專(zhuān)利名稱(chēng)：新治療蛋白質(zhì)和靶標(biāo)e2－epf5的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抑制VEGF-依賴性血管形成(特別是腫瘤相關(guān)的血管形成)的治療方法和藥物組合物。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)編碼響應(yīng)人腫瘤中觀察到的多種血管應(yīng)答(包括刺激新血管突起及其透化作用)的蛋白質(zhì)。VEGF對(duì)于多數(shù)實(shí)體瘤血管生成的生成是必需的，且VEGF表達(dá)的組成型上調(diào)被看作腫瘤血管發(fā)生的主要貢獻(xiàn)者。
VEGF和若干其他血管生成生長(zhǎng)因子的表達(dá)被低氧精密調(diào)控，涉及轉(zhuǎn)錄因子HIF-1(低氧誘導(dǎo)因子-1)對(duì)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)。低氧是組織氧張力內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的正常水平的降低，并在急性和血管疾病、肺部疾病和癌癥中發(fā)生。例如，腫瘤細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)HIF-1適應(yīng)低氧。HIF-1介導(dǎo)對(duì)組織氧合變化的適應(yīng)性反應(yīng)并激活涉及多個(gè)過(guò)程的多基因轉(zhuǎn)錄，所述過(guò)程包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、侵入和轉(zhuǎn)移、程序性細(xì)胞死亡、血管發(fā)生、葡萄糖和鐵代謝。Hif-1在眾多人類(lèi)癌癥中過(guò)表達(dá)，并與預(yù)后不良和提高的患者死亡率相關(guān)。最近的研究指出基于低氧、癌基因激活和突變，HIF-1介導(dǎo)對(duì)化學(xué)療法和輻射的抗性。因此抑制HIF-1活性可代表血管生成抑制療法的重要組成部分。
E2-EPF5是泛蛋白綴合酶(E2)家族的成員，其將泛蛋白綴合至細(xì)胞蛋白質(zhì)上。泛蛋白和泛蛋白樣改性物被機(jī)制保守的酶級(jí)聯(lián)加工并附著于底物蛋白質(zhì)上，所述酶級(jí)聯(lián)包括泛蛋白激活酶(E1)、泛蛋白綴合酶(E2或UBC)和泛蛋白連接酶(E3)。這類(lèi)修飾具有不同的功能，其最佳表征為經(jīng)由26S蛋白酶體途徑的泛蛋白依賴性蛋白降解。E2和E3合作將泛蛋白轉(zhuǎn)移至靶蛋白從而確定底物特異性。盡管可供使用的人基因組序列使得完成泛蛋白家族成員(包括E2、E3和去泛蛋白化蛋白酶)的鑒定成為可能，但只有一些泛蛋白化底物被鑒定，且對(duì)泛蛋白系統(tǒng)及其與人類(lèi)疾病的關(guān)系的理解仍然處于初期。然而存在越來(lái)越多的證據(jù)表明泛蛋白和泛蛋白樣分子對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)的修飾是多種生物過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，特別是細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞分化和DNA修復(fù)。
本發(fā)明目前提供了泛蛋白綴合酶E2-EPF5在低氧和(特別是)在低氧應(yīng)答中由轉(zhuǎn)錄因子HIF-1調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)形成中的新作用。
發(fā)明概述本發(fā)明首先提供了用于治療與異常新血管發(fā)生有關(guān)疾病的方法，其包括施用有效量的抑制泛蛋白綴合酶E2-EPF5編碼基因表達(dá)或抑制E2-EPF5基因產(chǎn)物活性的物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，新血管發(fā)生為腫瘤中的血管發(fā)生、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的滑膜血管發(fā)生、糖尿病性視網(wǎng)膜病變中觀察到的眼新血管形成、牛皮癬中的皮膚血管發(fā)生或肝硬化中低氧誘導(dǎo)的血管發(fā)生。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，新血管形成為VEGF依賴性腫瘤血管發(fā)生。
本發(fā)明的一個(gè)方面，該物質(zhì)為能夠特異抑制泛蛋白綴合酶E2-EPF5的抑制性核酸，優(yōu)選反義寡核苷酸化合物，更優(yōu)選siRNA化合物。在本發(fā)明的另一方面，該物質(zhì)為與泛蛋白綴合酶E2-EPF5特異性結(jié)合的抗體。
另一方面，本發(fā)明涉及包含有效量物質(zhì)的藥物組合物，所述物質(zhì)抑制泛蛋白綴合酶E2-EPF5編碼基因的表達(dá)或抑制E2-EPF5基因產(chǎn)物的活性。E2-EPF5抑制劑優(yōu)選為反義寡核苷酸或siRNA或特異性結(jié)合E2-EPF5的抗體。
另一方面，本發(fā)明涉及鑒定可用于治療VEGF依賴性血管形成的化合物的方法，所述方法包括(a)使E2-EPF5多肽和測(cè)試化合物接觸(b)檢測(cè)E2-EPF5生物活性的改變。優(yōu)選E2-EPF5生物活性降低。
另一方面，本發(fā)明涉及用于減少一種或多種在低氧應(yīng)答中被HIF-1調(diào)節(jié)的多肽數(shù)量或抑制其活性的方法，其包括抑制泛蛋白綴合相關(guān)酶E2-EPF5的表達(dá)。優(yōu)選地，HIF-1調(diào)節(jié)的基因或蛋白質(zhì)選自GLUT-1、GLUT-3、HK2、EPO、NOS2、VEGF、TGF-α、TGF-β、VEGFR-2、C-Met、UPAR、CXCR4、碳酸酐酶IX(CAIX)。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)泛蛋白綴合酶E2-EPF5涉及在低氧應(yīng)答中HIF-1依賴性蛋白質(zhì)的表達(dá)。具體的，發(fā)現(xiàn)E2-EPF5的抑制涉及低氧應(yīng)答中VEGF的形成。前血管發(fā)生VEGF對(duì)組成第一血管的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移是必需的。VEGF為具有廣泛活性的34-45kDa的糖蛋白，所述活性除促進(jìn)血管發(fā)生外還包括增強(qiáng)血管通透性——炎癥的重要特征。VEGF不僅作為內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，而且作用于若干其他細(xì)胞，包括HIV相關(guān)的卡波西肉瘤細(xì)胞和其他腫瘤與白血病細(xì)胞。贅生性細(xì)胞通常表達(dá)提高水平的VEGF，其不僅被認(rèn)為與刺激血管發(fā)生相關(guān)，而且與刺激增殖的自分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活相關(guān)。在該比較中，重要的是認(rèn)識(shí)到除了通過(guò)由VEGF受體起始的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的直接效應(yīng)外，VEGF還誘導(dǎo)間接效應(yīng)。例如，受體Notch1被VEGF上調(diào)，而VEGF又允許對(duì)該細(xì)胞表面受體的配體的應(yīng)答增強(qiáng)。VEGF表達(dá)與若干病理狀態(tài)相關(guān)，例如腫瘤血管發(fā)生、低氧相關(guān)的血管發(fā)生、若干類(lèi)型的失明(例如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、糖尿病增生性視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)的黃斑變性)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和創(chuàng)傷愈合等。大量研究表明，提高的VDGF水平足以獨(dú)自誘導(dǎo)新血管發(fā)生。例如已證明單獨(dú)注射VEGF增強(qiáng)局部缺血兔模型的側(cè)管發(fā)育(Takashita等人，1995 J；Clin.Invest.93，662)。VEGF注射進(jìn)角膜時(shí)也可誘導(dǎo)新血管發(fā)生。
本發(fā)明目前提供用于減少一種或多種HIF-1調(diào)節(jié)的多肽(特別是在低氧應(yīng)答中形成的VEGF)的數(shù)量或其活性。已知在低氧下由HIF-1調(diào)節(jié)的編碼多功能蛋白質(zhì)的大量基因，其包括但不僅限于GLUT-1、GLUT-3、HK2、CAIX(涉及例如代謝適應(yīng))；EPO、NOS2(涉及例如程序性細(xì)胞死亡抗性)；VEGF、TGF-α、TGF-β、VEGFR-2(涉及例如血管發(fā)生)、C-Met、UPAR、CXCR4(涉及例如腫瘤侵入、轉(zhuǎn)移)。術(shù)語(yǔ)“HIF-1調(diào)節(jié)的多肽”在本發(fā)明中包括其表達(dá)被轉(zhuǎn)錄因子HIF-1調(diào)控或影響(例如通過(guò)HIF-1與所述蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件結(jié)合)的任何蛋白質(zhì)或多肽。蛋白質(zhì)表達(dá)優(yōu)選被HIF-1轉(zhuǎn)錄因子的活性激活，即在HIF-1激活應(yīng)答中有更多蛋白質(zhì)表達(dá)。HIF-1是由三個(gè)α亞基(HIF-1α、HIF-2α或HIF-3α)之一和β-亞基(HIF-1β，也稱(chēng)為芳香烴核易位體，或ARNT)組成的異源二聚體。HIF-1b組成型表達(dá)，然而α亞基的表達(dá)高度受調(diào)節(jié)。對(duì)于任何其他蛋白質(zhì)，α亞基的水平由蛋白質(zhì)合成和蛋白質(zhì)降解的速率決定，HIF1α亞基的合成通過(guò)不依賴于氧的機(jī)制調(diào)節(jié)，而降解主要通過(guò)O2-依賴性的機(jī)制調(diào)節(jié)。因此，盡管α亞基基因基本連續(xù)地被轉(zhuǎn)錄和翻譯，由于通過(guò)蛋白酶體降解的快速破壞，α亞基蛋白質(zhì)保持在非常低的水平。該破壞在低氧條件下被抑制，且這是誘導(dǎo)HIF1a和依賴于該轉(zhuǎn)錄因子的基因的主要機(jī)制。
E2-EPF5編碼25kDa的II類(lèi)泛蛋白綴合酶，具有低序列復(fù)雜性的65個(gè)氨基酸長(zhǎng)的堿性C端延伸。E2-EPF5首先發(fā)現(xiàn)于患有稱(chēng)為地方性落葉性天皰瘡(EPF)的皮膚病的患者中(Liu等人，1992，JBC 267，15829)。隨后假設(shè)E2-EPF5功能性區(qū)別于其他表征的E2同功酶，因?yàn)槠渫ㄟ^(guò)賴氨酸殘基K11而非通過(guò)K48殘基催化多泛蛋白鏈的形成，這被認(rèn)為是介導(dǎo)蛋白水解事件的機(jī)制(Bach和Ostendorff，Trends in Biochemical Sciences(2003)，28(4)，189-195)。還發(fā)現(xiàn)E2-EPF5支持自動(dòng)泛蛋白化，這提示可能的E2-EPF5自動(dòng)調(diào)節(jié)模式。目前尚未報(bào)道E2-EPF5的底物，但其E2家族成員特有的高度堿性的羧基端延伸結(jié)構(gòu)域顯示對(duì)酸性蛋白質(zhì)的特異性(Liu等人，J Biol Chem.271，2817-2822)。E2-EPF5術(shù)語(yǔ)(生物學(xué)的)活性在本發(fā)明中除其泛蛋白相關(guān)活性外還涉及HIF-1介導(dǎo)的低氧調(diào)節(jié)基因誘導(dǎo)。
