPLC指紋圖譜，代表著地龍大部分藥理活性，能有效地表征地龍藥材的質(zhì)量。地龍的主要活性成分為氨基酸、多肽、多糖、次黃嘌呤、蚓激酶等水溶性成分，故用地龍的水提取物成分作為監(jiān)控指標就更具有代表性。
(2)以地龍整個指紋圖形作為一個整體看待，注重各個構(gòu)成指紋特征峰的前后順序和相互關(guān)系，注重整體面貌特征，既避免了因只測定一、二個化學(xué)成分而判定地龍整體質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達標而人為處理的可能性。本發(fā)明為完整、準確評價地龍的質(zhì)量提供了新的對照標準，將為提高地龍及其成方制劑的質(zhì)量及療效做出貢獻。
(3)本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握的特點。而本發(fā)明只需用水常溫提取，樣品處理大為簡便，節(jié)約了檢驗的成本和時間。


圖1參照物次黃嘌呤HPLC圖譜
圖2地龍標準(對照)指紋圖譜(0～50分鐘)
具體實施例方式
以下通過具體實施例進一步說明本發(fā)明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實施例1地龍標準指紋圖譜的建立方法
1、儀器與試劑
試驗中先后在惠普高效液相色譜儀及色譜工作站HP1100、島津高效液相色譜儀LC2010A進行測試。
甲醇為色譜純，水為蒸餾水，磷酸二氫鉀為分析純。
次黃嘌呤對照品為上海生化廠進口分裝品，經(jīng)HPLC歸一化法測得純度為99.6％。
地龍藥材標準品為廣西玉林所產(chǎn)，經(jīng)黑龍江省藥品檢驗所鑒定為鉅引科動物參環(huán)毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))，分別編號為11～20。
2、色譜條件
色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠；
流動相A0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，B50％甲醇，梯度為
檢測波長為254nm，柱溫為室溫；流速為0.8ml/min，理論板數(shù)按次黃嘌呤峰計算應(yīng)不低于9000。
3、指紋圖譜測定
(1)地龍指紋圖譜制備
參照物溶液的制備取次黃嘌呤對照品適量10mg，精密稱重，置100ml瓶中，加0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成參照物溶液；
地龍對照藥材溶液的制備取地龍1cm段1g，，精密稱重，置離心管中，加0.9％生理鹽水10ml，室溫放置16小時，離心，取上清液用微孔濾膜(0.45um)過濾，作為地龍對照藥材溶液；
分別精密吸取參照物溶液10ul與地龍標準品溶液6ul，注入液相色譜儀，記錄50分鐘色譜。以次黃嘌呤色譜峰(S峰)的保留時間和峰面積為1，計算各特征峰的相對保留時間和峰面積比值。
參照物次黃嘌呤HPLC圖譜和地龍標準指紋圖譜(0～50分鐘)，分別見圖1和2。
(2)共有峰的確定
根據(jù)10批地龍藥材指紋圖譜給出的相關(guān)參數(shù)，地龍藥材的色譜峰的50分鐘內(nèi)全部出現(xiàn)。比較各批藥材的色譜峰，確定了9個共有特征指紋峰，其峰面積總和占總峰面積的90％以上。
以次黃嘌呤的色譜峰(標號為S)的相對保留時間和相對峰面積為1，所得到的地龍標準指紋圖譜中共有特征指紋峰的保留時間和峰面積見表1和2。
實施例2指紋圖譜的穩(wěn)定性試驗
按照指紋圖譜穩(wěn)定性測定方法操作，以編號為12的地龍藥材為供試品，考察16小時溶液穩(wěn)定，分別對共有峰的相對保留時間及相對峰面積有規(guī)定的峰面積進行統(tǒng)計，RSD不超過3％。供試品常溫16小時內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜的技術(shù)要求(見表3和4)。
實施例3指紋圖譜的精密度試驗
按照指紋圖譜精密度規(guī)定方法操作，以編號為12的地龍藥材為供試品，取1份，連續(xù)進樣5次，分別對共有峰的相對保留時間及相對峰面積有規(guī)定的峰面積進行統(tǒng)計，RSD不超過3％，儀器等整個檢測系統(tǒng)的精密度良好，基本符合指紋圖譜的技術(shù)要求(見表5和6)。
實施例4指紋圖譜的重現(xiàn)性試驗
按照指紋圖譜重現(xiàn)性規(guī)定方法操作，以編號為12的地龍藥材為供試品，取5份，分別檢測指紋圖譜，對共有峰的相對保留時間及相對峰面積有規(guī)定的峰面積進行統(tǒng)計，RSD不超過3％，符合指紋圖譜的技術(shù)要求(見表7和8)。
實施例5以地龍標準指紋圖譜鑒別地龍藥材
市售藥材(購自市藥材公司)的指紋圖譜的測定方法，同地龍標準指紋圖譜的建立方法，記錄50分鐘色譜。以次黃嘌呤的色譜峰(標號為S)的相對保留時間和相對峰面積為1，以實施例1的地龍標準指紋圖譜作為鑒別基礎(chǔ)，比較樣品的指紋圖譜與地龍標準指紋圖譜的差異，鑒別兩者是否一致。
表1 地龍藥材共有峰保留時間和相對保留時間
表2 地龍藥材共有峰及非共有峰面積的比值(1)
表2 地龍藥材共有峰及非共有峰面積的比值(2)
*非共有峰面積百分比
表3 地龍藥材穩(wěn)定性試驗結(jié)果(示保留時間和相對保留時間)
表4 地龍藥材穩(wěn)定性試驗結(jié)果(示峰面積和峰面積比值)
表5 地龍藥材精密度試驗結(jié)果(示保留時間和相對保留時間)
表6 地龍藥材精密度試驗結(jié)果(示峰面積和峰面積比值)
表7 地龍藥材重現(xiàn)性試驗結(jié)果(示保留時間和相對保留時間)
表8 地龍藥材重現(xiàn)性試驗結(jié)果(示峰面積和峰面積比值)
圖2中各特征指紋峰相對保留時間和峰面積相對比值
相對保留時間
3號峰 0.5434號峰0.6185號峰0.792S號峰 1.000
6號峰 1.2047號峰1.3869號峰1.70010號峰1.753
12號峰2.164
特征指紋峰峰面積相對比值
3號峰 0.2844號峰0.0705號峰0.067S號峰 1.000
6號峰 0.1987號峰0.2439號峰1.333±20％ 10號峰0.468
12號峰0.137。
權(quán)利要求
