專利名稱：用于固定生物樣品的聚陽(yáng)離子聚合物涂層的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備有涂層的基材的方法，該有涂層的基材用于在其上固定生物樣品，優(yōu)先用于該生物樣品的分析。本發(fā)明還涉及按照上述方法制備的預(yù)涂基材。該基材上涂了聚陽(yáng)離子聚合物，該聚陽(yáng)離子聚合物提供穩(wěn)定的聚合物層，該聚合物層能夠與陰離子生物組分進(jìn)行離子相互作用。
背景技術(shù)：
各種生物制備技術(shù)要求在后續(xù)處理之前，將樣品材料，如細(xì)胞、組織、蛋白質(zhì)或核酸固定在基材上。這些目標(biāo)生物材料中有許多是陰離子性質(zhì)的，表現(xiàn)出凈負(fù)電荷位點(diǎn)。一種固定這些材料的方法是使用含活性成分的化學(xué)溶液涂靶基材，所述活性成分是陽(yáng)離子性質(zhì)的，表現(xiàn)出凈正電荷。因?yàn)樗潭ǖ哪繕?biāo)生物材料表現(xiàn)出凈負(fù)電荷位點(diǎn)，因此生物材料通過(guò)與涂料溶液的凈正電荷位點(diǎn)相互作用而與基材的表面結(jié)合。涂料溶液的這種粘附性質(zhì)允許固定生物材料以便后續(xù)處理。
可通過(guò)使用含有本領(lǐng)域中目前已知的各種活性成分的涂層而產(chǎn)生上述固定作用。例如，目前使用涂層劑，如聚-l-賴氨酸、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、鉀鉻礬明膠和卵白蛋白是已知的。這些已知固定劑中最被廣泛使用的一種是聚-l-賴氨酸(PLL)。
PLL是一種大的聚陽(yáng)離子均聚物，其表現(xiàn)出強(qiáng)的正電荷，該正電荷是由沿著聚合物上的所有賴氨酸殘基側(cè)鏈的末端氨基產(chǎn)生的。L-賴氨酸[(S)-2，6-二氨基己酸]是下面式(1)所示化學(xué)結(jié)構(gòu)的氨基酸。
聚合物PLL是通過(guò)肽鍵相連的一連串l-賴氨酸單體單元。下面式(2)中提供了PLL的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中n是代表聚合物鏈中單體單元數(shù)的整數(shù)。
雖然PLL被廣泛用作聚陽(yáng)離子聚合物涂料，但使用PLL涂覆的基材趨向在相對(duì)短的時(shí)間段內(nèi)失去它們的固定有效性。通常認(rèn)為這種有效性隨時(shí)間的下降是由于PLL側(cè)鏈胺基團(tuán)的氧化所致。氧化的基團(tuán)不表現(xiàn)出與所要固定的生物材料適當(dāng)粘附所需的凈正電荷。
PLL作為固定劑的有效性還受到上面式(2)所示的其固有化學(xué)結(jié)構(gòu)的限制。正如先前注釋的，聚合物的氨基酸殘基是通過(guò)肽鍵(-CO-NH-鍵)連接的。這些肽鍵非常易被蛋白水解酶，如胰蛋白酶裂解，并且易被一般的水解裂解，如通過(guò)親核性物質(zhì)的攻擊而裂解。肽鍵的裂解產(chǎn)生鏈長(zhǎng)短得多的PLL分子，如通過(guò)聚合物的平均分子量所測(cè)量的。因?yàn)橥ㄟ^(guò)蛋白水解裂解，PLL分子的分子量減小，因此分子的固定能力(即，它的粘附性質(zhì))大大降低。
已知的固定劑，如PLL，因?yàn)樯鲜龌瘜W(xué)不穩(wěn)定性而表現(xiàn)出有限的有用性。因此，使用已知試劑涂覆的基材也表現(xiàn)出有限的有用性，特別是對(duì)于長(zhǎng)期使用或者在有意義的儲(chǔ)存時(shí)間之后使用而言。由于使用已知固定劑涂覆的基材的有限穩(wěn)定性，具有預(yù)涂基材將非常有用，該基材上涂了表現(xiàn)出穩(wěn)定性增加的固定劑，特別適用于固定生物樣品以便觀測(cè)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種優(yōu)選適于固定生物樣品的有涂層的基材。該基材上涂了聚陽(yáng)離子聚合物，該聚陽(yáng)離子聚合物與本領(lǐng)域先前已知的固定劑相比表現(xiàn)出穩(wěn)定性增加。因此，用穩(wěn)定的聚陽(yáng)離子聚合物涂覆的基材適用于固定具有凈負(fù)電荷的生物樣品，并且有涂層的基材長(zhǎng)時(shí)間保持這種有用性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種制備有涂層的基材的方法。優(yōu)先地，該有涂層的基材適于固定生物樣品。按照一個(gè)實(shí)施方案，該方法包括提供具有表面的基材(該表面包含許多陰離子基團(tuán))，并且使該基材與含有非-肽聚合材料溶液的組合物接觸，以在該基材的至少一部分表面上形成非-肽聚合材料涂層。含有非-肽聚合材料的溶液可以是水溶液或有機(jī)溶液，優(yōu)選具有至少約6的pH。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括干燥涂了非-肽聚合材料的基材的步驟。優(yōu)先地，沖洗其上具有干燥的非-肽聚合材料的有涂層的基材。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法的特征在于沒(méi)有進(jìn)行基材清洗。具體而言，該方法不包括在使基材與非-肽聚合材料接觸之前，使基材經(jīng)受清洗過(guò)程。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種預(yù)涂基材，如顯微鏡載玻片，其優(yōu)先適于固定生物樣品以便分析。按照一個(gè)實(shí)施方案，該基材包含具有許多用于提供凈負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)的表面，并該基材上涂了包含許多陽(yáng)離子基團(tuán)的非-肽聚合材料。
根據(jù)本發(fā)明這一方面，預(yù)涂基材特征在于其每基材的表面面積固定平均細(xì)胞數(shù)的能力。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，當(dāng)預(yù)涂基材與1毫升來(lái)自SiHa細(xì)胞系的細(xì)胞懸浮液接觸時(shí)，該預(yù)涂基材每表面面積能夠固定的平均細(xì)胞數(shù)為至少約20,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，用于涂覆預(yù)涂基材的非-肽聚合材料包含烯丙基型聚合物、乙烯基型聚合物或其組合，優(yōu)先地包含選自伯胺、仲胺、叔胺、季銨的陽(yáng)離子基團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非-肽聚合材料包含聚二烯丙基二甲銨(PDDA)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，非-肽聚合材料包含聚烯丙胺(PAH)。
根據(jù)本發(fā)明的基材可以是適用于觀測(cè)或分析生物材料或觀測(cè)或分析生物材料所必需的任何物品或儀器。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該基材選自載玻片、平板、珠、試管、比色皿、浸漬片、拭子和紗布。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該基材可以是適用作污染物聚集器具的器具。例如，該基材可以是手套、毛巾或醫(yī)用布單。
根據(jù)本發(fā)明的有涂層的基材適于固定本質(zhì)上至少是部分陰離子的材料。優(yōu)選的是，用于固定的材料具有凈負(fù)電荷。因此，該有涂層的基材適用于固定不同的材料，特別適于固定生物材料，如細(xì)胞、組織、流體、DNA、RNA、蛋白質(zhì)和具有陰離子基團(tuán)的類似生物材料，該陰離子基團(tuán)可被用于與制備本發(fā)明有涂層的基材的非-肽聚合材料的陽(yáng)離子基團(tuán)相互作用。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種分析生物樣品的方法。在根據(jù)本發(fā)明這一方面的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括下列步驟提供適于固定生物樣品的預(yù)涂基材，該基材包含具有許多陰離子基團(tuán)的表面，其中該基材上涂了含有許多陽(yáng)離子基團(tuán)的非-肽聚合涂料；將生物樣品應(yīng)用到預(yù)涂基材上，以將該生物樣品固定在該基材上；并且分析固定在預(yù)涂基材上的生物樣品。在特定的實(shí)施方案中，當(dāng)預(yù)涂基材與1毫升來(lái)自SiHa細(xì)胞系的細(xì)胞懸浮液接觸時(shí)，該預(yù)涂基材每表面面積能夠固定的平均細(xì)胞數(shù)為至少約20,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米。
發(fā)明詳述現(xiàn)在將在下文中更充分地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明可具體表現(xiàn)為許多不同的形式且不應(yīng)被解釋為限制于本文所提出的實(shí)施方案；相反，提供這些實(shí)施方案，以使這種公開(kāi)將滿足可應(yīng)用的法律要求。除非上下文中另外清楚地描述，如本說(shuō)明書和權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)的所指對(duì)象。