人E2-EPF5序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank Accession M91670，GI181915，SwissProt entry Q16763)。cDNA序列公布為SEQ ID NO1。氨基酸序列公布為SEQ ID NO2。然而術(shù)語(yǔ)E2-EPF5還包括任何保持本文所述的E2-EPF5生物活性的任何同源或直向同源序列、變體和片段。同源序列和參考序列之間的同源性百分比期望為至少80％，更期望為至少85％，優(yōu)選為至少90％，更優(yōu)選為至少95％，進(jìn)一步優(yōu)選為至少99％。序列比較使用Smith-Waterman序列比對(duì)算法(參見(jiàn)例如http//www-to.usc.edu/software/seqaln/index.html)進(jìn)行?！捌巍笔侵妇哂蠩2-EPF5的至少5、10、15個(gè)或任選地至少25、35或45個(gè)連續(xù)氨基酸的任何多肽分子。其他可能的片段包括催化位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域，其包含識(shí)別位點(diǎn)、泛蛋白結(jié)合位點(diǎn)、對(duì)亞基相互作用重要的位點(diǎn)和對(duì)進(jìn)行泛蛋白綴合酶其他功能重要的位點(diǎn)。這類(lèi)結(jié)構(gòu)域或基序可通過(guò)常規(guī)計(jì)算機(jī)化同源性檢索程序鑒定。片段可在例如功能性位點(diǎn)的一個(gè)或兩個(gè)方向延伸，以包含5、10、15、20、30、40、50或多至100個(gè)氨基酸。術(shù)語(yǔ)片段還包含例如E2-EPF5表位。E2-EPF5表位代表多肽上的位點(diǎn)，抗體針對(duì)其產(chǎn)生并與之結(jié)合。因此，包含E2-EPF5表位氨基酸序列的多肽可用于制造E2-EPF5多肽抗體。表位優(yōu)選包含至少5個(gè)，更優(yōu)選包含至少10、15、20或50個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的序列。
本發(fā)明的一方面提供用于治療異常新血管形成的方法，其包括施用有效量的抑制泛蛋白綴合相關(guān)酶E2-EPF5活性的物質(zhì)。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供抑制E2-EPF5活性的物質(zhì)用于制造藥物的用途，所述藥物用于治療涉及VEGF依賴性血管形成(特別是腫瘤血管發(fā)生)的病理狀態(tài)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“異常新血管形成”是指在健康生物中通常不發(fā)生并且涉及異?；蚣膊顟B(tài)的血管形成。異常新血管形成優(yōu)選被VEGF活性控制或影響，即“VEGF依賴性血管形成”。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，異常新血管形成為VEGF依賴性腫瘤血管發(fā)生。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“VEGF依賴性血管形成”是指VEGF刺激后的任何新血管產(chǎn)生，其包括但不僅限于腫瘤中的血管發(fā)生、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的滑膜血管發(fā)生、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和一些其他眼病中觀察到的眼新血管形成、牛皮癬中的皮膚血管發(fā)生或肝硬化中低氧誘導(dǎo)的血管發(fā)生。
另一方面本發(fā)明提供用于抑制細(xì)胞中HIF-1調(diào)節(jié)基因的方法，其包括抑制泛蛋白綴合相關(guān)酶E2-EPF5的表達(dá)或活性。HIF-1調(diào)節(jié)基因的抑制可例如通過(guò)泛蛋白依賴的蛋白質(zhì)降解(例如通過(guò)干涉HIF-1a蛋白質(zhì)的合成或穩(wěn)定性，或HIF-1a的反式激活作用)降低HIF-1的數(shù)量達(dá)到。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于降低HIF-1調(diào)節(jié)的多肽數(shù)量的方法，其包括抑制泛蛋白綴合相關(guān)酶E2-EPF5的表達(dá)或活性。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，HIF-1調(diào)節(jié)基因?yàn)閂EGF。因此，本發(fā)明還提供抗血管發(fā)生的方法。因此提供用于抑制血管發(fā)生(包括腫瘤血管發(fā)生)的方法，其包括抑制泛蛋白綴合相關(guān)酶E2-EPF5的表達(dá)或活性。
在基因表達(dá)或蛋白質(zhì)活性中，術(shù)語(yǔ)“抑制”是指基因表達(dá)或蛋白質(zhì)活性的降低。優(yōu)選與沒(méi)有抑制的表達(dá)或活性水平相比，該降低為至少20％，更優(yōu)選為至少50％、60％、70％、80％、90％或95％?；蚧虻鞍踪|(zhì)抑制可通過(guò)任何合適的技術(shù)完成。技術(shù)人員知道多種如何抑制基因表達(dá)或蛋白質(zhì)活性的方法和技術(shù)。例如，可通過(guò)RNA干擾或反義技術(shù)或使用干擾E2-EPF5功能的LMW化合物或通過(guò)任何降低泛蛋白綴合相關(guān)酶E2-EPF5的物質(zhì)抑制E2-EPF5。
抑制泛蛋白綴合相關(guān)酶E2-EPF5活性的物質(zhì)可以是降低E2-EPF5生物活性的任何物質(zhì)。該物質(zhì)可以例如抑制E2-EPF5基因表達(dá)或E2-EPF5的酶活性，可以誘導(dǎo)E2-EPF5多肽的降解或可以以任何其他方式干涉E2-EPF5的生物活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抑制劑為低分子量化合物或抑制性核酸或抗體。
本文認(rèn)為術(shù)語(yǔ)“抑制性核酸”是指能夠產(chǎn)生基因表達(dá)的基因特異性抑制的核酸化合物。一般的抑制性核酸包括但不僅限于反義寡核苷酸、三螺旋DNA、RNA適配子、核酶和siRNA。例如，核苷酸序列的知識(shí)可用于設(shè)計(jì)有效抑制泛蛋白綴合相關(guān)酶E2-EPF5表達(dá)的siRNA或反義分子。類(lèi)似地，可合成核酶以識(shí)別基因的特異核苷酸序列并將其切割。用于設(shè)計(jì)這類(lèi)用于定向抑制基因表達(dá)的分子的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
本發(fā)明的抑制性核酸化合物可通過(guò)常規(guī)方法在市售的自動(dòng)化DNA合成儀(例如Applied Biosystems(Foster City，CA)，型號(hào)為380B，392或394的DNA/RNA合成儀)或類(lèi)似設(shè)備上合成?？墒褂脕喠柞０坊瘜W(xué)。本發(fā)明的抑制性核酸化合物還可被例如核酸酶抗性主鏈(例如可使用許多參考文獻(xiàn)中描述的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)修飾。抑制性核酸的長(zhǎng)度必必須足以保證抑制生物活性。因此，例如在反義寡核苷酸情況下，其必須足夠大以保證特異性結(jié)合只在期望的靶多核苷酸而不在其他隨機(jī)位點(diǎn)發(fā)生。長(zhǎng)度的上限由若干因素決定，包括大于約30-40核苷酸長(zhǎng)度的合成和純化寡聚體的困難和費(fèi)用，大于較短寡核苷酸的較長(zhǎng)寡核苷酸對(duì)錯(cuò)配的耐受等。本發(fā)明的反義寡核苷酸優(yōu)選具有約15到40核苷酸的長(zhǎng)度。更優(yōu)選地，寡核苷酸部分具有約18到25核苷酸的長(zhǎng)度。雙鏈RNA(即正義反義RNA，也可稱(chēng)為小干擾RNA(siRNA)分子)也可用于抑制E2-EPF5核酸的表達(dá)。RNA干擾是施用外源的短RNA雙鏈體的方法，其中一條鏈對(duì)應(yīng)于靶mRNA的編碼區(qū)(Elbashir等人，Nature 2001，411494-498)。進(jìn)入細(xì)胞后，siRNA分子不僅引起外源RNA雙鏈體降解，還引起具有相同序列的單鏈RNA(包括外源信使RNA)降解。因此，siRNA比起傳統(tǒng)反義RNA方法更為有力和有效，因?yàn)樵摷夹g(shù)被認(rèn)為通過(guò)催化機(jī)制作用。優(yōu)選的siRNA分子一般是19到25個(gè)核苷酸長(zhǎng)，優(yōu)選約21個(gè)核苷酸長(zhǎng)并包含E2-EPF5核酸序列。將siRNA遞送至靶細(xì)胞的有效策略包括例如使用物理或化學(xué)轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)導(dǎo)。其他的siRNA可在細(xì)胞中表達(dá)，使用例如允許其功能性siRNA或前體轉(zhuǎn)錄的多種PolIII啟動(dòng)子表達(dá)盒表達(dá)。參見(jiàn)例如Scherr等人，Curr.Med.Chem.2003，10(3)245-256；Turki等人，Hum.Gene Ther.2002，13(18)2197-2201；Cornell等人，Nat.Struct.Biol.2003，10(2)91-92。本發(fā)明還涉及能夠介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的其他小RNA，例如微小RNA(miRNA)和短發(fā)夾RNA(shRNA)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，抑制泛蛋白綴合相關(guān)酶E2-EPF5活性的物質(zhì)為抗體。這類(lèi)抗體可包括但不僅限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)2片段、Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(anti-Id)抗體和任何上述的表位結(jié)合片段。本領(lǐng)域已知的多種過(guò)程可用于產(chǎn)生多克隆抗體。
本領(lǐng)域已知的多種過(guò)程可用于產(chǎn)生抗體。多克隆抗體為來(lái)自用抗原(例如靶基因產(chǎn)物或其抗原功能性衍生物)免疫的動(dòng)物血清的抗體分子異源群體。為了產(chǎn)生多克隆抗體，可通過(guò)注射補(bǔ)充有合適佐劑的E2-EPF5多肽、衍生物或片段來(lái)免疫宿主動(dòng)物。單克隆抗體為特定抗原抗體的同源群體，可通過(guò)提供用于通過(guò)培養(yǎng)連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)獲得。這些技術(shù)包括但不僅限于Kohler和Milstein，(1975，Nature 256495-497)的雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和EBV-雜交瘤技術(shù)。這類(lèi)抗體可以是任何免疫球蛋白類(lèi)型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亞類(lèi)。產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤可體外或體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)高效價(jià)mAb的產(chǎn)生使得其成為本發(fā)明優(yōu)選的生產(chǎn)方法。
另外，可使用開(kāi)發(fā)用于產(chǎn)生“嵌合抗體”(即，不同部分來(lái)自不同動(dòng)物物種的分子，例如具有來(lái)自小鼠mAb的可變或高變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些)的技術(shù)，所述技術(shù)將來(lái)自具有適當(dāng)?shù)目乖禺愋缘男∈罂贵w分子的基因與來(lái)自具有合適生物活性的人抗體分子的基因剪接產(chǎn)生嵌合抗體。另外，描述用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)可適用于產(chǎn)生E2-EPF5抗體。單鏈抗體通過(guò)氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段，產(chǎn)生單鏈多肽形成。這類(lèi)技術(shù)為本領(lǐng)域公知。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，E2-EPF5抗體為“人源化”抗體?？捎糜诋a(chǎn)生“人源化抗體”的技術(shù)可適用于產(chǎn)生本文公開(kāi)的E2-EPF5多肽、片段、衍生物和功能性等價(jià)物的抗體。這類(lèi)技術(shù)公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利5,932,448號(hào)；5,693,762號(hào)；5,693,761號(hào)；5,585,089號(hào)；5,530,101號(hào)；5,910,771號(hào)；5,569,825號(hào)；5,625,126號(hào)；5,633,425號(hào)；5,789,650號(hào)；5,545,580號(hào)；5,661,016號(hào)和5,770,429號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容完整引入本文作為參考。
