專利名稱：出于醫(yī)學(xué)診斷目的而測定內(nèi)皮素形成的方法,以及用于實施所述方法的抗體和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及出于醫(yī)學(xué)診斷目的在嚴(yán)重疾病的情況下通過測定循環(huán)(全血、血漿或血清)中的相應(yīng)的內(nèi)皮素原的肽片段，特別是前內(nèi)皮素原-1的相對長壽的C-末端部分肽，來測定內(nèi)皮素的形成，更確切地說，特別是在敗血癥診斷、心臟病診斷中，例如還在癌癥診斷中，更準(zhǔn)確地說通常在其中內(nèi)皮素對于疾病的過程起著重要作用的這樣的病狀的診斷中。
當(dāng)在本申請中簡單地使用“內(nèi)皮素”時，這一術(shù)語首先表示內(nèi)皮素-1(ET-1)。但是，相應(yīng)的表述對于內(nèi)皮素的其他同種型常常也是通用的，因為限制為內(nèi)皮素-1似乎通常不是必需的，從廣義上來說，本發(fā)明還應(yīng)當(dāng)涉及其他的內(nèi)皮素。
在本說明書中，術(shù)語“診斷”在此原則上作為簡化的上位術(shù)語進(jìn)行使用，其特別應(yīng)當(dāng)還包括預(yù)后/早期預(yù)后和與治療相伴的過程控制。
特別地，借助于特異性免疫診斷學(xué)方法，尤其是借助于一類其中使用至少一種標(biāo)記的抗體的免疫測定法(三明治測定法；競爭測定法，例如根據(jù)SPALT或SPART-原理)，來進(jìn)行所述測定。
內(nèi)皮素-1(ET-1)是一種含有21個氨基酸的肽，其是已知最強(qiáng)的血管收縮劑。自從其在1988年被Yanagisawa及其同事[27；方括號中的數(shù)字涉及所附參考文獻(xiàn)列表]發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)廣泛地研究了其生物合成、作用方式和與疾病的關(guān)聯(lián)，并概括在專題性的綜述文章中[1、7、12、17、24]。存在三種由不同的基因編碼的內(nèi)皮素同種型(內(nèi)皮素-1、內(nèi)皮素-2、內(nèi)皮素-3)，其中內(nèi)皮素-1的濃度最大且最有效。內(nèi)皮素-1在內(nèi)皮細(xì)胞、肺、心、腎和腦中合成。人內(nèi)皮素-1基因的初始的翻譯產(chǎn)物是含有212個氨基酸的肽，即前內(nèi)皮素原-1(SEQ ID NO1)。在分泌過程中，由信號肽酶切除前內(nèi)皮素原的短的N-末端信號序列(第1-17位氨基酸)。隨后，在此獲得的內(nèi)皮素原由作用于雙堿性氨基酸對的蛋白酶即弗林蛋白酶加工成沒有生物活性的、含有38個氨基酸的肽，即大內(nèi)皮素(big-Endothelin)(SEQ ID NO3)，由此最后借助于內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶(ECE)形成成熟的、具有生物活性的內(nèi)皮素-1(SEQ ID NO2)。內(nèi)皮素通過與位于肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮作用。這種結(jié)合導(dǎo)致鈣的流出、磷脂酶C的活化和Na/K ATP酶的抑制。除了血管收縮作用之外，內(nèi)皮素還具有生長調(diào)節(jié)特性。
鑒于內(nèi)皮素(特別是內(nèi)皮素-1)的可檢測的和推測中的大量和重大的生理學(xué)作用，自從鑒定出其的那時候開始，就已經(jīng)開發(fā)出了多種不同的測定法以用于其免疫診斷測定，并將這些測定法用于測量內(nèi)皮素，特別是在人血漿中。這樣的測定是許多公開文獻(xiàn)的主題。