本發(fā)明預(yù)涂基材的特征在于使用聚合涂料，該聚合涂料優(yōu)選證實(shí)至少與目前已知的涂層劑相等的固定能力，但還證實(shí)在涂覆基材之后該固定作用的延長(zhǎng)的穩(wěn)定性。此外，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與常規(guī)涂層劑，如PLL相比，所述聚合涂料具有較不易或不易被蛋白分解或水解降解的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的聚合涂料包含許多陽(yáng)離子基團(tuán)，它們可用于與陰離子基團(tuán)(例如在所要涂覆的基材上和所要固定的生物樣品內(nèi)的陰離子基團(tuán))相互作用。陽(yáng)離子基團(tuán)可以是聚合涂料的聚合主鏈的組成組分或以側(cè)鏈基團(tuán)的形式存在。陽(yáng)離子基團(tuán)可以是具有凈正電荷且能夠與帶相反電荷的粒子或基團(tuán)進(jìn)行離子相互作用的任何基團(tuán)。特別優(yōu)選的陽(yáng)離子基團(tuán)包括胺基團(tuán)和銨基團(tuán)，其可以是伯、仲、叔或季銨基團(tuán)或銨基團(tuán)。陽(yáng)離子基團(tuán)，特別是銨基團(tuán)，常常帶有與基團(tuán)，如氯化物締合的帶負(fù)電荷的抗衡離子。
特別優(yōu)選顯示較大程度取代的陽(yáng)離子基團(tuán)。正如先前注釋的，簡(jiǎn)單的胺基團(tuán)，如伯胺，非常容易被氧化。取代胺類較不易受到這種氧化攻擊且因此表現(xiàn)出穩(wěn)定性增加?，F(xiàn)認(rèn)為，用更復(fù)雜的基團(tuán)，如甲基取代胺上的氫基團(tuán)提供抗氧化的保護(hù)作用，更復(fù)雜的基團(tuán)較不易被取代。因此，現(xiàn)認(rèn)為更高程度的取代產(chǎn)生穩(wěn)定性增加的胺。由于它們?cè)黾拥姆€(wěn)定性，所以季銨基團(tuán)是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選通過(guò)聚合一個(gè)或多個(gè)烯丙基型或乙烯基型單體形成本發(fā)明的聚合涂料。烯丙基型聚合物被理解為由含有至少一個(gè)烯丙基型基團(tuán)的單體產(chǎn)生的聚合物，其在下面的式(3)中舉例說(shuō)明。

乙烯基型聚合物被理解為由含有至少一個(gè)乙烯基型基團(tuán)的單體產(chǎn)生的聚合物，其在下面的式(4)中舉例說(shuō)明。
丙烯酸、甲基丙烯酸和它們的各種酯是適用于本發(fā)明中的乙烯基型單體的例子。烯丙基型和乙烯基型單體二者都導(dǎo)致形成非-肽聚合物主鏈并且，結(jié)果，比PLL表現(xiàn)出對(duì)蛋白分解降解更大的抗性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用作聚合涂料、由烯丙基型單體產(chǎn)生的特別優(yōu)選的聚合物是聚二烯丙基二甲銨(PDDA)，其通常可以聚合物氯化物鹽的形式得到。像PLL一樣，PDDA是一種大的聚陽(yáng)離子均聚物，其表現(xiàn)出強(qiáng)的凈正電荷。PDDA分子上的強(qiáng)凈正電荷是由沿著聚合物上的所有殘基上的側(cè)鏈二甲基化銨基團(tuán)產(chǎn)生的。下面式(5)中提供了聚合物PDDA的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中n是代表聚合物鏈中單體單元數(shù)的整數(shù)。
PDDA是用作本發(fā)明聚合涂料的特別穩(wěn)定的固定劑。PDDA上的陽(yáng)離子基團(tuán)為季銨類，如上所述，這意味著它們很不易被氧化。PDDA的聚合物主鏈由烯丙基型基團(tuán)產(chǎn)生且不含肽鍵，如在PLL分子中發(fā)現(xiàn)的那些。這種肽鍵的缺失使得PDDA對(duì)蛋白分解劑，如胰蛋白酶的攻擊具有抗性，現(xiàn)已證明該蛋白分解劑分解PLL聚合物鏈并降低固定能力。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試已經(jīng)證實(shí)了用含PDDA的聚合涂料涂覆的基材的穩(wěn)定性增加。在一個(gè)試驗(yàn)中，使用含PDDA的聚合涂料涂覆基材，讓其干燥，并用去離子水沖洗。在45℃下比較涂了PLL的基材與涂了PDDA的基材的加速穩(wěn)定性研究預(yù)測(cè)超過(guò)15個(gè)月的特別的性能穩(wěn)定性。在實(shí)施例2中進(jìn)一步舉例說(shuō)明了這一比較。
此外，因?yàn)槠鋬?nèi)在的親水性，PDDA用于本發(fā)明的聚合涂料中是有利的。令人意外的是，使用PDDA涂覆的基材與使用已知涂層劑，如PLL涂覆的基材相比，表現(xiàn)出親水性增加。這是一種有利的作用，因?yàn)樾〉暮治鰳悠穼⒏鶆虻厣⒉荚谟肞DDA涂覆的基材上。這使得固定樣品更均勻分布，其有利于更好地觀測(cè)固定的樣品。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合涂料中所用的聚合物是聚烯丙胺(PAH)，其通?？梢喳}酸鹽(鹽酸聚烯丙胺)的形式得到。與PDDA一樣，PAH是沒(méi)有肽鍵的烯丙基型聚合物。PAH的胺基團(tuán)沒(méi)有被高度取代，如PDDA；然而，PAH仍然適用作本發(fā)明的聚合涂料。下面式(6)中提供了聚合物PAH的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中n是代表聚合物鏈中單體單元數(shù)的整數(shù)。
除了PDDA和PAH之外，聚合涂料還可以是由一個(gè)或多個(gè)各種單體，特別是烯丙基型或乙烯基型單體聚合而產(chǎn)生的聚合物。因此，聚合涂料可以是均聚物、共聚物或三元共聚物。此外，聚合涂料可以是一種或多種均聚物、共聚物或三元共聚物的物理混合物。當(dāng)聚合涂料包含均聚物時(shí)，單體優(yōu)選全部是陽(yáng)離子單體；然而，當(dāng)聚合物是共聚物、三元共聚物或物理聚合物混合物時(shí)，無(wú)需所有單體都是陽(yáng)離子的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合涂料包含約5％至約100％摩爾百分比的陽(yáng)離子聚合物或單體。更優(yōu)選，聚合涂料包含約30％至約100％摩爾百分比的陽(yáng)離子聚合物或單體，最優(yōu)選約50％至約100％的陽(yáng)離子聚合物或單體。
聚合涂料中所用的陽(yáng)離子單體可以是其常態(tài)陽(yáng)離子型或可從非-陽(yáng)離子狀態(tài)衍生成陽(yáng)離子狀態(tài)。這種衍生可通過(guò)本領(lǐng)域中通常已知的任何方法進(jìn)行，如通過(guò)加入離子官能度，如胺或銨基團(tuán)進(jìn)行。換句話說(shuō)，用于形成聚合涂料的單體可含有天然陽(yáng)離子基團(tuán)，如在用于形成PDDA和PAH的單體的情況下，或可含有側(cè)基，其可被衍生形成陽(yáng)離子側(cè)基。
優(yōu)選，聚合涂料由至少一種單體產(chǎn)生，該單體選自二烯丙基二甲銨、烯丙胺、甲基丙烯酰氨基丙基三甲銨、丙烯酰胺、丙烯酸、異丁烯酰氧基乙基三甲銨、4-乙烯基-芐基三甲銨、甲基丙烯酸、丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、4-乙烯基吡啶、4-乙烯基-1-甲基吡啶、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸二甲氨基乙酯、氯化丙烯酸二甲氨基乙酯甲基季銨鹽、二甲氨基丙基丙烯酰胺、氯化二甲氨基丙基丙烯酰胺甲基季銨鹽、丙烯酰氧乙基二甲基芐銨、丙烯酰氧乙基三甲銨、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酰氧乙基二甲銨、甲基丙烯酰氧乙基三甲基芐銨、乙烯、乙烯亞胺、丙烯、苯乙烯、氯乙烯、異丁烯、三甲基-2-甲基丙烯酰乙銨、三甲基-2-甲基丙烯?；被@和它們的混合物。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合涂料包含陽(yáng)離子單體與至少一種其它單體的共聚物。優(yōu)先地，聚合涂料包含二烯丙基二甲銨與至少一種其它單體的共聚物。最優(yōu)選，該至少一種其它單體包含乙烯基型單體。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合涂料所含的共聚物含有二烯丙基二甲銨和丙烯酸單體單元。在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合涂料所含的共聚物含有二烯丙基二甲銨和丙烯酰胺單體單元。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合涂料所含三元共聚物含有二烯丙基二甲銨、丙烯酸和甲基丙烯酸羥乙酯單體單元。
優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的聚合涂料是“非-肽的”，即單體單元之間的鍵主要是并且，優(yōu)選基本上是非-肽性質(zhì)的。優(yōu)選，聚合涂料包含不多于約25％的肽單體鍵，即單體單元之間至多約25％的鍵含有肽鍵。更優(yōu)選，不多于約10％的單體鍵是肽鍵，并且最優(yōu)選不多于約5％的單體鍵是肽鍵。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合涂料完全沒(méi)有肽鍵。
本發(fā)明聚合涂料中所用的聚合物優(yōu)選具有相對(duì)高的分子量。優(yōu)選高分子量聚合物是因?yàn)榕c這種高分子量有關(guān)的高電荷密度。因此，雖然優(yōu)選高分子量，但根據(jù)本發(fā)明，如果較低分子量的聚合物表現(xiàn)出被認(rèn)為與本文所述高分子量聚合物的電荷密度相等的足夠高的電荷密度，則具有比本文所述分子量更低的分子量的聚合物也是有用的。