識(shí)別特異E2-EPF5表位的抗體片段可通過(guò)已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，這類(lèi)片段包括但不僅限于可通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab′)2片段和可通過(guò)減少F(ab′)2片段二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段。另外，可構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)以允許快速簡(jiǎn)單地鑒定具有目的特異性的單克隆Fab片段。
E2-EPF5蛋白質(zhì)的合適抗體可獲自商業(yè)來(lái)源或根據(jù)常規(guī)方法產(chǎn)生。這類(lèi)抗體可包括但不僅限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fv片段、Fab片段、F(ab′)2片段、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(anti-Id)抗體和上述任何的表位結(jié)合片段。
可以使用多種抗體/免疫球蛋白骨架或支架，只要產(chǎn)生的多肽包含對(duì)E2-EPF5蛋白質(zhì)特異的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合區(qū)。這類(lèi)骨架或支架包括人免疫球蛋白的5種主要獨(dú)特型或其片段(例如在本文別處公開(kāi)的那些)，并包括其他動(dòng)物物種的免疫球蛋白，優(yōu)選具有人源化外觀的。例如從camelid鑒定的那些單一重鏈抗體在本文特別偏好。新的骨架、支架和片段繼續(xù)由本領(lǐng)域技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)。
另外，可使用非免疫球蛋白骨架和支架，只要它們包含與E2-EPF5蛋白質(zhì)特異的結(jié)合區(qū)。已知的非免疫球蛋白骨架或支架包括Adnectins(纖連蛋白)(Compound Therapeutics，Inc.，Waltham，MA)、錨蛋白(MolecularPartners AG，Zurich，瑞士)、結(jié)構(gòu)域抗體(Domantis，Ltd(Cambridge，MA)和Ablynx nv(Zwijnaarde，Belgium))、脂籠蛋白(Anticalin)(PierisProteolab AG，F(xiàn)reising，Germany)、小模塊式免疫藥物(TrubionPharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)、maxybodies(Avidia，Inc.(MountainView，CA))、A蛋白(Affibody AG，Sweden)和affilin(γ-晶體蛋白或泛蛋白)(Scil Proteins GmbH，Halle，Germany)。
根據(jù)本發(fā)明，不考慮使用的骨架或支架，抗E2-EPF5抗體或其片段，或包含E2-EPF5特異性結(jié)合區(qū)的多肽可與附加部分共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合。附加的部分可以是多肽、惰性多聚體如PEG、小分子、放射性同位素、金屬、離子、核酸或其他類(lèi)型的生物學(xué)相關(guān)分子。已知為免疫綴合物、免疫毒素等的這類(lèi)結(jié)構(gòu)也包括在本文使用的抗體、抗體片段或包含E2-EPF5特異性結(jié)合區(qū)的多肽的含義中。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，抑制劑為影響E2-EPF5表達(dá)或E2-EPF5多肽活性的小分子(例如分子量小于約2kDa的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子，更優(yōu)選分子量小于約1kDa的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子，和/或能夠穿過(guò)血腦屏障或進(jìn)入合適的細(xì)胞的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子)。這類(lèi)小分子化合物可通過(guò)下文所述篩選方法鑒定。
本發(fā)明一方面提供E2-EPF5基因和基因產(chǎn)物作為藥物靶標(biāo)，用于開(kāi)發(fā)治療患有如上所述疾病的個(gè)體的療法。因此，本文提供的，作為本發(fā)明一部分的是鑒定可用于治療本文所述疾病的化合物的篩選方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些方法包括將測(cè)試化合物與含有E2-EPF5多肽的反應(yīng)混合物接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，E2-EPF5為具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列可包含SwissProt entry Q16763中公開(kāi)的序列。然而，任何E2-EPF5同系物、直向同源物、變體以及這些多肽的融合構(gòu)建體(例如下文實(shí)施例中描述的融合構(gòu)建體)等可用于這些方法。例如，E2-EPF5多肽可具有基本上與SwissProt entry Q16763同源(例如至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)的氨基酸序列。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供E2-EPF5作為用于篩選適用于治療疾病的療法的新靶標(biāo)，所述疾病中VEGF依賴性血管發(fā)生(特別是腫瘤血管發(fā)生或眼血管形成或低氧誘導(dǎo)的血管發(fā)生)起一定的作用。本發(fā)明提供用于鑒定可用于抑制VEGF依賴性血管形成的化合物的方法，其包括(a)使E2-EPF5多肽和測(cè)試化合物接觸(b)檢測(cè)E2-EPF5生物活性的改變。通常用缺乏測(cè)試化合物的對(duì)照反應(yīng)檢測(cè)改變。本文使用的改變是指生物活性的提高或降低，優(yōu)選提高或降低至少10％、至少20％、至少30％、至少50％或至少100％。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于鑒定化合物的方法，所述化合物可用于治療涉及VEGF依賴性血管形成(例如腫瘤血管形成)的疾病，所述方法包括i)在具有E2-EPF5生物活性的樣品條件下，使測(cè)試化合物和E2-EPF5多肽接觸；ii)檢測(cè)所述至少一種E2-EPF5生物活性水平；iii)比較所述水平與缺乏所述測(cè)試化合物的對(duì)照樣品的水平；和任選地
iv)選擇引起所述水平改變的測(cè)試化合物，以進(jìn)一步檢測(cè)用于預(yù)防和/或治療VEGF依賴性血管形成相關(guān)疾病的化合物。
化合物篩選實(shí)驗(yàn)可包括基于細(xì)胞的或無(wú)細(xì)胞的系統(tǒng)。基于細(xì)胞的系統(tǒng)可以是天然的，即，通常表達(dá)泛蛋白綴合酶E2-EPF5的細(xì)胞來(lái)作為活組織檢查或細(xì)胞培養(yǎng)物擴(kuò)大。然而在一個(gè)實(shí)施方案中，基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)涉及表達(dá)泛蛋白綴合酶的重組宿主細(xì)胞。測(cè)定測(cè)試化合物與泛蛋白綴合酶E2-EPF5相互作用的能力還可包括測(cè)定與已知結(jié)合分子(例如泛蛋白)與多肽結(jié)合的能力相比測(cè)試化合物和多肽結(jié)合的優(yōu)先性。多肽可用于鑒定調(diào)節(jié)泛蛋白綴合活性的化合物。這類(lèi)化合物例如可提高或降低泛蛋白化的蛋白質(zhì)底物親和力，或泛蛋白化蛋白質(zhì)底物殘留。這類(lèi)化合物還可例如提高或降低對(duì)這些組分的結(jié)合率。這類(lèi)化合物還可與這些組分競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合泛蛋白綴合酶，或代替這些與泛蛋白綴合酶結(jié)合的組分。這類(lèi)化合物還可影響與其他組分(如ATP)、其他亞基(如E1激活酶或E3連接酶)的相互作用。
泛蛋白綴合酶E2-EPF5、其衍生物和片段可用于快速篩選方法如自動(dòng)化高通量篩選(HTS)以測(cè)試候選化合物與泛蛋白綴合酶結(jié)合的能力。大量合適的快速篩選測(cè)試為技術(shù)人員公知。
還可針對(duì)功能性泛蛋白綴合酶E2-EPF5篩選這些化合物以測(cè)定化合物對(duì)泛蛋白綴合酶E2-EPF5的影響?？设b定激活(激動(dòng)劑)或失活(拮抗劑)E2-EPF5至目的程度的化合物。調(diào)節(jié)方法可體外(例如通過(guò)將細(xì)胞與物質(zhì)一起培養(yǎng))或可選地體內(nèi)(例如對(duì)受試者施用物質(zhì))進(jìn)行。本發(fā)明的E2-EPF5多肽可用于篩選化合物刺激或抑制E2-EPF5蛋白質(zhì)和靶分子(其通常與E2-EPF5蛋白質(zhì)相互作用)之間相互作用的能力。靶標(biāo)可以是泛蛋白、泛蛋白化的底物或多聚泛蛋白或該途徑的另一組分，泛蛋白綴合酶蛋白質(zhì)通常與所述靶標(biāo)相互作用(例如E1或E3蛋白質(zhì))。測(cè)定包括步驟在允許E2-EPF5蛋白質(zhì)或其片段與靶分子相互作用的條件下結(jié)合E2-EPF5蛋白質(zhì)與候選化合物，并檢測(cè)E2-EPF5蛋白質(zhì)和靶標(biāo)之間復(fù)合物的形成或檢測(cè)E2-EPF5和靶標(biāo)相互作用的生物化學(xué)結(jié)果?？蓽y(cè)定泛蛋白綴合作用的任何關(guān)聯(lián)效應(yīng)。這包括泛蛋白化底物的產(chǎn)生、蛋白質(zhì)酶解、游離多聚泛蛋白的減少、底物的穩(wěn)定性。
測(cè)定泛蛋白綴合酶與靶分子的結(jié)合的能力還可使用如實(shí)時(shí)Bimolecular Interaction Analysis(BIA)技術(shù)完成。本文使用的“BIA”(例如BIAcore)是用于研究實(shí)時(shí)生物特異性相互作用的技術(shù)，不用標(biāo)記任何相互作用物。表面等離振子共振(SPR)光學(xué)現(xiàn)象的改變可用作生物分子之間實(shí)時(shí)相互作用的指征。本發(fā)明的測(cè)試化合物可使用本領(lǐng)域已知的組合文庫(kù)法的多種途徑中的任一個(gè)獲得，所述途徑包括生物文庫(kù)、空間可定位平行固相或溶解相文庫(kù)、必需去褶合的合成文庫(kù)法、“一珠一化合物”文庫(kù)法和使用親和層析選擇的合成文庫(kù)法。生物文庫(kù)法限于多肽文庫(kù)，而其他四種方法適用于多肽、非肽寡聚體或化合物的小分子文庫(kù)(Lam，K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12145)。用于合成分子文庫(kù)的方法的實(shí)例可參見(jiàn)本領(lǐng)域例如DeWitt等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)906909；Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)9111422；Zuckermann等人(1994).J.Med.Chem.372678；Cho等人(1993)Science 2611303；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061和Gallop等人(1994)J.Med.Chem.371233。化合物文庫(kù)可存在于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques13412-421)或珠上(Lam(1991)Nature 35482-84)、芯片上(Fodor(1993)Nature 364555-556)、細(xì)菌中(Ladner美國(guó)專(zhuān)利5,223,409號(hào))、孢子中(Ladner美國(guó)專(zhuān)利′409號(hào))、質(zhì)粒中(Cull等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)891865-1869)或噬菌體上(Scott和Smith(1990)Science 249386-390)；(Devlin(1990)Science 249404-406)；(Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.976378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222301-310)；(上文Ladner)。候選化合物包括，例如1)肽如可溶性肽，包括Ig尾融合肽和隨機(jī)肽文庫(kù)成員(參見(jiàn)例如Lam等人(1991)Nature 35482-84；Houghten等人(1991)Nature 35484-86)和由D-和/或L-構(gòu)型氨基酸組成的組合化學(xué)衍生分子文庫(kù)；2)磷酸肽(例如隨機(jī)和部分降解的定向磷酸肽文庫(kù)，參見(jiàn)例如Songyang等人(1993)Cell 72767-778)；3)抗體(例如多克隆、單克隆、人源化、抗獨(dú)特型、嵌合和單鏈抗體以及Fab、F(ab′)2、Fab表達(dá)文庫(kù)片段和抗體的表位結(jié)合片段)；和4)小有機(jī)和無(wú)機(jī)分子(例如獲自組合和自然產(chǎn)物文庫(kù)的分子)。