1、一種地龍指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟
(1)地龍藥材溶液的制備取地龍藥材適量，精密稱重，以氯化鈉溶液作為溶劑進行提取，提取液經(jīng)微孔濾膜過濾，作為地龍藥材溶液；
(2)參照物溶液的制備取次黃嘌呤對照品適量，精密稱重，用流動相溶解、稀釋，制成參照物溶液；
(3)測定分別精密吸取地龍藥材溶液與參照物溶液，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，制定地龍指紋圖譜，其中高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為磷酸鹽-水-甲醇梯度洗脫液，檢測波長為220nm～300nm。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的氯化鈉溶液為生理鹽水。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的磷酸鹽為磷酸二氫鉀。
4、一種地龍標準(或?qū)φ?指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟
(1)地龍藥材溶液的制備取地龍最粗粉或地龍段適量，精密稱重，以0.9％生理鹽水作為溶劑室溫浸泡16小時，離心，取上清液用微孔濾膜(0.45um)過濾，作為地龍藥材溶液；
(2)參照物溶液的制備取次黃嘌呤對照品適量，精密稱重，用流動相溶解、稀釋，制成參照物溶液；
(3)測定分別精密吸取地龍藥材溶液與參照物溶液，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄50分鐘色譜，其中高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液和50％甲醇的梯度洗脫液，檢測波長為254±1nm。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的流動相梯度為按體積比計算，0分鐘時100％的0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，5分鐘時100％的0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，10分鐘時99％的0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液和1％的50％甲醇，50分鐘時100％的50％甲醇。
6、根據(jù)權(quán)利要求4-5所述的方法，其中所述地龍標準指紋圖譜中，共有特征指紋峰有9個，其峰面積總和占總峰面積的90％以上。
7、根據(jù)權(quán)利要求4-6所述的方法，其中所述地龍標準指紋圖譜中，以次黃嘌呤的色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為1，共有特征指紋峰選自
3號峰相對保留時間0.528～0.557，相對峰面積0.089～0.657；
4號峰相對保留時間0.596～0.639，相對峰面積0.023～0.126；
5號峰相對保留時間0.779～0.799，相對峰面積0.017～0.188；
S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；
6號峰相對保留時間1.198～1.209，相對峰面積0.062～0.514；
7號峰相對保留時間1.332～1.433，相對峰面積0.097～0.445；
9號峰相對保留時間1.609～1.790，相對峰面積0.040～2.927；
10號峰相對保留時間1.678～1.835，相對峰面積0.049～1.281；
12號峰相對保留時間2.054～2.263，相對峰面積0.024～0.367。
8、根據(jù)權(quán)利要求4-7所述的方法，其中所述地龍標準指紋圖譜中，以次黃嘌呤的色譜峰的相對保留時間和相對峰面積為1，共有特征指紋峰選自
3號峰相對保留時間0.543，相對峰面積0.284；
4號峰相對保留時間0.618，相對峰面積0.070；
5號峰相對保留時間0.792，相對峰面積0.067；
S號峰(參照峰)相對保留時間1，相對峰面積1；
6號峰相對保留時間1.204，相對峰面積0.198；
7號峰相對保留時間1.386，相對峰面積0.243；
9號峰相對保留時間1.700，相對峰面積1.066～1.560；
10號峰相對保留時間1.753，相對峰面積0.468；
12號峰相對保留時間2.164，相對峰面積0.137。
9、一種地龍藥材的鑒別方法，包括如下步驟
(1)測定待測地龍樣品的指紋圖譜；
(2)將待測地龍樣品的指紋圖譜與地龍標準指紋圖譜對比，篩選符合地龍標準指紋圖譜的地龍藥材；
其中，步驟(1)是按照權(quán)利要求4或5所述的方法測定，步驟(2)的地龍標準指紋圖譜為權(quán)利要求6-8中所述的地龍標準指紋圖譜。
全文摘要
本發(fā)明提供一種中藥地龍HPLC指紋圖譜建立的方法及其標準指紋圖譜。首先制備地龍藥材溶液，取地龍適量，精密稱重，以0.9％生理鹽水作為溶劑室溫浸泡16小時，離心，取上清液用微孔濾膜(0.45um)過濾，作為地龍標藥材溶液；其次制備參照物溶液，取次黃嘌呤對照品適量，精密稱重，用流動相溶解、稀釋，制成參照物溶液；最后，進行測定，分別精密吸取地龍標準品溶液與參照物溶液，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄50分鐘色譜，其中高效液相色譜條件為色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液和50％甲醇的梯度洗脫液，檢測波長為254nm。將待測地龍樣品指紋圖譜與標準指紋圖譜對比，比較其異同。本發(fā)明的優(yōu)點是方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握。
文檔編號G01N30/86GK1844912SQ20061000183
公開日2006年10月11日 申請日期2006年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月24日
發(fā)明者李振國 申請人:李振國