聚合涂料中所用的聚合物優(yōu)選具有大于約75,000道爾頓，更優(yōu)選大于約100,000道爾頓的分子量。在特定的實(shí)施方案中，聚合物具有約250,000至約750,000道爾頓，最優(yōu)選約400,000道爾頓至約500,000道爾頓范圍內(nèi)的分子量。除非另有注釋，分子量在本文表示為重均分子量(Mw)，其由下式(7)定義ΣNiMi2ΣNiMi,---(7)]]>其中Ni是具有分子量Mi的聚合物分子數(shù)(或那些分子的摩爾數(shù))。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合涂料包含PDDA，如上面式(5)中所示，其中n是約500至6,000，優(yōu)選約2,000至約5,000，更優(yōu)選約3,000至約4,000之間的整數(shù)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合涂料包含PAH，如上面式(6)所示，其中n是約1,000至約15,000，優(yōu)選約5,000至約12,000，更優(yōu)選約8,000至約10,000之間的整數(shù)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種制備優(yōu)先適于固定生物樣品的有涂層的基材的方法。通常，該方法包括提供具有表面的基材，該表面包含許多陰離子基團(tuán)，如上所述，使基材與含有非-肽聚合涂料溶液的組合物接觸，以在該基材的至少一部分表面上形成聚合涂料的涂層，并干燥涂覆在基材表面上的聚合涂料。
根據(jù)本發(fā)明方法所用的基材可以是含有表面的任何基材，該表面具有許多陰離子基團(tuán)且顯示凈負(fù)電荷并且適用于在其上固定樣品。優(yōu)選，基材是適用作診斷工具、觀測(cè)工具、抗-污染工具和其它類似工具的物品，其使用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。優(yōu)選，本發(fā)明方法中所用的基材包含玻璃、金屬、陶瓷、天然或合成聚合物、天然或合成纖維材料，及其混合物。適用于所述方法中的基材的具體、非限制性例子包括載玻片、珠、試管、比色皿、浸漬片、拭子、紗布等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用聚合涂料涂覆的基材是平板或載玻片，如顯微鏡載玻片。載玻片可包含本領(lǐng)域通常接受的、本身有用的任何材料。例如，載玻片可由玻璃、陶瓷或聚合材料構(gòu)成。當(dāng)使用玻璃時(shí)，玻璃可以是主要包含二氧化硅的任何種類的標(biāo)準(zhǔn)玻璃，如標(biāo)準(zhǔn)鈉鈣玻璃。可選擇性地，玻璃可以是特種玻璃，如硼硅玻璃。
當(dāng)載玻片由聚合物構(gòu)成時(shí)，優(yōu)選聚合物，以其常態(tài)，包含能夠與聚合涂料的陽(yáng)離子基團(tuán)相互作用的陰離子基團(tuán)。然而，在缺少這種基團(tuán)的情況下，聚合物可被衍生以增強(qiáng)細(xì)胞粘附。根據(jù)本發(fā)明的這種實(shí)施方案適用作載玻片的聚合物例子包括，但不限于，聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸羥基酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、氟化乙烯和聚二甲基硅氧烷。該聚合物可以是均聚物、共聚物、三元共聚物或物理聚合物混合物。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合涂料為溶液形式，其可以是水溶液或有機(jī)溶液形式。本領(lǐng)域已知的任何適宜溶劑均可用于溶解聚合涂料，如去離子水用于制備水溶液或醇用于制備有機(jī)溶液。該溶液可具有約0.001％(w/v)至約50％(w/v)的聚合涂料濃度。優(yōu)選，溶液中聚合涂料的濃度為約0.01％至約10％，還更優(yōu)選約0.05％至約2％，更優(yōu)選約0.1％至約1％，并且最優(yōu)選約0.15％至約0.75％。
根據(jù)本發(fā)明特別令人意外的是，在某些實(shí)施方案中，較低濃度的溶液可用于制備有涂層的基材，其固定能力優(yōu)于使用較高濃度溶液制備的有涂層的基材。例如，在特定的實(shí)施方案中，顯示具有約0.25％聚合涂料濃度的溶液特別有利于制備根據(jù)本發(fā)明的預(yù)涂基材。
如上所述，適用于本發(fā)明的聚陽(yáng)離子聚合物可以以與抗衡離子(例如，在PDDA情況下的氯化物和在PAH情況下的氫氯化物)偶合的中性狀態(tài)存在。當(dāng)為溶液形式時(shí)，離子傾向解離。因此，聚合物以其陽(yáng)離子狀態(tài)存在，現(xiàn)成可用作根據(jù)本發(fā)明的固定劑。
本發(fā)明還包括促進(jìn)基材上結(jié)合位點(diǎn)的活化，由此增加可被用于與聚合涂料上陽(yáng)離子基團(tuán)相互作用的陰離子位點(diǎn)數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，用于活化基材上陰離子結(jié)合位點(diǎn)的本領(lǐng)域中已知的任何方法都是有用的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，可調(diào)節(jié)聚合涂料的pH。聚合涂料pH的這種調(diào)節(jié)可以是升高或降低pH且可在使用聚合涂料涂覆基材之前或之后進(jìn)行。調(diào)節(jié)聚合涂料pH的這種能力對(duì)于通過(guò)與聚合涂料接觸時(shí)基材的脫質(zhì)子化而增加基材上陰離子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)特別有利。通常，增加基材表面的pH將促進(jìn)脫質(zhì)子化并增加可利用的陰離子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。
優(yōu)先地，將包含聚合涂料的溶液的pH調(diào)節(jié)至優(yōu)選的pH。在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液的pH為至少約6。換句話說(shuō)，溶液pH為約8、約9、約10、約11、約12、約13或約14。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含聚合涂料的溶液的pH為約8至約14，優(yōu)選約8至約10。
在使基材與聚合涂料接觸后，優(yōu)選在進(jìn)一步處理或使用前，干燥涂覆在基材上的聚合涂料?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中通常已知的任何方法評(píng)價(jià)聚合涂料的干燥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，聚合涂層至少被干燥至視覺(jué)干燥點(diǎn)。濕潤(rùn)聚合材料與干燥聚合材料之間的視覺(jué)差異很容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員識(shí)別。
聚合涂料的干燥可通過(guò)本領(lǐng)域中通常接受的任何方法實(shí)現(xiàn)且可包括被動(dòng)干燥或主動(dòng)干燥(例如，迫風(fēng)，如風(fēng)扇)。涂覆在基材上的聚合涂料可在環(huán)境溫度或升高的溫度下干燥。將本文所用的環(huán)境溫度理解為指周圍環(huán)境的溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)境溫度為平均室溫，通常被認(rèn)為是在約20℃至約25℃(約68至約77)的范圍內(nèi)。當(dāng)然，本發(fā)明不排除低于約20℃的溫度，事實(shí)上，干燥可在低至約聚合涂料凍結(jié)溫度的溫度下進(jìn)行。
涂覆在基材上的聚合涂料的干燥也可在升高的溫度下進(jìn)行。溫度可升高直到大約其中進(jìn)一步增加將引起聚合涂料降解的溫度。因此，涂覆在基材上的聚合涂料可至少部分在升高至約35℃至約120℃(約95至約248)，更優(yōu)選約45℃至約80℃(約113至約176)，最優(yōu)選約50℃至約60℃(122至約140)的溫度下干燥。
干燥涂覆在基材上的聚合涂料的時(shí)間段可根據(jù)干燥的溫度和方法而變化。通常，干燥時(shí)間可從約1分鐘至約1小時(shí)而變化，或更長(zhǎng)時(shí)間。例如，當(dāng)在環(huán)境溫度下干燥涂覆在基材上的聚合涂料時(shí)，這種干燥優(yōu)選進(jìn)行至多約1小時(shí)的一段時(shí)間，更優(yōu)選約5分鐘至約1小時(shí)的一段時(shí)間，并且最優(yōu)選約10分鐘至約30分鐘的一段時(shí)間。在環(huán)境溫度下干燥可持續(xù)超過(guò)1小時(shí)而對(duì)聚合涂料不會(huì)有害。
當(dāng)在升高的溫度下干燥涂覆在基材上的聚合涂料時(shí)，這種干燥優(yōu)選進(jìn)行約1分鐘至約20分鐘的一段時(shí)間，更優(yōu)選約2分鐘至約10分鐘的一段時(shí)間。在升高的溫度下干燥可花費(fèi)超過(guò)約20分鐘的一段時(shí)間，只要時(shí)間與溫度的組合不會(huì)導(dǎo)致聚合物降解。
在用于固定樣品之前，優(yōu)先沖洗，如使用去離子水沖洗其上涂有干燥聚合涂料的基材。這種沖洗適用于除去解離的抗衡離子以及未與基材進(jìn)行離子相互作用的過(guò)量聚合涂料。優(yōu)選在沖洗之前干燥涂覆在基材上的聚合材料，因?yàn)樵跊_洗步驟之前不進(jìn)行干燥步驟可導(dǎo)致其中涂層不完全的(即，“斑駁的”)有涂層的基材。涂覆之后立即沖洗導(dǎo)致洗掉過(guò)量的聚合涂料，使有涂層的基材隨后固定樣品的能力有限。然而，在沖洗之前干燥涂覆在基材上的聚合涂料(如上所述)，促進(jìn)聚合涂料與基材之前的最大離子相互作用，其提供其上涂有最大量聚合涂料(即最大電荷密度)且因此具有隨后固定樣品的最大能力的有涂層的基材。