用于測(cè)量泛蛋白綴合相關(guān)酶活性的合適測(cè)定為本領(lǐng)域公知。這些測(cè)定包括但不僅限于底物的情況(包括多聚泛蛋白或泛蛋白化的底物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)殘余數(shù)量的提高)、中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物的情況(例如游離泛蛋白單體的消失)、一般的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、特異蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、泛蛋白結(jié)合、對(duì)泛蛋白化底物蛋白質(zhì)的結(jié)合、亞基相互作用、與ATP的相互作用、與細(xì)胞組分如反式作用調(diào)節(jié)因子的相互作用、特異蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等。
一方面，提供根據(jù)本發(fā)明篩選方法鑒定的化合物。這類(lèi)化合物優(yōu)選為低分子量化合物或抗體，特別是單克隆抗體或抑制性核酸。化合物優(yōu)選具有抗血管發(fā)生活性，即它們抑制一般血管生長(zhǎng)，特別是抑制異常新血管形成?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定這種抗血管發(fā)生活性。這些方法包括如腫瘤中的血管發(fā)生的顯微鏡評(píng)估、體內(nèi)基質(zhì)膠遷移和血管發(fā)生測(cè)定、血管發(fā)生的藻酸鹽微珠釋放測(cè)定、圓盤(pán)血管發(fā)生測(cè)定、血管發(fā)生的海綿植入體模型、腫瘤血管發(fā)生的空心纖維測(cè)定或血管發(fā)生的角膜測(cè)定。這類(lèi)測(cè)定描述于例如“Angiogenesis Protocols”，2001年3月，ISBN0-89603-698-7，SeriesMethods in Molecular Medicine，第46卷。
為了開(kāi)發(fā)血管發(fā)生和抗血管發(fā)生策略，已經(jīng)進(jìn)行了一致的努力以提供用于對(duì)體內(nèi)血管發(fā)生進(jìn)行更量化分析的動(dòng)物模型。體內(nèi)技術(shù)包括眼內(nèi)角膜袋andiris植入體、兔耳窗、背皮褶窗、顱窗、倉(cāng)鼠頰囊窗、海綿植入體測(cè)定、纖維蛋白凝塊、藻酸鈉珠和基質(zhì)膠塞、大鼠腸系膜窗、雞胚絨毛膜尿囊膜，以及小鼠和大鼠氣囊(1)。在這一章節(jié)中我們將討論無(wú)血管角膜測(cè)定以及在不同物種中使用該測(cè)定的優(yōu)缺點(diǎn)。角膜測(cè)定基于將血管發(fā)生誘導(dǎo)物(腫瘤組織、細(xì)胞懸液、生長(zhǎng)因子)放入角膜袋，以引發(fā)來(lái)自位于外周的緣(limbal)血管系統(tǒng)的血管生長(zhǎng)。與其他體內(nèi)測(cè)定相比，該測(cè)定具有僅測(cè)量新血管的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榻悄ぷ畛跏菬o(wú)血管的。
本發(fā)明另一方面涉及為了上文討論的任何療效而施用與可藥用載體結(jié)合的藥物組合物。這些藥物組合物包含有效劑量的物質(zhì)，所述物質(zhì)抑制編碼泛蛋白綴合酶E2-EPF5的基因的表達(dá)或抑制E2-EPF5基因產(chǎn)物的活性。它們可以包含如本發(fā)明泛蛋白綴合酶E2-EPF5的抗體、模擬體、激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制性核酸。組合物可以單獨(dú)施用或者與至少一種其他物質(zhì)(如穩(wěn)定化合物)組合施用，所述組合物可以在任何無(wú)菌的生物相容性可藥用載體中施用，其包括但不僅限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖和水?？梢詫?duì)患者單獨(dú)施用組合物，或者與其他物質(zhì)、藥物或激素組合。
本發(fā)明包括的藥物組合物可以以任何數(shù)目的途徑給藥，其包括但不僅限于口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸、局部、舌下或直腸方法。
除了活性成分以外，這些藥物組合物還可以含有合適的可藥用載體，所述可藥用載體包含促進(jìn)將活性化合物加工成可藥用制劑的賦形劑和輔助物質(zhì)。用于制備和施用的技術(shù)的其他細(xì)節(jié)可見(jiàn)于最新版本的Remington′sPharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，Pa.)?？梢砸赃m用于口服給藥的劑量使用本領(lǐng)域熟知的可藥用載體制備用于口服給藥的藥物組合物。這類(lèi)載體使藥物組合物可以制備為片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、結(jié)晶漿液、混懸劑等以供患者攝取。
可以以鹽來(lái)提供藥物組合物，并且可以與許多酸形成鹽，包括但不僅限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸等。鹽比相應(yīng)的游離堿形式更傾向于易溶于水或其他質(zhì)子性溶劑。在其他情況下，優(yōu)選制劑可以是含有任一或全部以下物質(zhì)的低壓凍干粉劑1-50mM組氨酸、0.1％-2％蔗糖和2-7％甘露醇，pH范圍為4.5至5.5，臨用前與緩沖液組合。
制備藥物組合物之后，可將其置于適當(dāng)?shù)娜萜髦胁?biāo)明用于指定的病癥。就給藥而言，標(biāo)記包括給藥的劑量、頻率和方法。
適用于本發(fā)明的藥物組合物包括組合物，其中含有有效量的活性成分，以實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的。有效劑量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
對(duì)于任何化合物，可以最初在細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定(如贅生性細(xì)胞)或動(dòng)物模型(一般為小鼠、兔、狗或豬)中估計(jì)治療有效劑量。動(dòng)物模型還可用于確定合適的濃度范圍和給藥途徑。接著這類(lèi)信息可用于確定人中的可用劑量和給藥途徑。
治療有效劑量指改善癥狀或病癥的活性成分、其片段、泛蛋白綴合酶E2-EPF5的抗體、激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑的量。可以在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法測(cè)定療效和毒性，如ED50(在種群的50％具有療效的劑量)和LD50(對(duì)種群的50％致死的劑量)。毒性和療效之間的劑量比是治療指標(biāo)，其可以表達(dá)為L(zhǎng)D50/ED50的比率。優(yōu)選表現(xiàn)高治療指標(biāo)的藥物組合物。在制備用于人用途的劑量范圍中使用得自細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)。得到的這些組合物的劑量?jī)?yōu)選在包括ED50而沒(méi)有或幾乎沒(méi)有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。取決于使用的劑型、患者的敏感性和給藥途徑，劑量在此范圍內(nèi)變化。
執(zhí)業(yè)醫(yī)生考慮涉及需要治療的患者的相關(guān)因素而確定準(zhǔn)確的劑量。調(diào)整劑量和給藥以提供充足水平的活性部分或維持所需的效果。可以考慮的因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性、患者的一般健康、患者的年齡、體重和性別、飲食、給藥時(shí)間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性和對(duì)治療的耐性/應(yīng)答。長(zhǎng)效藥物組合物可以每3至4天、每周或隔周給藥，取決于半衰期和具體制劑的清除率。取決于給藥途徑，正常劑量可以在0.1至100000微克之間變化，直至總劑量約為1g。關(guān)于具體劑量和遞送方法的指導(dǎo)在文獻(xiàn)中提供，并為本領(lǐng)域執(zhí)業(yè)醫(yī)生普遍可得。對(duì)于核苷酸而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員將使用與用于蛋白質(zhì)或其抑制劑不同的制劑。類(lèi)似的，多核苷酸或多肽的遞送將對(duì)具體的細(xì)胞、條件、位置等是特異性的。適用于蛋白質(zhì)口服給藥的藥物制劑描述于例如美國(guó)專(zhuān)利5,008,114、5,505,962、5,641,515、5,681,811、5,700,486、5,766,633、5,792,451、5,853,748、5,972,387、5,976,569和6,051,561。
一般描述本發(fā)明之后，可以參考某些具體實(shí)施例得到進(jìn)一步的理解，本文僅出于說(shuō)明目的而提供所述實(shí)施例，除非另有說(shuō)明，否則均非限制性。
實(shí)施例
1.反義(ASO)和siRNA寡核苷酸siRNA可獲自大量商業(yè)供貨商，例如Qiagen，Dharmacon，Proligo。
寡核糖核苷酸可如制造商(Xeragon)所述，使用TOM-亞磷酰胺化學(xué)法合成并通過(guò)RP-HPLC純化。通過(guò)毛細(xì)管凝膠電泳評(píng)估純度。根據(jù)260nM的消光系數(shù)，通過(guò)UV進(jìn)行定量。雙鏈RNA(dsRNA)的退火如別處(Elbashir等人，2001)所述進(jìn)行。
修飾的反義寡脫氧核苷酸使用亞磷酰胺化學(xué)法合成和HPLC純化，通過(guò)電噴霧質(zhì)譜法和毛細(xì)管凝膠電泳分析和表征。根據(jù)260nM的消光系數(shù)，通過(guò)UV進(jìn)行定量。
所有的寡核苷酸針對(duì)人E2-EPF5序列(GenBank登錄號(hào)M91670，GI號(hào)GI181915，SwissProt entry Q16763)設(shè)計(jì)并通過(guò)BLAST針對(duì)Refseq和UNIGENE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢查，以最大化特異性水平。為了鑒定最有效的寡核苷酸，在以前描述的雙色報(bào)告測(cè)定(dual-color reporter assay)(Hüsken，D.等人，2003)中篩選靶向E2-EPF5的一系列ASO和siRNA。含有E2-EPF5編碼序列的載體與含有CFP和YFP報(bào)告序列的目的載體重組。得到的二元報(bào)告質(zhì)粒pNAS-X產(chǎn)生融合mRNA，其中E2-EPF5靶序列插入表達(dá)的YFP報(bào)告基因的3’-UTR區(qū)。E2-EPF5 ASO和siRNA活性通過(guò)YFP報(bào)告蛋白質(zhì)的抑制程度測(cè)量。eCFP蛋白質(zhì)的表達(dá)用作標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的方法。篩選的E2-EPF5寡核苷酸列表分別顯示在表1(靶向E2-EPF5的ASO；N＝DNA，n＝具有2-O-甲氧基乙基的DNA，s＝硫代磷酸核苷酸間鍵合，c＝2’-甲氧基乙基5-甲基胞苷)和表2(靶向E2-EPF5的siRNA)中(僅顯示反義序列。N(G，C，A，U)＝核糖核苷，n(g，a，t)＝脫氧核糖核苷)。大部分活性寡核苷酸(8162，17828，11723)和響應(yīng)的對(duì)照用于下列研究。
表1


表2