對于多種疾病病狀，已經(jīng)描述了內(nèi)皮素-1和大內(nèi)皮素的血漿濃度升高[17]。屬于此的疾病為心血管疾病[1](尤其是肺動脈高壓[21]、動脈粥樣硬化[13]、充血性心力衰竭[25]、心肌梗塞[20])、敗血癥和感染性休克[11、22、23]、癌癥[2、3、15、18]，等等。
用于測量血漿樣品中的內(nèi)皮素的免疫測定法(參見[17]中的綜述)特別屬于放射免疫測定法的類型(使用標(biāo)記的內(nèi)皮素-1作為競爭者)，或者屬于EIA/ELISA類型，而且這些方法僅僅旨在測定內(nèi)皮素或者測定內(nèi)皮素-免疫反應(yīng)性。在此，RIA類型的測定法具有較低的特異性，并還包括了含有內(nèi)皮素序列的相關(guān)肽。
但是，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素-1(ET-1)具有極短的在循環(huán)中的停留時間，在1-2分鐘之后其就已經(jīng)從循環(huán)中被清除[6]。由于認(rèn)為在血液和血漿中的內(nèi)皮素-1是穩(wěn)定的[6]，所以其分配入其他組織中以及其快速和高親和力地與受體結(jié)合被看作是短的停留時間的最重要原因。因此，在某些組織和體液中，能夠測得比例如在血漿中明顯更高的內(nèi)皮素-1濃度[1、7]。鑒于這些情況，測定血漿樣品中的ET-1的正確性受到了嚴(yán)重的質(zhì)疑[17]。也就是說，認(rèn)為對于內(nèi)皮素(ET-1)的生理作用來說，在血漿樣品中可測定的短暫的(也許只是反映了過渡狀態(tài)的)ET-1濃度是不重要的，然而所有在生物體中存在的游離的和結(jié)合的(例如與組織和受體結(jié)合的)生理ET-1濃度的總和則具有大得多的相關(guān)性。
相對于測定ET-1來說，測定ET-1前體即所謂的大內(nèi)皮素(“bigET-1”；SEQ ID NO3)具有優(yōu)點，即“大內(nèi)皮素”在循環(huán)中的停留時間比從其釋放的ET-1的停留時間明顯更長。因此，在一系列的研究中，沒有測定真正的內(nèi)皮素，而是測定了該“大內(nèi)皮素”。特別地，使用三明治型的測定法用于其特異的測定，所述三明治型的測定法使得能夠可靠地區(qū)分大內(nèi)皮素-1與經(jīng)加工的ET-1和其他內(nèi)皮素[4、8、10]。顯示出，在某些疾病的情況下，測量出ET-免疫反應(yīng)性升高可歸因于大內(nèi)皮素。
選擇性地測量大內(nèi)皮素-1只是問題的逐漸改善，而沒有實際解決問題，因為大內(nèi)皮素也能夠在血液循環(huán)中快速地被加工成內(nèi)皮素[1、5、9]。因此，其同樣也具有相對較短的生物半壽期(20-25分鐘)[10]，因而在血漿中可測定的大內(nèi)皮素的測量值同樣也只是代表了短暫的血漿濃度，而沒有反映真正起生理作用的內(nèi)皮素濃度。當(dāng)測定大內(nèi)皮素-1時，在疾病條件下生理形成的、但已經(jīng)經(jīng)過加工的并結(jié)合在組織中或受體上的ET-1是不包括在內(nèi)的。因此，在測量大內(nèi)皮素的情況下，也低估了具有生理活性的內(nèi)皮素的總量。嘗試了補(bǔ)充地特異性測量在大內(nèi)皮素-1的酶促裂解時除了ET-1之外而形成的大內(nèi)皮素-1的C-末端肽片段(具有前內(nèi)皮素原的第74-90位氨基酸或大內(nèi)皮素的第22-38位氨基酸)，結(jié)果表明這樣的肽的穩(wěn)定性比ET-1還要差，因而不適合于測量[10]。