根據(jù)本發(fā)明，固定能力的最大化也是可能的，因?yàn)樘峁┮环N以可控方式將聚合涂料應(yīng)用到基材上的方法，該方式使得完全消除了沖洗步驟。在涂覆方法中通常包括沖洗，以除去沒(méi)有通過(guò)離子相互作用而被固定在基材上的過(guò)量聚合材料。從經(jīng)濟(jì)學(xué)上說(shuō)這是不合乎需要的。首先，沖洗步驟增加了制備有涂層的基材所需的時(shí)間，特別是在大量生產(chǎn)中，如顯微鏡載玻片。其次，沖洗代表材料的損耗。應(yīng)用在基材上的過(guò)量聚合材料(即，未與基材粘附的聚合材料)在沖洗中損失。再有，在大量生產(chǎn)中，沖洗中損失的聚合材料的量可總計(jì)達(dá)很大的成本。
然而，本發(fā)明解決了這些問(wèn)題。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種將聚合材料控制應(yīng)用到基材上的方法。在該方法中，計(jì)算與基材表面上的離子基團(tuán)進(jìn)行最大離子相互作用所需的聚合材料的量，并僅把所需量的聚合材料應(yīng)用到基材上。因此，使用聚合材料涂覆基材，并且不存在過(guò)量的量而需要沖洗步驟。優(yōu)選，在使用有涂層的基材固定樣品之前，仍然干燥聚合材料。
本領(lǐng)域中此前還未認(rèn)識(shí)到的本發(fā)明另一個(gè)令人意外的方面在于，當(dāng)本發(fā)明方法特定地不包括在使基材與聚合涂料接觸前，使基材表面經(jīng)歷清洗過(guò)程時(shí)，所得到的有涂層的基材表現(xiàn)出改進(jìn)的固定性質(zhì)。本領(lǐng)域中通常認(rèn)可在固定步驟之前，使用于在其上固定樣品的基材經(jīng)歷劇烈清洗。例如，當(dāng)基材是顯微鏡載玻片時(shí)，普遍的實(shí)踐是獲得載玻片，如從制造商處收到，并在繼續(xù)進(jìn)行任意固定步驟之前洗滌載玻片。Cras，J.J.等人Biosensors & Bioelectronics，14(1999)683-688提供了清洗或洗滌過(guò)程的多個(gè)實(shí)例。
根據(jù)本發(fā)明要避免的清洗過(guò)程是包括使用被認(rèn)為可從基材表面有效除去有機(jī)化合物的化學(xué)品的過(guò)程。要避免的清洗過(guò)程的舉例是包括使用酸(例如，鹽酸、硫酸、硝酸、鉻酸和鉻硫酸)、堿(例如，氫氧化銨、氫氧化鈉和氫氧化鉀)和有機(jī)溶劑(例如，甲醇、乙醇、丙醇、甲苯、丙酮、二氯甲烷和松香水)的過(guò)程。要避免的其它清洗過(guò)程包括被設(shè)計(jì)用于使基材，如玻璃上的硅烷基團(tuán)暴露的硅烷化過(guò)程。例如上述(且由Cras，JJ.等人進(jìn)一步描述)等過(guò)程包括除基材表面的簡(jiǎn)單沖洗或擦拭之外的作用機(jī)理。因此，根據(jù)本發(fā)明處理步驟，如使用去離子水沖洗基材或使用布擦拭基材表面不被排除在外。換句話說(shuō)，本發(fā)明包括其中在用非-肽聚合材料涂覆之前，擦拭基材至沒(méi)有灰塵或用水沖洗的過(guò)程。
清洗過(guò)程，如上所述，要耗費(fèi)時(shí)間且包括有毒化學(xué)品的使用。因此，本發(fā)明的方法特別有用，因?yàn)檫@類清洗步驟在優(yōu)選的實(shí)施方案中被完全排除。因此，顯微鏡載玻片，例如，可在從制造商處收到時(shí)使用，而不包括任何清洗步驟。換句話說(shuō)，在本發(fā)明的方法中，該方法不包括在使基材與非-肽聚合涂料接觸之前，使基材經(jīng)歷清洗過(guò)程。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種特別適用于在其上固定生物樣品的預(yù)涂基材。在一個(gè)實(shí)施方案中，該預(yù)涂基材是按照上述方法制備的。
利用本文所述聚合涂料的根據(jù)本發(fā)明的預(yù)涂基材是有利的，因?yàn)榧词狗?肽聚合涂料的涂層相對(duì)薄，該預(yù)涂基材仍然有用和有效用于固定生物樣品。當(dāng)然，該涂層的有效性不限于這類相對(duì)薄的涂層，具有相對(duì)厚涂層的聚合涂料也是有效的。然而，制備根據(jù)本發(fā)明的預(yù)涂基材的能力在制備這類載玻片的成本方面是特別有利的。換句話說(shuō)，僅使用聚合涂料的薄涂層制備用于在其上固定樣品的基材的能力是經(jīng)濟(jì)的，因?yàn)榭墒褂脺p少量的聚合材料。
聚合涂料，當(dāng)涂覆在基材上時(shí)，可具有約0.005微米至約500微米的厚度。優(yōu)選，聚合涂料具有約0.5微米至約100微米，更優(yōu)選約1微米至約50微米的涂層厚度。優(yōu)選，將聚合涂料以單層形式涂覆在基材上，即在本發(fā)明聚合涂料的兩層或更多層之間沒(méi)有夾入不同材料的居間層。然而，本發(fā)明還預(yù)想到了多層涂層。
本發(fā)明的預(yù)涂基材不僅在增加貯存期限方面，而且在固定增加量的生物樣品的能力方面特別有用。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的預(yù)涂基材可以表征為相對(duì)于其它先前已知的預(yù)涂基材，每表面面積能夠固定的平均細(xì)胞數(shù)增加。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，在本發(fā)明預(yù)涂基材上每表面面積固定的平均細(xì)胞數(shù)相對(duì)于沒(méi)有根據(jù)本發(fā)明的方法涂覆的相同面積基材(該基材與相同的細(xì)胞樣品接觸)，每表面面積固定的平均細(xì)胞數(shù)多至少約10％。優(yōu)選，在本發(fā)明預(yù)涂基材上每表面面積固定的平均細(xì)胞數(shù)相對(duì)于沒(méi)有根據(jù)本發(fā)明的方法涂覆的相同面積基材上每表面面積固定的平均細(xì)胞數(shù)多至少約15％，最優(yōu)選多至少約20％。
可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的各種設(shè)備和方法，測(cè)定與根據(jù)本發(fā)明預(yù)涂基材締合的生物材料的增加細(xì)胞計(jì)數(shù)。例如，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器可用于人工計(jì)算有代表性的多個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)且之后推斷出每面積的總細(xì)胞數(shù)是本領(lǐng)域公知的。
細(xì)胞計(jì)數(shù)還可通過(guò)使用計(jì)算機(jī)-控制的、自動(dòng)化設(shè)備，如FOCALPOINTTMCell Profiler自動(dòng)化載玻片閱讀系統(tǒng)(可從TriPathImaging，Inc.獲得)獲得。FOCALPOINTTMCell Profiler使用特定的算法，將細(xì)胞計(jì)數(shù)中所包括的細(xì)胞數(shù)限制到診斷上有意義的值的總數(shù)(即，僅計(jì)算實(shí)際細(xì)胞數(shù)且忽略不計(jì)人為現(xiàn)象)。該細(xì)胞數(shù)從約950累積到1,000個(gè)圖像，其是按最大可能評(píng)價(jià)的在細(xì)胞視野中以高分辨率獲取的。
優(yōu)選，用于獲得細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法，如上所述，能夠提供可再現(xiàn)的結(jié)果且能夠提供以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的方式評(píng)價(jià)的結(jié)果。因此，可以將應(yīng)用在基材上的生物樣品使用標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)備處理，這樣可比較性地評(píng)價(jià)使用該設(shè)備處理的樣品。這種處理設(shè)備的一個(gè)例子是PrepStain SlideProcessor(可從TriPath Imaging，Inc.獲得)。PrepStain Slide Processor允許制備具有一致涂布量的生物樣品的載玻片，這樣涂了樣品的載玻片的面積是一致的且可再現(xiàn)。這種處理特別適用于基于每基材的表面面積的平均細(xì)胞計(jì)數(shù)，評(píng)價(jià)應(yīng)用在基材上的生物樣品。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案提供一種適于固定生物樣品以便分析的預(yù)涂基材。該基材可以是本文所述的任何基材，其上涂了例如上面所述的非-肽聚合涂料。本發(fā)明該實(shí)施方案中的預(yù)涂基材的特征在于它每表面面積能夠固定的平均細(xì)胞數(shù)?？苫跇?biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的固定，評(píng)價(jià)這種固定能力。例如，可使用人子宮頸癌細(xì)胞(通常稱作SiHa細(xì)胞系)評(píng)價(jià)預(yù)涂基材固定細(xì)胞的能力。SiHa細(xì)胞很容易得到，如從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))，通過(guò)ATCC號(hào)HTB-35鑒別。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供一種預(yù)涂基材，其中當(dāng)預(yù)涂基材與1毫升來(lái)自SiHa細(xì)胞系的細(xì)胞懸浮液接觸時(shí)，該預(yù)涂基材表面每表面面積能夠固定的平均細(xì)胞數(shù)為至少約20,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米。優(yōu)選，當(dāng)預(yù)涂基材與1毫升來(lái)自SiHa細(xì)胞系的細(xì)胞懸浮液接觸時(shí)，該預(yù)涂基材表面能夠固定平均至少約21,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米，更優(yōu)選至少約22,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米，最優(yōu)選至少約23,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米。