2.細(xì)胞培養(yǎng)所有的細(xì)胞培養(yǎng)試劑來(lái)自Gibco-BRL-Invitrogen AG(Basel.瑞士)。使用的基本培養(yǎng)基為用于HeLa細(xì)胞的Dulbecco’s Modified EagleMedium(DMEM)和用于NCI-H1299細(xì)胞的RPMI1640。培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％胎牛血清(FBS)和1％L-谷氨酰胺，加上任選的50微克/ml慶大霉素抗生素。每周兩次1∶4分傳常規(guī)維持細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天，胰蛋白酶消化細(xì)胞、重懸于含F(xiàn)BS不含抗生素的培養(yǎng)基中，并以1.5-2×104細(xì)胞每0.5ml每孔的密度置于24孔培養(yǎng)板中或以5-10×104細(xì)胞每2ml每孔的密度置于6孔板中。將平板在37℃5％CO2和高濕度下孵育24小時(shí)。
3.轉(zhuǎn)染siRNA，以及去鐵胺(DFO)和氯化鈷處理根據(jù)制造商(Invitrogen)提供的方案使用Oligofectamine進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)要地，用Optimem稀釋siRNA至1.2μM siRNA每μl。另外將Oligofectamine稀釋為0.25μl Oligofectamine每μl Optimem?；旌偷攘康倪@些siRNA和Oligofectamine溶液并在室溫溫育20-25分鐘，以允許形成復(fù)合物。然后用含有10％FBS不含抗生素的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基稀釋siRNA/oligofectamine復(fù)合物至最終目的濃度，一般是20-80nM siRNA。接著，從細(xì)胞中移除舊培養(yǎng)基并代替以siRNA/Oligofectamine混懸液對(duì)24孔板每孔0.5ml和對(duì)6孔板每孔2ml。在潮濕的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小時(shí)后，用新鮮的培養(yǎng)基代替含有siRNA的培養(yǎng)基，所述新鮮培養(yǎng)基含有10％FBS，不含誘導(dǎo)物或含有150μM去鐵胺(簡(jiǎn)寫(xiě)為DFO)或CoCl2(均來(lái)自Sigma；來(lái)自新鮮配制的水性儲(chǔ))。37℃6小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基測(cè)定分泌的VEGF，制備單層細(xì)胞的總細(xì)胞抽提物用于Western印跡或總RNA分析。
4.轉(zhuǎn)染ASO，以及DFO和氯化鈷處理ASO以1mM的濃度儲(chǔ)存于TE(10mM Tris pH 8.0，1mM EDTA)中。實(shí)驗(yàn)前用Optimem(Life Sciences Inc.)制備10μM工作溶液。ASO用Optimem稀釋為2x終濃度，與也稀釋到2x終濃度的Lipofectin或Effectene混和并置于室溫30分鐘。從30-50％匯合的T24細(xì)胞培養(yǎng)物中去除標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，并用無(wú)血清的OptiMEM1(Gibco BRL)洗滌單細(xì)胞層一次。然后向單細(xì)胞層中加入ASO/Lipofectin混合物，然后在37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，之后去除培養(yǎng)基并代替以含10％FBS的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。在潮濕的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-72小時(shí)后用新鮮培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基，所述新鮮培養(yǎng)基含有10％FBS，不含誘導(dǎo)物或含有150μM去鐵胺(簡(jiǎn)寫(xiě)為DFO)或CoCl2(均來(lái)自Sigma；來(lái)自新鮮配制的水性儲(chǔ))。在37℃培養(yǎng)6小時(shí)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基用于測(cè)定分泌的VEGF并制備單細(xì)胞層的總RNA或全細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物用于Western印跡分析。
5.實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR根據(jù)制造商說(shuō)明使用RNeasy 96試劑盒(Qiagen#74183)制備總RNA。用于實(shí)時(shí)PCR的引物對(duì)和FAM-標(biāo)記的TaqMan探針使用Primer Express1.0版程序(ABI PRISM，PE Biosystems)設(shè)計(jì)并從Microsynth(瑞士)、Qiagen或Applied Biosystems(“Assays-on-demand”)購(gòu)買(mǎi)。使用下列引物序列E2-EPF5(Acc.Nr GI 181915)反向引物5’-AAAGACCTTGATGCCATCGG-3’(SEQ ID NO27)正向引物5’-TCCGCCTGGTGTACAAGGA-3’(SEQ ID NO28)TaqMan探針5’-FAM-TGACGACACTGACCGCAGACCCA-TAMRA-3‘(SEQ ID NO29)HIF-1a(Acc.Nr)NM_18105ABI Assay-on-DemandHs00153153_m1VEGF(Acc.Nr)NM_003376反向引物5’-CACATTTGTTGTGCTGTAGGAAGC-3’(SEQ ID NO30)正向引物5’-TGAGATCGAGTACATCTTCAAGCC-3’(SEQ ID NO31)TaqMan探針5’-FAM-CCATGCAGATTATGCGGATCAACCTCA-TAMRA-3’(SEQ ID NO32)或ABI Assay-on-DemandHs00173626_m1GLUT-1(Acc.Nr)NM_006516
ABI Assay-on-DemandHs00197884_m1已糖激酶2(Acc.Nr)NM_000189反向引物5’-TGTCTTGAGCCGCTCTGAGAT-3’(SEQ ID NO33)正向引物5’-TGTCCGTAACATTCTCATCGATTT-3’(SEQ ID NO34)TaqMan探針5’-FAM-CCAAGCGTGGACTGCTCTTCCGAG-TAMRA-3’(SEQ ID NO35)β肌動(dòng)蛋白(Acc.Nr)X00351反向引物5’-TAATGTCACGCACGATTTCCC-3’(SEQ ID NO36)正向引物5’-TCACCGAGCGCGGCT-3’(SEQ ID NO37)TaqMan探針5’-FAM-CAGCTTCACCACCACGGCCGA-TAMRA-3’(SEQ ID NO38)Bcl-XL(Acc.Nr)Z23115反向引物5’-GGTCGCATTGTGGCCTTT-3’(SEQ ID NO39)正向引物5’-TCCTTGTCTACGCTTTCCACG-3’(SEQ ID NO40)TaqMan探針5’-FAM-ACAGTGCCCCGCCGAAGGAGA-TAMRA-3’(SEQ ID NO41)CYPA(親環(huán)蛋白-A，Acc.Nr)NM_021130反向引物5’-TCGAGTTGTCCACAGTCAGCA-3’(SEQ ID NO42)正向引物5’-GCGCTTTGGGTCCAGGA-3’(SEQ ID NO43)TaqMan探針5’-FAM-TGGCAAGACCAGCAAGAAGATCACCA-TAMRA-3’(SEQ ID NO44)對(duì)于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，將6μl水中的25ng總RNA與0.33μl 5’和3’引物(各10mM)、0.33μl TaqMan探針(5μm)、6.33μl RT PCR Master MixKit(Eurogentec，#RT-QRT-032X)按照制造商說(shuō)明混合為總體積13μl。在ABI PRISM序列檢測(cè)器5700或7700(Applied Biosystems)中如下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR48℃逆轉(zhuǎn)錄30分鐘，95℃變性10分鐘，然后95℃15秒變性、60℃退火并延伸1分鐘50個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)的相對(duì)定量使用如ABI PRISM 5700用戶手冊(cè)#2中所述的δ-Ct方法計(jì)算。
6.Western印跡根據(jù)制造商(Pierce，Rockford，IL)提供的方案在M-PER哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)抽提劑中制備細(xì)胞裂解物。10μg總蛋白質(zhì)抽提物上樣至預(yù)制的8％丙烯酰胺凝膠(NOVEX，San Diego，CA)上，并在電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在TBST-5％乳粉中飽和膜后，用稀釋于TBST-5％乳粉中的相關(guān)第一抗體免疫染色。然后用TBST洗滌膜3次，并與也稀釋于TBST-5％乳粉中的適當(dāng)?shù)牡诙贵w溫育30分鐘。然后用TBST洗滌膜三次并根據(jù)制造商方案使用ECL Western印跡檢測(cè)劑(Amersham Biosciences)顯影免疫染色。
稀釋用于一抗的1∶250的小鼠抗-HIF-1a(BD Biosciences/Pharmingen610958)為，1∶100,000的小鼠抗β肌動(dòng)蛋白(Sigma A5441)，1∶2000的兔抗ARNT(Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator，Novus NB730-H)，1∶500的兔抗GLUT1(Glucose Transporter ABCAM ab652)，1∶1,000的兔抗HIF2a-EPAS1(Novus ab199目錄號(hào)730-H)。
第二抗體使用以1∶1∶5,000-20,000稀釋的山羊抗小鼠IgG(Fab特異性)-過(guò)氧化物酶抗體(Sigma A2304)，或以1∶20,000稀釋的山羊抗兔IgG多克隆抗體(HRP綴合)，Novus目錄號(hào)NB 730-H。
7.VEGF分泌的定量使用用于人VEGF的酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)試劑盒(R&D Systems)，根據(jù)制造商說(shuō)明測(cè)定分泌的VEGF。
8.表征E2-EPF5 siRNA為了表征E2-EPF5特異基因抑制劑，將NCI-H1299和HeLa細(xì)胞暴露于E2-EPF5 siRNA，并通過(guò)TaqMan RT-PCR研究E2-EPF5 mRNA抑制。兩種細(xì)胞系siRNA溫育48小時(shí)和72小時(shí)后，E2-EPF5 mRNA分別減少70到90％。錯(cuò)配和不相關(guān)對(duì)照siRNA不影響E2-EPF5基因表達(dá)。同樣，表達(dá)N端HIS-FLAG表位標(biāo)記的重組E2-EPF5的NCI-H1299細(xì)胞暴露于E2-EPF5 siRNA和對(duì)照。與對(duì)照相比，所有的匹配siRNA特異性降低E2-EPF5蛋白質(zhì)水平，17828顯示最強(qiáng)減少。
9.在低氧下E2-EPF5抑制阻止VEGF表達(dá)已報(bào)道能夠修飾的轉(zhuǎn)染寡核苷酸的NCI-H1299、HeLa和DU-145細(xì)胞系暴露于低氧刺激化合物去鐵胺(DFO)、氯化鈷(CoCl2)和N-Oxalylglycine。結(jié)果證明在NCI-H1299和Hela細(xì)胞中，DFO在6和24小時(shí)刺激后始終誘導(dǎo)4-7倍VEGF mRNA和2-3倍VEGF蛋白質(zhì)。CoCl2誘導(dǎo)程度類(lèi)似，但是較不持續(xù)，在延長(zhǎng)的刺激后衰減。N-Oxalylglycine顯著誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，特別是6小時(shí)后。發(fā)現(xiàn)在DU-145中VEGF mRNA和蛋白質(zhì)的基本表達(dá)水平(每小時(shí)每百萬(wàn)細(xì)胞分泌2ng的VEGF蛋白質(zhì))比其他兩種測(cè)試的細(xì)胞系(NCI-H1299318±40pg VEGF/h，106細(xì)胞；HeLa301±60pg VEGF/h，106細(xì)胞)高約10倍(2160±120pg VEGF/h，106細(xì)胞)。2-3倍RNA水平和1.3-1.5倍蛋白質(zhì)水平的顯著VEGF誘導(dǎo)僅可由所有的誘導(dǎo)物在刺激6小時(shí)后證明，而非24小時(shí)后證明。值得注意的是，在使用的條件下，在研究的細(xì)胞系中均未發(fā)現(xiàn)E2-EPF5 mRNA的顯著調(diào)節(jié)。