通過(guò)其它分析方法也可觀測(cè)到根據(jù)本發(fā)明的預(yù)涂基材的固定能力提高。適用于量化有涂層的基材電荷密度的一種方法將根據(jù)每面積有涂層基材的電荷密度，直接測(cè)量電荷密度。另一種方法將通過(guò)與另一種可測(cè)量的性質(zhì)相關(guān)聯(lián)而間接測(cè)量電荷密度。例如，可通過(guò)光譜測(cè)量與有涂層的基材締合(例如，吸附在其上)的染料，量化涂覆在基材上的聚合涂料的電荷密度。
如前所注釋的，有涂層的基材粘附生物樣品(通常帶負(fù)電荷)的能力與載玻片表面上過(guò)量正電荷的量直接相關(guān)。當(dāng)帶負(fù)電荷的染料與載玻片表面締合時(shí)，載玻片表面上的過(guò)量正電荷可通過(guò)染料的光譜分析而量化。染料對(duì)特定波長(zhǎng)電磁輻射的吸收與染料的濃度成正比是本領(lǐng)域中熟知的。因此，已知陰離子染料與陽(yáng)離子涂料之間的比例關(guān)系，則與涂料締合的染料吸收度的測(cè)量是有涂層的基材表面上過(guò)量正電荷量的可靠指示劑。換句話說(shuō)，電荷密度越大，有涂層的基材上吸附的染料濃度越大，并且染料對(duì)特定波長(zhǎng)電磁輻射的吸收越大。這種測(cè)量技術(shù)由Tadao Sakai和Akihiko Hirose(Talanta 59(2003)167-175)描述，其引入本文作為參考。
本領(lǐng)域已知的多種染料均可用于量化涂覆在根據(jù)本發(fā)明的基材上的聚合涂料電荷密度的分析技術(shù)中。特別適用于量化本發(fā)明中有涂層的基材電荷密度的一類染料是呫噸染料，如曙紅和四碘熒光素。根據(jù)本發(fā)明特別有用的染料是曙紅Y(下面式8中所示)，其在中性水溶液中是二-陰離子的。作為二-陰離子類，該染料以1∶2的關(guān)系結(jié)合單-陽(yáng)離子類。
吸附在陽(yáng)離子聚合物，如PDDA上的曙紅Y具有約542納米的最大吸收波長(zhǎng)(λmax)。因此，該波長(zhǎng)下的吸收測(cè)量可有效量化有涂層的基材表面上的過(guò)量正電荷。這種測(cè)量可在本領(lǐng)域已知適用于這種測(cè)量的任何分析裝置，如UV-Vis分光光度計(jì)上進(jìn)行。下面的實(shí)施例4中提供涂了根據(jù)本發(fā)明的聚合涂料的基材的電荷密度測(cè)量的實(shí)施例。
使用聚合涂料涂覆的根據(jù)本發(fā)明的有涂層的基材具有過(guò)量正電荷位點(diǎn)，這種過(guò)量具有有效結(jié)合生物樣品的量。當(dāng)聚合涂料顯示至少最低可接受的電荷密度時(shí)，根據(jù)本發(fā)明有涂層的基材上的聚合涂料有效結(jié)合生物樣品。根據(jù)本發(fā)明制備的預(yù)涂基材的電荷密度，通過(guò)定量測(cè)量，可很容易看出比不是根據(jù)本發(fā)明制備的預(yù)涂基材的電荷密度大得多。當(dāng)曙紅Y染料用于上述定量方法中時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)涂基材表現(xiàn)出的吸收度至少高達(dá)不是根據(jù)本發(fā)明制備的基材上吸收度的兩倍。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的基材表現(xiàn)出的吸收度比不是根據(jù)本發(fā)明制備的基材上吸收度大至少約3倍。甚至更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的基材表現(xiàn)出的吸收度比不是根據(jù)本發(fā)明制備的基材上吸收度大至少約4倍。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供一種適于固定生物樣品以便分析的預(yù)涂玻璃載玻片。該玻璃載玻片具有許多陰離子基團(tuán)，并且載玻片上涂了含許多陽(yáng)離子基團(tuán)的非-肽聚合涂料。預(yù)涂玻璃載玻片具有電荷密度，這樣當(dāng)曙紅Y染料吸附在有涂層的載玻片上且之后經(jīng)歷542納米波長(zhǎng)的電磁輻射時(shí)，染料顯示至少約0.05的吸收度，其表示涂覆玻璃載玻片的聚合涂料上的最低可接受的電荷密度(即，過(guò)量正電荷)。優(yōu)選，吸收度為至少約0.1。最優(yōu)選，吸收度為至少約0.15。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，基材的選擇可影響吸附在用于涂覆基材的涂料上的染料的測(cè)量吸收度。因此，如果根據(jù)本發(fā)明使用玻璃載玻片之外的基材，則吸收度值可在上面提供的范圍內(nèi)變化。雖然如此，正如先前注釋的，根據(jù)本發(fā)明涂覆的基材表現(xiàn)出的吸收度比不是根據(jù)本發(fā)明方法涂覆的相同基材表現(xiàn)出的吸收度大至少約2倍，優(yōu)選大至少約3倍，最優(yōu)選大至少約4倍。
固定在用聚合涂料涂覆的基材上的樣品可以是具有能夠與聚合涂料的陽(yáng)離子基團(tuán)相互作用的陰離子基團(tuán)且由此被固定其上的任何樣品。優(yōu)選，該樣品包含生物組分。用于固定在根據(jù)本發(fā)明的有涂層的基材上的生物樣品的例子包括，但不限于，細(xì)胞、組織、流體、核酸，包括多核苷酸及寡核苷酸(例如，DNA、RNA及其片段)、多肽和蛋白質(zhì)。
在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將單層的生物樣品固定在用聚合涂料涂覆的基材上。短語(yǔ)“單層”是指在有涂層的基材上僅沉積并固定一層物質(zhì)。因此，除了生物樣品外(特別是在生物樣品上)，沒(méi)有其它層被固定在上面，如其它層將阻礙觀察并妨礙分析直接固定在基材上的聚合涂料上的生物樣品。
生物樣品可被固定在有涂層的基材上用于多種用途。優(yōu)先地，該用途為診斷用途。例如，生物樣品可被固定用于從較大樣品中提取目的，用于另外處理或測(cè)試，并用于各種分析方法。有涂層的基材用途的具體的、非限制性例子包括，組織微陣列(TMA)，細(xì)胞微陣列(CMA)、核酸微陣列及其它細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)診斷工具。除了這類具體用途外，本發(fā)明的預(yù)涂基材還可用于固定人工或自動(dòng)化診斷測(cè)定試劑盒的各種生物樣品。
本發(fā)明的預(yù)涂基材可用于多種診斷方法中。例如，預(yù)涂基材可用于固定對(duì)特定蛋白是選擇性的抗體。在另一個(gè)例子中，預(yù)涂基材可用于固定反應(yīng)性底物，其特別適用于分離特定蛋白，該特定蛋白是能夠作用于反應(yīng)性底物的酶。其它類似的診斷用途也包括在本發(fā)明內(nèi)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種預(yù)涂珠。優(yōu)選，該預(yù)涂珠適于從樣品中提取生物組分。本實(shí)施方案中珠具有表面，該表面包含許多能夠與非-肽聚合涂料的陽(yáng)離子基團(tuán)相互作用的陰離子基團(tuán)，如上所述。因此，珠具有覆蓋在珠表面上并與珠表面離子性連接的非-肽聚合涂料。因此有涂層的珠具有許多暴露的陽(yáng)離子基團(tuán)，用于與樣品中目標(biāo)生物組分的陰離子基團(tuán)相互作用。然后，生物樣品可被固定在珠表面并從樣品中提取。
預(yù)涂珠優(yōu)先包含選自玻璃、聚合物、二氧化硅、金屬、金屬氧化物和陶瓷的材料。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，珠含有聚合物，該聚合物選自聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚氨酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚二烷基硅氧烷、纖維素、它們的衍生物、它們的共聚物和它們的組合。
根據(jù)本發(fā)明的預(yù)涂珠可用于多種提取和分離方法中，如先前所述和本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易預(yù)想到的。例如，預(yù)涂珠可用于各種色譜分離方法中。此外，可將預(yù)涂珠摻入到樣品中并選擇性除去以從其中提取生物組分。
當(dāng)然，本發(fā)明還包括多個(gè)其它實(shí)施方案，其中本文所述預(yù)涂基材可用于診斷方法中，并且發(fā)明不受目前公開(kāi)內(nèi)容的限制。例如，前文已經(jīng)描述了其中的預(yù)涂基材是顯微鏡載玻片的實(shí)施方案。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種分析生物樣品的方法。該方法通常包括提供適于固定生物樣品的預(yù)涂基材，其中該基材上涂了本文所述的聚合涂料涂覆，將生物樣品固定在該預(yù)涂基材上，并分析固定在預(yù)涂基材上的生物樣品。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，分析固定在預(yù)涂載玻片上的生物樣品的步驟是通過(guò)使用診斷儀器進(jìn)行的，然而，本發(fā)明還預(yù)期了由個(gè)體在不借助于其它儀器操作(即，僅通過(guò)利用感覺(jué))的情況下，分析固定的樣品。適用于分析根據(jù)本發(fā)明方法的固定樣品的診斷儀器的例子包括，但不限于，顯微鏡(如光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡)、色譜儀、分光計(jì)和成像裝置(如數(shù)字照相機(jī)、攝像機(jī)和電荷耦合裝置(CCD)照相機(jī))。
本發(fā)明還包括各種實(shí)施方案，其中本發(fā)明的預(yù)涂基材具有診斷用途以外的用途，如先前所述。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種適用于采集一種或多種生物污染物的器具。在該實(shí)施方案中，如前，基材包含具有許多陰離子基團(tuán)的材料，并涂了非-肽聚合涂料。該實(shí)施方案中特別優(yōu)選的實(shí)施方案是，基材包含纖維材料。該纖維材料可以是天然或合成的且可以是紡織或無(wú)紡的。適用作生物污染物采集器具的纖維材料的非-限制性例子包括棉、纖維素和聚乙烯。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物污染物采集器具選自紗布、毛巾和醫(yī)用布單。因此，該生物污染物采集器具可用于轉(zhuǎn)移樣品、用于醫(yī)學(xué)程序中，并且用于在其中它適用于收集或采集可能或已知的生物物質(zhì)以防止該生物物質(zhì)污染材料或區(qū)域的其它情形中。例如，生物污染物采集器具可用于支持其上具有DNA樣品的載玻片。因此，防止外來(lái)的DNA，如來(lái)自操作載玻片的個(gè)體，污染載玻片上的DNA樣品。相似地，污染物采集器具可在手術(shù)部位周圍使用，從而采集生物物質(zhì)以防止該物質(zhì)污染手術(shù)部位。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物污染物采集器具是手套，如手術(shù)用手套。該手套可由涂了上述聚合涂料的纖維材料構(gòu)成?？蛇x擇性地，該手套可由天然或合成聚合物構(gòu)成(例如，“橡膠”手套)。
根據(jù)下面的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例，更清楚地描述本發(fā)明的其它實(shí)施方案。
實(shí)驗(yàn)通過(guò)下列實(shí)施例更充分地舉例說(shuō)明本發(fā)明，提出實(shí)施例是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)將其解釋為限制本發(fā)明。
實(shí)施例1使用PDDA預(yù)涂玻璃顯微鏡載玻片在制備預(yù)涂玻璃顯微鏡載玻片中，制備PDDA的去離子水溶液，使溶液終濃度為1％PDDA(+/-0.05％)w/v。然后通過(guò)加入1N NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至9.0(+/-0.2)。
將調(diào)節(jié)過(guò)pH的PDDA溶液放在人工載玻片染色浴中。將玻璃顯微鏡載玻片裝在人工載玻片染色架上，并將具有玻璃顯微鏡載玻片的架加到浴中的PDDA溶液中，溶液覆蓋載玻片直到載玻片的磨砂邊緣。讓載玻片在PDDA溶液中放置約10秒鐘。將架從浴中取出，將載玻片從架上取下，并將載玻片以垂直、稍成角度的位置放置，并讓其在環(huán)境溫度下干燥。讓其上涂有PDDA溶液的載玻片干燥至目視干燥，然后用去離子水沖洗。再次讓沖洗過(guò)的載玻片干燥，提供現(xiàn)成用于分析陰離子樣品的有PDDA涂層的載玻片。
實(shí)施例2有PDDA涂層的顯微鏡載玻片與有PLL涂層的顯微鏡載玻片的比較制備PDDA溶液，并按照實(shí)施例1，使用該溶液涂覆多個(gè)玻璃顯微鏡載玻片。使用PREPSTAINTM載玻片涂層試劑(PLL)(得自TriPathImaging，Inc.)相似地涂覆多個(gè)另外的顯微鏡載玻片。
將有PDDA涂層的載玻片和有PLL涂層的載玻片各自分成兩組。一組有PDDA涂層的載玻片在環(huán)境溫度下貯存16周。同樣，一組有PLL涂層的載玻片在環(huán)境溫度下貯存16周。將第二組有PDDA涂層的載玻片和第二組有PLL-涂層的載玻片在環(huán)境溫度下貯存5周，并在45℃下再貯存9周，共貯存16周。在16周結(jié)束時(shí)，將所有四組載玻片從貯存處取出用于進(jìn)一步測(cè)試，如下所述。按照與先前所述相同的方法制備一組新制的有PLL涂層的載玻片，作為實(shí)驗(yàn)中的比較，用于與穩(wěn)定性組進(jìn)行比較。
使來(lái)自上述五組的各組載玻片經(jīng)歷單一池的細(xì)胞材料，隨后使用PREPSTAINTM方法染色。然后以與涂覆的表面粘附的細(xì)胞材料的量為基礎(chǔ)比較所有五組的載玻片。
注意到有PLL涂層的載玻片具有降低的穩(wěn)定性，該穩(wěn)定性隨時(shí)間和溫度而降低。這種穩(wěn)定性的降低可從存在于有PLL涂層的載玻片上的粘附和染色的細(xì)胞材料量的降低而明顯識(shí)別。在評(píng)價(jià)開(kāi)始的時(shí)候，使用PLL新鮮涂覆載玻片1(對(duì)照載玻片)并且它沒(méi)有經(jīng)受16周的測(cè)試。讓使用PLL涂覆的載玻片2在環(huán)境溫度下保持16周。載玻片2與載玻片1的比較顯示與載玻片2粘附的細(xì)胞材料染色較差，這表明聚合物涂層在16-周的時(shí)間內(nèi)降解。也涂了PLL的載玻片4在環(huán)境溫度下放置5周并在45℃下放置9周。該載玻片中的聚合物降解甚至更明顯。載玻片4的肉眼觀察顯示僅有少量細(xì)胞材料與載玻片表面粘附(即，幾乎沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的染色細(xì)胞材料)。
使用PDDA涂覆載玻片3并在環(huán)境溫度下貯存16周。使用PDDA涂覆載玻片5，在環(huán)境溫度下貯存5周，然后在45℃下貯存9周。載玻片3和5二者都顯示很少至沒(méi)有涂層降解。通過(guò)與有涂層的載玻片粘附的染色細(xì)胞材料的完全和均勻的分布，可很明顯看到這一點(diǎn)。此外，與新近涂覆的PLL對(duì)照載玻片(載玻片1)相比，PDDA載玻片，甚至在放置16周后，顯示涂層更深的染色，這表明與有PLL涂層的載玻片相比，有PDDA涂層的載玻片上聚合物(且因此陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn))的濃度增加。
實(shí)施例3使用不同涂覆方法涂覆的顯微鏡載玻片的比較根據(jù)本發(fā)明的方法和先前描述的方法，使用PDDA涂覆兩組顯微鏡載玻片。下面提供該載玻片固定能力的比較。
根據(jù)本發(fā)明，使用PDDA涂覆12個(gè)玻璃顯微鏡載玻片。具體而言，制備PDDA在去離子水中的0.25％(w/v)溶液，并使用NaOH調(diào)節(jié)pH至9.2的終pH。從購(gòu)自制造商的包裝中取出12個(gè)顯微鏡載玻片，并特別在使用PDDA溶液涂覆之前，不經(jīng)過(guò)任何清洗過(guò)程。接下來(lái)，將沒(méi)有清洗過(guò)的載玻片人工浸在PDDA溶液中，取出，讓其在環(huán)境溫度下干燥至目視干燥，然后用去離子水沖洗以除去任何殘留的PDDA。在使用前，讓沖洗過(guò)的載玻片干燥。
按照已知的制備方法制備另外12個(gè)顯微鏡載玻片，用于與本發(fā)明的有PDDA涂層的載玻片比較。首先，將新取自相同包裝和制造商的12個(gè)載玻片，按照Cras，J.J.等人Biosensors & Bioelectronics，14(1999)683-688公開(kāi)的方法2清洗。然后按照Seyfert，S.等人Biomaterials，16(1995)201-207提供的方法，使用1.0％PDDA水溶液涂覆清洗過(guò)的載玻片。具體而言，將清洗過(guò)的載玻片人工浸在1％PDDA溶液中，從溶液中取出，并立即沖洗以除去任何殘留的PDDA溶液(即，在沖洗之前沒(méi)有干燥涂層)。在使用之前，讓沖洗過(guò)的載玻片干燥。
為了制備用于顯微鏡載玻片固定的細(xì)胞樣品，獲得3瓶SiHa對(duì)照細(xì)胞(來(lái)自TriPath Imaging，Inc.)。實(shí)驗(yàn)中所用的SiHa細(xì)胞來(lái)自Friedl，F(xiàn).，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，135(1970)543-545中首先描述的單一細(xì)胞系。將3個(gè)瓶子的內(nèi)容物離心(800g，10分鐘)，以使細(xì)胞壓縮成顆粒狀物。棄去上清液，并將細(xì)胞重懸浮于去離子水中。然后通過(guò)離心(800g，10分鐘)將細(xì)胞再次壓縮成顆粒狀物。棄去上清液，并將細(xì)胞重懸浮于約30毫升去離子水中。將1毫升細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到24個(gè)圓錐形試管的每一管中，并按照標(biāo)準(zhǔn)方案，使用TriPath ImagingPREPSTAINTMSlide Processor儀器處理樣品(將樣品涂在載玻片上并染色)。
將載玻片染色并蓋上蓋玻片后，使用TriPath ImagingFOCALPOINTTMSlide Profiler評(píng)價(jià)載玻片。通過(guò)儀器計(jì)算各載玻片上的細(xì)胞數(shù)，并從儀器的數(shù)據(jù)庫(kù)中提取各顯微鏡載玻片的細(xì)胞計(jì)數(shù)(細(xì)胞數(shù)與通過(guò)Slide Profiler記錄的目標(biāo)數(shù)成正比)。