為了確認(rèn)HRE報(bào)告基因測(cè)定的結(jié)果，檢測(cè)siRNA介導(dǎo)的E2-EPF5抑制對(duì)內(nèi)源HRE驅(qū)使的靶基因表達(dá)的影響，特別是對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響。NCI-H1299細(xì)胞暴露于E2-EPF5 siRNA三天后分別暴露于DFO和CoCl26小時(shí)。如表4所示，與用相應(yīng)的錯(cuò)配和無(wú)關(guān)對(duì)照寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，所有的E2-EPF5 siRNA誘導(dǎo)了VEGF分泌地顯著降低。比較觀察到的對(duì)E2-EPF5的抑制活性，siRNA 17828引起分泌的VEGF最為顯著地抑制。使用CoCl2代替DFO作為低氧誘導(dǎo)劑獲得相同的結(jié)果。

表4siRNA介導(dǎo)的E2-EPF5抑制對(duì)VEGF分泌的影響。用針對(duì)E2-EPF5的60nM siRNA、相應(yīng)的錯(cuò)配對(duì)照和無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA 8548轉(zhuǎn)染NCI-H1299細(xì)胞。72小時(shí)后，相對(duì)未處理的8548對(duì)照，細(xì)胞與150μM DFO溫育6小時(shí)。通過(guò)ELISA測(cè)定條件培養(yǎng)基中VEGF蛋白質(zhì)的濃度并表達(dá)為pg/ml/每孔中蛋白質(zhì)總量。
使用最有效E2-EPF5siRNA 17828的另一分析顯示，在NCI-H1299和HeLa細(xì)胞系中，E2-EPF5抑制降低低氧誘導(dǎo)的VEGF mRNA表達(dá)和低氧誘導(dǎo)的VEGF蛋白質(zhì)分泌。低氧VEGF mRNA和蛋白質(zhì)的回復(fù)基本達(dá)到含氧量正常的培養(yǎng)細(xì)胞中觀察的水平，因?yàn)檫@是對(duì)照siRNA靶向的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1a的情況。
另外，如表5所示，E2-EPF5下調(diào)抑制另一內(nèi)源Hif-1靶基因，即GLUT-1(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1)，其中Hif-1mRNA未顯著改變。這表示E2-EPF5阻抑抑制Hif-1介導(dǎo)的HRE控制基因的轉(zhuǎn)錄激活而不影響Hif-1自身的轉(zhuǎn)錄。

表5siRNA-介導(dǎo)的E2-EPF5抑制以類(lèi)似靶向HIF-1a的siRNA的程度阻抑低氧誘導(dǎo)的GLUT-1 mRNA的表達(dá)。用針對(duì)E2-EPF5(17828)的40nM siRNA、HIF-1a(25560)、相應(yīng)的錯(cuò)配對(duì)照(E2-EPF525296，Hif-125584)和無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA 8548轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。72小時(shí)后，相對(duì)未處理的8548對(duì)照將細(xì)胞與150μM DFO溫育6小時(shí)。GLUT-1mRNA通過(guò)TaqManRT-PCR測(cè)定。
10.E2-EPF5的表達(dá)和細(xì)胞增殖E2-EPF5編碼泛蛋白綴合酶(E2)。E2將泛蛋白與細(xì)胞蛋白質(zhì)連接，從而靶向它們以蛋白酶體降解，或調(diào)節(jié)它們的功能，類(lèi)似于磷酸化。泛蛋白途徑通過(guò)控制大量細(xì)胞周期蛋白質(zhì)在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖調(diào)節(jié)中起重要作用(Bashier等人，2003)，且泛蛋白化機(jī)制的許多部件已在多種癌癥中失調(diào)、突變或放大中發(fā)現(xiàn)，和/或與預(yù)后不良相關(guān)。通過(guò)TaqMan實(shí)時(shí)PCR，使用對(duì)E2-EPF特異的引物檢測(cè)了多種人組織中的E2-EPF5表達(dá)。E2-EPF在胸腺和睪丸中輕微上調(diào)，提示細(xì)胞增殖和E2-EPF5表達(dá)間可能的關(guān)系(表6)。


表6多種組織(Clontech)中E2-EPF5 mRNA的表達(dá)。通過(guò)TaqMan實(shí)時(shí)PCR，使用E2-EPF5特異引物測(cè)定組織分布。
11.將人E2-EPF5 cDNA克隆入載體pDONR201通過(guò)兩個(gè)連續(xù)的PCR反應(yīng)，之后插入GatewayTM供體載體中克隆E2-EPF5 cDNA。第一次DNA擴(kuò)增在50μl Ex TaqTM緩沖液中，存在1ng來(lái)自人胎兒肝組織(Clontech)的Quick-CloneTMcDNA，使用E2-EPF5特異PCR引物(正向ATC GAA GGT CGT ATG AAC TCC AAC GTG GAGAAC CTA CCC CCG(SEQ ID NO45)，反向TCA CTT GTC GTC GTCGTC CTT GTA GTC CAG CCG CCG CAG CGC CCG CAG CGC CCG(SEQ ID NO46))各10皮摩、10納摩各種dNTP、2mM MgSO2、5UTaKaRa Ex TaqTMDNA聚合酶，覆蓋50μl礦物油在熱循環(huán)塊中進(jìn)行。PCR循環(huán)條件如下94℃10分鐘，[94℃1分鐘，62℃1分鐘，72℃1分鐘]30個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘，然后保持10℃。通過(guò)PAGE分析PCR產(chǎn)物。用GeneClean II試劑盒將DNA從瓊脂糖上洗脫。弱DNA條帶通過(guò)相同方案再擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的典型產(chǎn)量為50μl H2O中約8μg DNA。PCR產(chǎn)物由5’-FXa位點(diǎn)特異E2序列-FLAG標(biāo)簽-3’組成。第二次DNA擴(kuò)增在100μl緩沖液(10mM Tris-HCl pH 8.8、25mM KCl、5mM(NH4)SO4)中，存在100ng來(lái)自第一次PCR反應(yīng)的模板DNA，使用PCR引物ATTB1FXA2(GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TTA GCTGGT ATC GAA GGT CGT ATG(SEQ ID NO47))和ATTB2FLAG(GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTA TCA CTT GTCGTC GTC GTC CTT GTA GTC(SEQ ID NO48))各100皮摩，20納摩各種dNTP、2mM MgSO2、10％DMSO、2.5U Pwo DNA聚合酶，覆蓋100μl礦物油在熱循環(huán)塊中進(jìn)行。PCR循環(huán)條件如下94℃2分鐘，[94℃1分鐘，65℃1分鐘，72℃1分鐘]2個(gè)循環(huán)，[94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘]2個(gè)循環(huán)，[94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘]30個(gè)循環(huán)，72℃2分鐘，然后保持10℃。通過(guò)PAGE分析att-PCR產(chǎn)物。用PCRPurification Kit(Qiagen)純化DNA。擴(kuò)增的att-PCR產(chǎn)物的一般產(chǎn)量為50μl H2O中7-8μg DNA。att-PCR產(chǎn)物由5’-ATTB1-Fxa位點(diǎn)特異E2序列-FLAG標(biāo)簽-ATTB2-3’組成。att-PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)GatewayTM供體載體pDONR201中。BP ClonaseTM酶混合物催化attB1/B2(PCR產(chǎn)物)和attP1/P2(載體)位點(diǎn)間的位點(diǎn)特異和方向特異體外重組反應(yīng)。反應(yīng)混合物(20μL)包含BP緩沖液(如所提供的)、200ng att-PCR DNA、300ngpDONR201載體和4μL BP ClonaseTM酶混合物。25℃1小時(shí)后加入蛋白酶K(2μg/μL)并將樣品在37℃溫育10分鐘。1μL用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化體在含有卡那霉素(50mg/L)的LB平板上篩選。使用限制性酶和通過(guò)DNA測(cè)序表征克隆。合適的克隆指定為pBM2537/NPL002981。
12.將E2-EPF5 cDNA克隆入GatewayTM表達(dá)載體pDEST12.2中ClonaseTMLR酶混合物介導(dǎo)attL1/L2(pBM2537進(jìn)入克隆)和attR1/R2(pDEST12.2載體)位點(diǎn)間的GATEWAY LR重組反應(yīng)。反應(yīng)混合物(20μL)含有LR緩沖液(如制造商提供)，200ng進(jìn)入克隆(pBM2537)DNA、300ng表達(dá)載體(pDEST12.2，GIBCO-BRL-Invitrogen Corp)和4μLLR ClonaseTM酶混合物。25℃1小時(shí)后加入蛋白酶K(2μg/μL)并將樣品在37℃溫育10分鐘。1μL用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞。轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素(50mg/L)的LB平板上篩選。使用限制性酶和通過(guò)DNA測(cè)序表征克隆。合適的克隆指定為pDEST-EPF5/NPL006653。
13.用pDEST型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NCI-H1299從Life Sciences Inc.購(gòu)得培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)、Versene、Lipofectin、遺傳霉素。使用的皮氏細(xì)胞培養(yǎng)皿(直徑＝8cm)為來(lái)自Nunc(Life SciencesInc.)的Falcon 3003型，6孔、24孔和96孔多孔皿。NCI-H1299細(xì)胞(CRL-5803)可獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。細(xì)胞在含10％FCS和60μg/ml慶大霉素的RPMI1640中，保持在37℃潮濕的含5％CO2的大氣中。為了繁殖培養(yǎng)物，每周分傳細(xì)胞即用Versene洗滌兩次，用胰蛋白酶-EDTA溶液處理5分鐘，15倍體積稀釋于初始培養(yǎng)基并重新放置為10ml/8cm組織培養(yǎng)皿或20ml每75cm2T瓶。3-4天后，加入0.5體積培養(yǎng)基補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。NCI-H1299細(xì)胞使用Lipofectamine Plus試劑(LifeSciences-Invitrogen Corp.)轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)要地，細(xì)胞以1×105每6孔種于6孔多孔板中并生長(zhǎng)1天。在96孔板的兩個(gè)孔中混和2μg質(zhì)粒DNA(pDEST-12.2或pDEST-EPF5)和100μl Optimem和15μl PLUS試劑，并在室溫溫育15分鐘。同時(shí)，將10μl Lipofectamine與100μl Optimem培養(yǎng)基混合物，并也在室溫溫育15分鐘。然后將DNA混合物加入Lipofectamine溶液中，充分混和并在室溫再次溫育15分鐘。同時(shí)將含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基與細(xì)胞分離，用1ml/孔Optimem洗滌細(xì)胞并隨后向每孔中加入1ml Optimem。