將各顯微鏡載玻片上的細(xì)胞樣品制備成具有1.3厘米(13毫米)已知直徑的均勻圓圈。因此，各載玻片上的樣品面積為1.33平方厘米(132.7平方毫米)。下面顯示了各載玻片上固定的細(xì)胞數(shù)。表1提供了根據(jù)本發(fā)明方法制備的載玻片上固定的細(xì)胞數(shù)，表2提供按照先前所述方法制備的載玻片上固定的細(xì)胞數(shù)。
表1

表2

使用Student’s t-分布對(duì)上面表1和表2中提供的細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行比較，揭示小于0.005的顯著性水平。因此，細(xì)胞計(jì)數(shù)說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明制備的有PDDA涂層的載玻片固定的平均細(xì)胞數(shù)大于按照先前已知方法制備的有PDDA涂層的載玻片，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。具體而言，本發(fā)明的有PDDA涂層的載玻片固定的平均細(xì)胞數(shù)較之按照先前已知方法制備的有PDDA涂層的載玻片上固定的平均細(xì)胞數(shù)多22.97％。
如上所注釋的，各載玻片上的細(xì)胞樣品面積為1.33平方厘米(132.7平方毫米)。因此，可計(jì)算已知表面面積上固定的平均細(xì)胞數(shù)。使用根據(jù)本發(fā)明制備的載玻片，每表面面積固定的平均細(xì)胞數(shù)為23,475個(gè)細(xì)胞/平方厘米(235.2個(gè)細(xì)胞/平方毫米)。相比之下，按照先前已知方法制備的載玻片每表面面積固定的平均細(xì)胞數(shù)僅為19,090個(gè)細(xì)胞/平方厘米(191.3個(gè)細(xì)胞/平方毫米)。
實(shí)施例4通過(guò)所吸附曙紅Y染料的UV吸收分析用PDDA涂覆的載玻片獲得15個(gè)ESCO顯微鏡載玻片(目錄號(hào)2951)。留出3個(gè)載玻片用作對(duì)照載玻片。將剩余的12個(gè)載玻片分為4組，每組3個(gè)載玻片。第1組載玻片使用pH約9.2的1％PDDA溶液涂覆。讓有涂層的載玻片干燥1小時(shí)，用去離子水沖洗，并讓其再干燥1小時(shí)。第2組載玻片使用pH約9.2的1％PDDA溶液涂覆。立即用去離子水沖洗有涂層的載玻片(沒(méi)有干燥PDDA涂層)，并讓沖洗過(guò)的載玻片干燥1小時(shí)。第3組載玻片使用pH約5.3的1％PDDA溶液涂覆。讓有涂層的載玻片干燥1小時(shí)，用去離子水沖洗，并讓其再干燥1小時(shí)。第4組載玻片用pH約5.3的1％PDDA溶液涂覆。立即用去離子水沖洗有涂層的載玻片(沒(méi)有干燥PDDA涂層)，并讓沖洗過(guò)的載玻片干燥1小時(shí)。沒(méi)有涂覆第5組載玻片(對(duì)照載玻片)。
制備上面5組中的所有載玻片以便下列處理，即將各載玻片放在Hettich顯微鏡載玻片-支架底部中，并把Hettich固定室放在載玻片上，以隔離一部分載玻片。使用去離子水中200微升5％w/v曙紅Y溶液處理各載玻片表面的隔離部分達(dá)1分鐘。真空抽吸除去染料溶液，并讓用2.5毫升去離子水處理各載玻片兩次，在真空抽吸除去之前，讓每次沖洗維持1分鐘。然后使用2.5毫升異丙醇處理各載玻片兩次，在真空抽吸除去之前，讓每次沖洗維持1分鐘。然后從載玻片支架中取出各載玻片，并讓其干燥至少10分鐘。使用染料處理的各載玻片具有約240平方毫米面積的圓形染色部分，圓形染色部分的中心距離載玻片的未經(jīng)磨砂的短端約17.5毫米。
使用UV-Vis分光光度計(jì)在542納米處進(jìn)行光譜分析。使用普通的、未處理的、沒(méi)有涂層的玻璃載玻片將儀器調(diào)零。測(cè)量的各載玻片的吸收度(在下面表6中提供)顯示了在沖洗之前沒(méi)有干燥聚合涂層的情況下涂覆的載玻片與通過(guò)本發(fā)明方法涂覆的那些之間的顯著性差異。有PDDA涂層的載玻片帶正電荷表面上吸附的曙紅Y比在使用去離子水沖洗之前，讓其在環(huán)境溫度下干燥約1小時(shí)的載玻片多得多。
表3

在沒(méi)有干燥的情況下涂覆的載玻片(第2組)與根據(jù)本發(fā)明方法涂覆的載玻片(第1組)(都在pH 9.2下)的直接比較表明，根據(jù)本發(fā)明制備的載玻片上的過(guò)量正電荷多約4.3(+/-0.8)倍。相似地，在沒(méi)有干燥的情況下涂覆的載玻片(第4組)與根據(jù)本發(fā)明方法涂覆的載玻片(第3組)(都在pH 5.3下)的直接比較表明，根據(jù)本發(fā)明制備的載玻片上的過(guò)量正電荷多約4.7(+/-3.0)倍。玻璃本身對(duì)曙紅Y染料吸附的貢獻(xiàn)忽略不計(jì)，正如沒(méi)有涂層的載玻片(對(duì)照載玻片)的接近-零的吸收值所顯示的那樣。因此可以將曙紅Y染料的吸附僅僅歸于載玻片上涂覆的PDDA所攜帶的正電荷。
本文提出的發(fā)明所涉及的領(lǐng)域中的技術(shù)人員將會(huì)想到這些發(fā)明的許多改進(jìn)及其它實(shí)施方案，其具有先前描述中提供的教導(dǎo)的益處。因此，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所公開(kāi)的具體實(shí)施方案，改進(jìn)及其它實(shí)施方案也被包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。雖然本文中使用了特定的術(shù)語(yǔ)，但僅在一般且描述性意義上，而不是為限制的目的使用它們。
權(quán)利要求
1.一種制備適于固定生物樣品的有涂層的基材的方法，該方法包括提供一種具有表面的基材，該表面含有許多陰離子基團(tuán)；使所述基材與含有非-肽聚合材料溶液的組合物接觸，該溶液具有至少約6的pH，以在所述基材的至少一部分表面上形成非-肽聚合材料的涂層；干燥所述非-肽聚合材料的涂層；并且任選沖洗其上具有非-肽聚合材料的干燥涂層的基材。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述溶液pH為約8至約14。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在環(huán)境溫度下進(jìn)行所述干燥有涂層的基材的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述干燥有涂層的基材的步驟進(jìn)行約5分鐘至約1小時(shí)的一段時(shí)間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在約35℃至約120℃的溫度下進(jìn)行所述干燥有涂層的基材的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述干燥有涂層的基材的步驟進(jìn)行約1分鐘至約20分鐘的一段時(shí)間。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述基材選自載玻片、平板、珠、試管、比色皿、浸漬片、拭子和紗布。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述基材是顯微鏡載玻片。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述載玻片包括選自玻璃、陶瓷和聚合物材料的材料。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述載玻片包含聚合物，該聚合物選自聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸羥基酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、氟化乙烯、聚二甲基硅氧烷、它們的共聚物或三元共聚物及它們的組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述非-肽聚合材料包含至少一種單體，該單體選自二烯丙基二甲銨、烯丙胺、甲基丙烯酰氨基丙基三甲銨、丙烯酰胺、丙烯酸、異丁烯酰氧基乙基三甲銨、4-乙烯基-芐基三甲銨、甲基丙烯酸、丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、4-乙烯基吡啶、4-乙烯基-1-甲基吡啶、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸二甲氨基乙酯、氯化丙烯酸二甲氨基乙酯甲基季銨鹽、二甲氨基丙基丙烯酰胺、氯化二甲氨基丙基丙烯酰胺甲基季銨鹽、丙烯酰氧乙基二甲基芐銨、丙烯酰氧乙基三甲銨、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酰氧乙基二甲銨、甲基丙烯酰氧乙基三甲基芐銨、乙烯、乙烯亞胺、丙烯、苯乙烯、氯乙烯、異丁烯、三甲基-2-甲基丙烯酰乙銨、三甲基-2-甲基丙烯?；被@和它們的混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述非-肽聚合材料包含聚合物，該聚合物選自烯丙基型聚合物、乙烯基型聚合物和它們的混合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述非-肽聚合材料包含聚二烯丙基二甲銨。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述非-肽聚合材料包含聚烯丙胺。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述非-肽聚合材料包含二烯丙基二甲銨與至少一種其它單體的共聚物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述非-肽聚合涂料以濃度為約0.01％(w/v)至約10％(w/v)的溶液形式存在。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述非-肽聚合涂料以濃度為約0.15％(w/v)至約0.75％(w/v)的溶液形式存在。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述非-肽聚合涂料具有至少約75,000道爾頓的平均分子量。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述非-肽聚合涂料具有約400,000道爾頓至約500,000道爾頓的平均分子量。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在使所述基材與非-肽聚合材料的溶液接觸之前，該基材表面沒(méi)有經(jīng)受清洗過(guò)程。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中在使所述基材與非-肽聚合材料的溶液接觸之前，該基材表面沒(méi)有經(jīng)受摻入酸、堿或有機(jī)溶劑的清洗過(guò)程。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，在使所述基材與非-肽聚合材料的溶液接觸之前，該基材表面沒(méi)有經(jīng)受硅烷化過(guò)程。
23.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法制備的預(yù)涂基材。
24.一種適于固定生物樣品以便分析的預(yù)涂基材，該基材包含表面，該表面具有許多陰離子基團(tuán)，其中該基材上涂了含有許多陽(yáng)離子基團(tuán)的非-肽聚合材料，并且其中當(dāng)預(yù)涂基材與1毫升來(lái)自SiHa細(xì)胞系的細(xì)胞懸浮液接觸時(shí)，該預(yù)涂基材表面每表面面積能夠固定的平均細(xì)胞數(shù)為至少約20,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的預(yù)涂基材，其中當(dāng)預(yù)涂基材與1毫升來(lái)自SiHa細(xì)胞系的細(xì)胞懸浮液接觸時(shí)，該預(yù)涂基材表面每表面面積能夠固定的平均細(xì)胞數(shù)為至少約22,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的預(yù)涂基材，其中當(dāng)預(yù)涂基材與1毫升來(lái)自SiHa細(xì)胞系的細(xì)胞懸浮液接觸時(shí)，該預(yù)涂基材表面每表面面積能夠固定的平均細(xì)胞數(shù)為至少約23,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米。
27.根據(jù)權(quán)利要求24的預(yù)涂基材，其中該基材選自載玻片、平板、珠、試管、比色皿、浸漬片、拭子和紗布。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的預(yù)涂基材，其中該基材是顯微鏡載玻片。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的預(yù)涂基材，其中所述載玻片包含選自玻璃、陶瓷和聚合物材料的材料。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的預(yù)涂基材，其中所述載玻片包含聚合物，該聚合物選自聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸羥基酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、氟化乙烯、聚二甲基硅氧烷、它們的共聚物和它們的組合。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的預(yù)涂基材，其中所述非-肽聚合材料包含至少一種單體，該單體選自二烯丙基二甲銨、烯丙胺、甲基丙烯酰氨基丙基三甲銨、丙烯酰胺、丙烯酸、異丁烯酰氧基乙基三甲銨、4-乙烯基-芐基三甲銨、甲基丙烯酸、丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、4-乙烯基吡啶、4-乙烯基-1-甲基吡啶、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸二甲氨基乙酯、氯化丙烯酸二甲氨基乙酯甲基季銨鹽、二甲氨基丙基丙烯酰胺、氯化二甲氨基丙基丙烯酰胺甲基季銨鹽、丙烯酰氧乙基二甲基芐銨、丙烯酰氧乙基三甲銨、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酰氧乙基二甲銨、甲基丙烯酰氧乙基三甲基芐銨、乙烯、乙烯亞胺、丙烯、苯乙烯、氯乙烯、異丁烯、三甲基-2-甲基丙烯酰乙銨、三甲基-2-甲基丙烯酰基氨基丙銨和它們的混合物。
32.根據(jù)權(quán)利要求28的預(yù)涂基材，其中所述在載玻片上涂覆的非-肽聚合涂料具有約0.005微米至約500微米的層厚度。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的預(yù)涂基材，其中所述在載玻片上涂覆的非-肽聚合涂料具有約1微米至約50微米的層厚度。
34.根據(jù)權(quán)利要求24的預(yù)涂基材，其中所述非-肽聚合材料包含選自烯丙基型聚合物、乙烯基型聚合物和它們的混合物的聚合物。
35.根據(jù)權(quán)利要求24的預(yù)涂基材，其中所述非-肽聚合材料包含聚二烯丙基二甲銨。
36.根據(jù)權(quán)利要求24的預(yù)涂基材，其中所述非-肽聚合材料包含聚烯丙胺。
37.根據(jù)權(quán)利要求24的預(yù)涂基材，其中所述非-肽聚合材料包含二烯丙基二甲銨與至少一種其它單體的共聚物。
38.根據(jù)權(quán)利要求24的預(yù)涂基材，其中所述非-肽聚合材料具有至少約75,000道爾頓的平均分子量。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的預(yù)涂基材，其中所述非-肽聚合材料具有約400,000道爾頓至約500,000道爾頓的平均分子量。
40.根據(jù)權(quán)利要求28的預(yù)涂基材，其中所述載玻片特別適于固定用于分析生物樣品，該生物樣品選自DNA樣品、多肽樣品、流體樣品、細(xì)胞樣品、核苷酸樣品、組織微陣列、細(xì)胞微陣列和核酸微陣列。
41.根據(jù)權(quán)利要求24的預(yù)涂基材，其中將在基材上涂覆的非-肽聚合材料以溶液形式應(yīng)用到該基材上，其中該非-肽聚合材料以約0.01％(w/v)至約10％(w/v)的濃度存在。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的預(yù)涂基材，其中所述非-肽聚合材料以約0.15％(w/v)至約0.75％(w/v)的濃度存在。
43.一種分析生物樣品的方法，該方法包括提供適于固定生物樣品的預(yù)涂基材，該基材包含具有許多陰離子基團(tuán)的表面，其中用含有許多陽(yáng)離子基團(tuán)的非-肽聚合涂料涂覆該基材，并且其中當(dāng)預(yù)涂基材與1毫升來(lái)自SiHa細(xì)胞系的細(xì)胞懸浮液接觸時(shí)，該預(yù)涂基材表面每表面面積能夠固定的平均細(xì)胞數(shù)為至少約20,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米；將生物樣品應(yīng)用到預(yù)涂基材上，以使該生物樣品固定到所述基材上；并且分析固定在預(yù)涂基材上的生物樣品。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述分析步驟包括使用選自顯微鏡、色譜儀、分光計(jì)和成像裝置的診斷儀器。
45.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述生物樣品選自細(xì)胞、組織、流體、核酸、多核苷酸、寡核苷酸、多肽和蛋白質(zhì)。
46.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述基材適于固定用于分析生物樣品，該生物樣品選自DNA樣品、多肽樣品、流體樣品、細(xì)胞樣品、核苷酸樣品、組織微陣列、細(xì)胞微陣列和核酸微陣列。
47.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中將在基材上涂覆的非-肽聚合材料以溶液形式應(yīng)用到所述基材上，其中該非-肽聚合材料以約0.01％(w/v)至約10％(w/v)的濃度存在。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的預(yù)涂基材，其中所述非-肽聚合材料以約0.15％(w/v)至約0.75％(w/v)的濃度存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適于固定樣品的預(yù)涂基材，如載玻片。本發(fā)明還提供制備這類預(yù)涂基材的方法和分析被固定在這類預(yù)涂基材上的生物樣品的方法。該基材上涂了聚陽(yáng)離子聚合涂料，特定選擇該聚陽(yáng)離子聚合涂料，使得有涂層的基材表現(xiàn)出增加的穩(wěn)定性和延長(zhǎng)的貯存期。優(yōu)選的聚合涂料包括其上具有陽(yáng)離子基團(tuán)且具有僅小百分比的肽單體鍵的烯丙基型或乙烯基型聚合物，特別是聚二烯丙基二甲銨(PDDA)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101048663SQ200580036907
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2005年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月23日
發(fā)明者W·A·福克斯, W·C·雷三世 申請(qǐng)人:三路影像公司