然后向培養(yǎng)基中加入100μl質(zhì)粒/PLUS試劑/Lipofectamine復(fù)合物并將細(xì)胞(目前在1150μl培養(yǎng)基中)在含5％CO2的潮濕培養(yǎng)箱中37℃溫育4小時(shí)。從細(xì)胞中去除DNA脂質(zhì)體混合物時(shí)，加入2ml新鮮的RPMI1640培養(yǎng)基(含10％FCS和60μg/ml慶大霉素)。第二天如上所述用胰蛋白酶消化細(xì)胞，重懸于含F(xiàn)CS的3ml RPMI1640培養(yǎng)基中，并將300、150、60或30μl細(xì)胞重懸液涂布于8-cm皮氏培養(yǎng)皿上，所述培養(yǎng)皿含有10ml含10％FCS和60μg/ml慶大霉素的RPMI1640。下一天加入1.0mg/ml遺傳霉素。每周兩次將選擇性培養(yǎng)基(RPMI1640+10％FCS+1mg/ml遺傳霉素)換為新鮮培養(yǎng)基。2-3周后出現(xiàn)克隆。從由pDEST-EPF5轉(zhuǎn)化的分離良好的生長(zhǎng)菌落平板上使用帶有100μl槍頭的移液器刮去24個(gè)菌落并同時(shí)將刮掉的細(xì)胞吸入槍頭中。將槍頭中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔平板并加入0.5ml選擇性培養(yǎng)基。5-10天后克隆的細(xì)胞形成匯合的單層。胰蛋白酶消化來(lái)自這類(lèi)匯合24孔的細(xì)胞，分到兩個(gè)24孔和一個(gè)6孔“孔”中。幾天后，從每個(gè)克隆的24孔之一中分離總RNA并通過(guò)實(shí)施例5中描述的RT-PCR測(cè)量E2-EPF5 mRNA的水平。該RT-PCR測(cè)量了來(lái)自一個(gè)或多個(gè)pDEST-EPF5整合拷貝的重組E2-EPF5 mRNA和天然內(nèi)源E2-EPF5 mRNA的組合水平。在用pDEST-EPF5成功轉(zhuǎn)化的NCI-H1299細(xì)胞中，組合的E2-EPF5mRNA大于天然H1299細(xì)胞或用pDEST12.2轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的2.5倍。還擴(kuò)增了三個(gè)獨(dú)立的NCI-H1299/pDEST-EPF5克隆(nrs1、5和15)。NCI-H1299/pDEST-EPF5細(xì)胞重組表達(dá)E2-EPF5使用抗FLAG表位抗體(Sigma)，由如實(shí)施例6中所述Western印跡確認(rèn)。作為對(duì)照，若干帶有約200個(gè)用pDEST12.2轉(zhuǎn)化的NCI-H1299細(xì)胞克隆的8cm皮氏培養(yǎng)皿用胰蛋白酶消化、繁殖以用作NCI-H1299/pDEST-EPF5細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照。
14.pDEST-EPF5NCI-H1299細(xì)胞系中提高的VEGF分泌為了確定E2-EPF5-FLAG的強(qiáng)迫過(guò)表達(dá)效應(yīng)，實(shí)施例12中描述的細(xì)胞系以20,000細(xì)胞每孔置于24孔平板中。20小時(shí)后用RPMI1640培養(yǎng)基+10％FCS或另外含有150μM DFO的RPMI1640培養(yǎng)基+10％FCS代替培養(yǎng)基。6小時(shí)候后收獲培養(yǎng)基并冷凍用于檢測(cè)分泌的VEGF蛋白水平(實(shí)施例7)，其中從細(xì)胞中分離總RNA并通過(guò)RT-PCR(實(shí)施例5)測(cè)量一組mRNA種類(lèi)的水平。pDEST-EPF5轉(zhuǎn)化的NCI-H1299細(xì)胞分泌的VEGF蛋白質(zhì)的數(shù)量顯著大于(2±0.3倍多于)pDEST12.2細(xì)胞分泌的數(shù)量，前一細(xì)胞表達(dá)提高水平的E2-EPF5，后一細(xì)胞表達(dá)正常的E2-EPF5水平(表7)。相反DFO誘導(dǎo)基本沒(méi)有改變(表7)。然而等價(jià)的DFO誘導(dǎo)與提高的基底VEGF水平聯(lián)合，這意味著DFO誘導(dǎo)后的VEGF絕對(duì)水平2倍高于不表達(dá)提高的E2-EPF5的NCI-H1299細(xì)胞。

表7與親本NCI-H1299細(xì)胞中的VEGF蛋白質(zhì)水平相比，pDEST12.2和pDEST-EPF56轉(zhuǎn)化的NCI-H1299細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中6小時(shí)的VEGF蛋白質(zhì)水平。
15.pDEST-EPF5NCI-H1299細(xì)胞系中的信使RNA水平使用自質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的NCI-H1299細(xì)胞中分離的總RNA(實(shí)施例13)，通過(guò)PCR測(cè)定了若干種mRNA的水平(實(shí)施例5)。pDEST-EPF5轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中E2-EPF5mRNA水平(重組+天然E2-EPF5mRNA)2.3-3倍高于親本NCI-H1299細(xì)胞(表8)。這伴隨著3個(gè)已知受HIF調(diào)節(jié)的基因的mRNA水平顯著上升VEGF mRNA(提高38±10％)、己糖激酶-2mRNA(HK2，提高4.9±2.5倍)和GLUT-1 mRNA(提高3.8±0.2倍)。相反的，不受HIF調(diào)節(jié)的大量基因(β-肌動(dòng)蛋白、Bcl-xL、CYPA和HIF1a)的mRNA基底水平未顯著改變。DFO誘導(dǎo)受HIF調(diào)節(jié)的基因的效率在E2-EPF5過(guò)表達(dá)細(xì)胞中沒(méi)有改變，但是與DFO刺激的NCI-H1299細(xì)胞(不額外表達(dá)E2-EPF5)中觀察到的相比，更高的基底mRNA水平和正常的DFO誘導(dǎo)的組合效應(yīng)引起這些HIF應(yīng)答mRNA的更高水平。

表7pDEST12.2和pDEST-EPF5轉(zhuǎn)化的NCI-H1299細(xì)胞系中mRNA表達(dá)水平(n.d.＝未測(cè)定)16.在大腸桿菌中產(chǎn)生重組E2-EPF5-FLAG蛋白按照GatewayTM系統(tǒng)手冊(cè)將來(lái)自質(zhì)粒pBM2537/NPL002981的插入片段(實(shí)施例11)與載體DEST17(Invitrogen Corp)重組，以得到質(zhì)粒E2-12-flag-pDEST17/NPL006782。重組E2-EPF5的編碼氨基酸序列為MSYYHHHHHHLESTSLYKKAGLIEGRMNSNVENLPPHIIRLVYKEVTTLTADPPDGIKVFPNEEDLTDLQVTIEGPEGTPYAGGLFRMKLLLGKDFPASPPKGYFLTKIFHPNVGANGEICVNVLKRDWTAELGIRHVLLTIKCLLIHPNPESALNEEAGRLLLENYEEYAARARLLTEIHGGAGGPSGRAEAGRALASGTEASSTDPGAPGGPGGAEGPMAKKHAGERDKKLAAKKKTDKKRALRALRRLDYKDDDDK(SEQ ID NO49)該質(zhì)粒用于在大腸桿菌中表達(dá)重組E2-EPF5。通過(guò)N端的6-HIS標(biāo)簽，其可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)金屬螯合親和層析進(jìn)行純化，這得到高于95％純度的標(biāo)記的E2-EPF5制劑。它在體外自動(dòng)泛蛋白化測(cè)定中具有活性，并可使用抗C端FLAG標(biāo)記肽序列(DYKDDDDK)的抗體進(jìn)行檢測(cè)。
17.產(chǎn)生抗重組E2-EPF5-FLAG蛋白的兔抗體皮下注射0.2mg來(lái)自大腸桿菌的重組E2-EPF5(實(shí)施例15)和弗氏完全佐劑來(lái)免疫兔，接著以一周的間隔用0.1mg蛋白質(zhì)和弗氏不完全佐劑進(jìn)行增強(qiáng)。在5、6、7、8和9周后收獲20-30ml血，其后在10周后進(jìn)行100-120血的最終采血，從其中制備血清。通過(guò)固定重組E2-EPF5的親和層析從最終采血的血清中純化多克隆抗E2-EPF5抗體。簡(jiǎn)言之使用硼酸緩沖液中的二甲基庚二亞胺二鹽酸將重組的來(lái)自大腸桿菌的(FLAG標(biāo)記)E2EPF5(實(shí)施例15)與抗FLAG瓊脂糖凝膠共價(jià)偶聯(lián)，如Harlow，E.和Lane，D.，Using AntibodiesA Laboratory Manual，(1999)ColdSpring Harbor NY Cold Spring Harbor Press，522-523頁(yè)所述。為了分離E2-EPF5特異性抗體，將1.5ml粗制兔抗E2-EPF5血清應(yīng)用于150微升經(jīng)PBS平衡的填充珠。用過(guò)量的PBS除去未結(jié)合的抗體。用甘氨酸-HCl0.2M(pH 2.5)洗脫抗E2-EPF5抗體，立即加入1/10體積的Tris-HCl 1M pH9中和并保存于4℃。
18.在小鼠腫瘤組織中檢測(cè)E2-EPF5用于染色的腫瘤來(lái)自生長(zhǎng)于C57BL/6小鼠中的B16BL6黑色素瘤。從Iffa Crédo(L’Arbresle，法國(guó))動(dòng)物育種實(shí)驗(yàn)室獲得雌性黑色C57BL/6小鼠，體重在17至20g之間。它們通過(guò)尾部記號(hào)區(qū)分并在正常條件下維持各組(每個(gè)籠子6-7只動(dòng)物)，每天觀察。每個(gè)治療組使用6只小鼠。來(lái)自C57BL/6小鼠自發(fā)性腫瘤的產(chǎn)生黑色素的小鼠黑色素瘤腫瘤細(xì)胞系B16/BL6已經(jīng)被廣泛表征，并獲自Isaiah J.Fidler博士，Texas MedicalCenter，Houston，美國(guó)。在所有實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞均無(wú)支原體。它們?cè)?7℃和5％CO2下，在補(bǔ)充了5％胎牛血清、1％丙酮酸鈉、1％非必需氨基酸和2％維生素的含穩(wěn)定谷氨酰胺的MEM(MEM EBS，AMIMED，Allschwil)中培養(yǎng)，并培養(yǎng)至匯合。接著用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA使其脫附(37℃，2分鐘)，其后進(jìn)行處理。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除評(píng)估成活力，僅使用具有90％成活力的懸液。將腫瘤細(xì)胞重懸于Hanks緩沖液并制備5×104細(xì)胞/μl的懸液用于皮內(nèi)注射至免疫活性的同系C57BL/6雌性小鼠的耳中。為了腫瘤細(xì)胞注射，通過(guò)吸入3％異氟烷(Forene「，Abbott AG，Cham，瑞士)進(jìn)行麻醉。將動(dòng)物置于溫度保持為39℃的溫暖的手術(shù)區(qū)上，將其耳輕輕展開(kāi)在裝有雙面夾的鋼錐上。接著借助顯微鏡將30G皮下針插入耳緣，在皮下面打開(kāi)4-5mm的通道以允許將腫瘤細(xì)胞遞送至針進(jìn)入點(diǎn)的遠(yuǎn)端位點(diǎn)。注射位點(diǎn)總是位于耳背面第一個(gè)和第二個(gè)神經(jīng)血管束之間。使用微升注射器(250μl，Hamilton，Bonaduz，瑞士)將1μl腫瘤細(xì)胞懸液(5×104個(gè)細(xì)胞)注射進(jìn)小鼠耳的皮下平面，形成2×2mm的皮下泡。一周后，原發(fā)腫瘤開(kāi)始發(fā)育，可以容易地在耳中間看見(jiàn)黑點(diǎn)。在第7、14和21天監(jiān)測(cè)原發(fā)腫瘤的大小。3周后(第21天)通過(guò)吸入CO2處死動(dòng)物，稱(chēng)量頸部淋巴結(jié)，在4.2％甲醛中固定并包埋在石蠟中。
將5μm的石蠟切片(用Microtome，MICROM制備)置于SuperFrost+(Menzel)載玻片上，在37℃干燥過(guò)夜并在加熱板上在59℃加熱5分鐘。將切片在二甲苯中脫蠟2次，在遞減的乙醇溶液(100％、95％、90％、70％)中再水化，在雙蒸水在洗滌，接著進(jìn)行高溫抗原暴露技術(shù)。將切片在pH 6.0，0.1m檸檬酸鈉中微波處理(14分鐘加熱至98℃，10分鐘保持在98℃，Milestone#T/TMEGA)。使切片冷卻至室溫，在雙蒸水(ddH2O)中洗滌并浸入PBS。為了封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性，將切片在PBS中的0.3％H2O2中孵育30分鐘并在PBS中洗滌。為了封閉非特異性抗體結(jié)合，室溫下在濕度箱中將切片在含有1.5％山羊血清(Vector Laboratories)的PBS中孵育20分鐘。吸去封閉血清，將切片與溶于含有0.1％Tween-20的PBS的第一抗體(0.5-1.0μg/ml多克隆兔抗EPF5)孵育1小時(shí)。將切片在PBS中洗滌3×2分鐘，接著與稀釋于含有1.5％封閉血清的PBS中的第二連接抗體(生物素化山羊抗兔IgG，Vector Laboratories)孵育。將切片在PBS中洗滌3×2分鐘并在室溫下與抗生物素蛋白辣根H復(fù)合體(VECTASTAIN Elite ABC試劑盒PK-6101)孵育30分鐘。將切片在PBS中洗滌3×2分鐘，用Vector NovaRed(用于過(guò)氧化物酶的底物試劑盒，Vector Laboratories#SK-480)染色5至10分鐘并在雙蒸H2O中洗滌3×2分鐘。接著將切片在Mayer蘇木精(Fluka#51275)中復(fù)染30秒，在流動(dòng)的自來(lái)水中洗滌5分鐘，在雙蒸H2O中洗滌并晾干。用Eukitt(Fluka#03989)包埋切片并通過(guò)亮視野顯微鏡分析。
B16BL6淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢查顯示毗鄰腫瘤壞死節(jié)的腫瘤細(xì)胞明顯的高度染色。這些是距離供給血管最遠(yuǎn)的活腫瘤細(xì)胞，是推測(cè)的低含氧區(qū)域。因此該區(qū)域中提高的E2-EPF5蛋白水平與E2-EPF5在腫瘤細(xì)胞低氧應(yīng)答中的作用一致。由于低氧應(yīng)答對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活非常重要，因此抑制E2-EPF5預(yù)期可干擾腫瘤生長(zhǎng)，這是可醫(yī)藥利用的效應(yīng)。
19.檢測(cè)小鼠眼病模型中新血管形成區(qū)域的E2-EPF5在C57/BL6J小鼠中產(chǎn)生缺血性視網(wǎng)膜病變(Smith等人，1994，Oxygen-induced retinopathy in the mouse.Invest Ophthalmol Vis Sci35101-111.)。簡(jiǎn)言之，將7日齡小鼠及其母鼠置于氣密培養(yǎng)箱中并暴露于75±3％氧氣5天(高氧)。培養(yǎng)箱溫度保持在23±2℃，每8個(gè)小時(shí)用氧分析儀測(cè)量氧。5天后，從培養(yǎng)箱中移出小鼠置于室內(nèi)空氣中，5天后在第P17處死小鼠，迅速取出眼并冷凍在最適切片溫度的包埋化合物(OCT；Miles Diagnostics，Elkhart，IN)中或者在4％磷酸緩沖的甲醛中固定并包埋在石蠟中。未暴露于高氧的相同性別和年齡的C67BL6J小鼠作為對(duì)照。它們通過(guò)管飼載體進(jìn)行處理，5天后處死并將眼加工用于冰凍或石蠟切片。將5μm冰凍切片在空氣中晾干，4℃在無(wú)水丙酮中固定10分鐘并在PBS中洗滌。通過(guò)將切片在PBS中的0.3％的H2O2中孵育30分鐘來(lái)封閉內(nèi)源性組織過(guò)氧化氫酶活性。洗滌切片并在含有1.5％山羊血清的PBS中孵育20分鐘。如17中所述進(jìn)行其后所有的免疫染色步驟。如17所述進(jìn)行石蠟切片中的EPF5的免疫染色。組織切片的檢查顯示在ROP眼病理學(xué)新血管形成區(qū)域(包括血管細(xì)胞本身)有顯著更高水平的E2-EPF5染色，但在對(duì)照眼的相應(yīng)區(qū)域則沒(méi)有。在對(duì)低氧具有反應(yīng)性的組織中E2-EPF5蛋白的水平增加的觀察結(jié)果與E2-EPF5在細(xì)胞低氧應(yīng)答中的功能作用一致。反言之，由于將小鼠從高氧水平轉(zhuǎn)移至正常氧水平時(shí)經(jīng)歷相對(duì)低氧，出現(xiàn)了視網(wǎng)膜的異常血管形成。這種早產(chǎn)視網(wǎng)膜病變模型(ROP)是廣泛使用的視網(wǎng)膜血管發(fā)生模型。抑制E2-EPF5可能干擾這種低氧應(yīng)答，這是在若干疾病狀態(tài)中考慮的有益效應(yīng)。
SEQ ID NO11 ggcggaccga agaacgcagg aagggggccg gggggacccg cccccggccg gccgcagcca61 tgaactccaa cgtggagaac ctacccccgc acatcatccg cctggtgtac aaggaggtga121 cgacactgac cgcagaccca cccgatggca tcaaggtctt tcccaacgag gaggacctca181 ccgacctcca ggtcaccatc gagggccctg aggggacccc atatgctgga ggtctgttcc241 gcatgaaact cctgctgggg aaggacttcc ctgcctcccc acccaagggc tacttcctga301 ccaagatctt ccacccgaac gtgggcgcca atggcgagat ctgcgtcaac gtgctcaaga361 gggactggac ggctgagctg ggcatccgac acgtactgct gaccatcaag tgcctgctga421 tccaccctaa ccccgagtct gcactcaacg aggaggcggg ccgcctgctc ttggagaact481 acgaggagta tgcggctcgg gcccgtctgc tcacagagat ccacgggggc gccggcgggc541 ccagcggcag ggccgaagcc ggtcgggccc tggccagtgg cactgaagct tcctccaccg601 accctggggc cccagggggc ccgggagggg ctgagggtcc catggccaag aagcatgctg661 gcgagcgcga taagaagctg gcggccaaga aaaagacgga caagaagcgg gcgctgcggg721 cgctgcggcg gctgtagtgg gctctcttcc tccttccacc gtgaccccaa cctctcctgt781 cccctccctc caactctgtc tctaagttat ttaaattatg gctggggtcg gggagggtac841 agggggcact gggacctgga tttgtttttc taaataaagt tggaaaagcaSEQ ID NO2MNSNVENLPPHIIRLVYKEVTTLTADPPDGIKVFPNEEDLTDLQVTIEGPEGTPYAGGLFRMKLLLGKDFPASPPKGYFLTKIFHPNVGANGEICVNVLKRDWTAELGIRHVLLTIKCLLIHPNPESALNEEAGRLLLENYEEYAARARLLTEIHGGAGGPSGRAEAGRALASGTEASSTDPGAPGGPGGAEGPMAKKHAGERDKKLAAKKKTDKKRALRALRRL
權(quán)利要求
1.用于治療異常新血管形成的相關(guān)疾病的方法，其包括施用有效量的物質(zhì)，所述物質(zhì)抑制泛蛋白綴合酶E2-EPF5編碼基因的表達(dá)或抑制E2-EPF5基因產(chǎn)物的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述異常新血管形成為VEGF依賴性的血管形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述VEGF依賴性的血管形成為腫瘤中的血管發(fā)生、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的滑膜血管發(fā)生、糖尿病性視網(wǎng)膜病變中觀察到的眼新血管形成、牛皮癬中的皮膚血管發(fā)生或肝硬化中低氧誘導(dǎo)的血管發(fā)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)的方法，其中所述物質(zhì)為能夠特異抑制泛蛋白綴合酶E2-EPF5的抑制性核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述抑制性核酸為反義寡核苷酸或siRNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)的方法，其中所述物質(zhì)為特異性結(jié)合泛蛋白綴合酶E2-EPF5的抗體。
7.包含有效量的物質(zhì)和可藥用載體的藥物組合物，所述物質(zhì)抑制泛蛋白綴合酶E2-EPF5編碼基因的表達(dá)或抑制E2-EPF5基因產(chǎn)物的活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述E2-EPF5抑制劑為反義寡核苷酸或siRNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥物組合物，其中所述E2-EPF5抑制劑為特異性結(jié)合泛蛋白綴合酶E2-EPF5的抗體。
10.用于鑒定可用于抑制異常新血管形成的化合物的方法，其包括(a)使泛蛋白綴合酶E2-EPF5和測(cè)試化合物接觸，(b)檢測(cè)泛蛋白綴合酶E2-EPF5生物活性的改變。
11.用于鑒定可用于治療異常新血管形成相關(guān)疾病的化合物的方法，其包括i)在具有E2-EPF5生物活性的樣品條件下，使測(cè)試化合物和泛蛋白綴合酶E2-EPF5接觸；ii)檢測(cè)至少一種所述E2-EPF5的生物活性水平；iii)比較所述水平與缺乏所述測(cè)試化合物的對(duì)照樣品的水平；和任選地iv)選擇引起所述水平改變的測(cè)試化合物，以進(jìn)一步檢測(cè)用于預(yù)防和/或治療血糖失調(diào)疾病或代謝紊亂的可能療法。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法，其中所述E2-EPF5生物活性被降低。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述異常血管形成為腫瘤中的血管發(fā)生、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的滑膜血管發(fā)生、糖尿病性視網(wǎng)膜病變中觀察到的眼新血管形成、牛皮癬中的皮膚血管發(fā)生或肝硬化中低氧誘導(dǎo)的血管發(fā)生。
14.根據(jù)權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)方法鑒定的化合物。
15.用于抑制HIF-1調(diào)節(jié)的表達(dá)的方法，其包括抑制泛蛋白綴合相關(guān)酶E2-EPF5的表達(dá)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述HIF-1調(diào)節(jié)的基因選自GLUT-1、GLUT-3、HK2、EPO、NOS2、VEGF、TGF-α、TGF-β、VEGFR-2、C-Met、UPAR、CXCR4、碳酸酐酶IX(CAIX)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述HIF-1調(diào)節(jié)的基因?yàn)閂EGF。
18.用于抑制腫瘤血管發(fā)生的方法，其包括抑制泛蛋白綴合相關(guān)酶E2-EPF5的表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述抑制通過(guò)抑制性核酸或抗體發(fā)揮作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及泛蛋白綴合酶E2－EPF5的新用途。具體地，本發(fā)明顯示E2－EPF5活性的抑制降低VEGF以及其他在低氧應(yīng)答中由轉(zhuǎn)錄因子HIF－1調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供可用于治療VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生相關(guān)的疾病的治療方法和藥物組合物。另外，本發(fā)明提供E2－EPF5作為開(kāi)發(fā)療法的靶標(biāo)。因此，本發(fā)明提供用于鑒定候選化合物的篩選方法，所述化合物抑制E2－EPF5活性并因此可用于治療VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生，例如腫瘤相關(guān)的血管發(fā)生。最后，本發(fā)明還提供用于抑制VEGF和其他HIF－1調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101039694SQ200580035349
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月14日
發(fā)明者F·A·阿塞爾貝格, J·哈爾, D·許斯肯, M·A·拉博, C·S·米克寧, P·施密特, J·魏勒, L·懷德?tīng)?申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司