對于測量除了大內(nèi)皮素之外的內(nèi)皮素原的范圍，從現(xiàn)有技術(shù)中僅獲知一種商業(yè)的競爭性測試法(N-末端區(qū)域18-50，從PhoenixPharmaceuticals商購獲得；對于敗血癥診斷的用途描述在WO00/22439中)。對于待用這種測定法進(jìn)行測量的分析物的穩(wěn)定性和性質(zhì)，沒有公開任何信息。
本發(fā)明的目標(biāo)是開發(fā)出一種測定方法，該方法能夠比迄今的對于血漿中的ET或大內(nèi)皮素的測定更可靠地反映大內(nèi)皮素或內(nèi)皮素的內(nèi)源形成，即總的生理濃度，和由此反映內(nèi)皮素的作用。
一種這樣的方法應(yīng)當(dāng)是有效的和適于程式化的，并能夠提供在各種不同的疾病狀況的情況下關(guān)于ET(ET-1)和/或其前體的生理產(chǎn)生的可靠值，特別是在敗血癥或其他其中內(nèi)皮素的值升高起著作用的疾病狀況的情況下。
本發(fā)明的目標(biāo)通過如此來達(dá)到，即出于診斷目的，在人類患者的全血、血漿或血清樣品中不測定ET或大內(nèi)皮素，而是測定不含有ET或大內(nèi)皮素序列的相對長壽的前內(nèi)皮素原-或內(nèi)皮素原-部分肽，特別是C-末端部分肽，其至少含有前內(nèi)皮素原-1的第168-212位氨基酸。
權(quán)利要求1涉及本發(fā)明的原理。本發(fā)明有利的并且目前優(yōu)選的實施方案描述在從屬權(quán)利要求中。
本發(fā)明基于申請人的實驗研究，在這些實驗研究中能夠表明，前內(nèi)皮素原的這樣的部分不是內(nèi)皮素的直接的前體，其包括適合于測量目的的長壽的肽，這些長壽的肽能夠在血液樣品中可靠地和以高臨床價值得到測量。
在生理學(xué)上，內(nèi)皮素-1通過更大的前體分子即前內(nèi)皮素原(SEQ IDNO1)或者從中獲得的分泌的內(nèi)皮素原的加工而形成。在這樣的加工過程中，除了大內(nèi)皮素(和從中而來的內(nèi)皮素)之外，必須以初始化學(xué)計算量形成其他的肽，這些肽迄今仍然從未成為科學(xué)研究的對象，并且關(guān)于其可能的其他加工和穩(wěn)定性是未知的。在申請人的研究開始時，希望能夠證實，血液樣品(全血、血漿或血清樣品)中存在至少一種假設(shè)的其他的肽-裂解產(chǎn)物，并經(jīng)證明是相對穩(wěn)定的，因而可以適合于作為內(nèi)皮素的生理形成的量度，而不管實際的在血漿中可測得的內(nèi)皮素濃度。
因此，測量這樣的裂解產(chǎn)物可能就是所尋求的用于測定內(nèi)皮素生理濃度或產(chǎn)生的方法，其在權(quán)利要求中稱為測定“內(nèi)皮素的形成”。該術(shù)語涉及，在假設(shè)只有一條即單個已知的從前內(nèi)皮素原形成內(nèi)皮素-1的形成途徑的情況下，與疾病相關(guān)地形成的內(nèi)皮素-1的生理濃度只能相應(yīng)于先前加工的前內(nèi)皮素原或內(nèi)皮素原的量。如果除了大內(nèi)皮素或內(nèi)皮素之外以相同的化學(xué)計量濃度形成的部分肽是穩(wěn)定的“代謝廢料”，其既不結(jié)合受體也不分配入組織中，那么其必須在循環(huán)中重新找到。并不由此必需牽涉某一生理學(xué)機(jī)制，所以還可以將“測定/測量內(nèi)皮素的形成”認(rèn)為是測量“分泌活性”或者“分泌性內(nèi)皮素原的產(chǎn)生”。
在本申請中，待測定的肽片段的特征在于“長壽”。該術(shù)語是表示，待測定的肽片段在循環(huán)中(在全血中)的停留時間明顯比內(nèi)皮素或大內(nèi)皮素片段長。特別地，使用“長壽的”這一術(shù)語是表示，這樣的肽片段在全血和由此獲得的血漿中沒有經(jīng)歷進(jìn)一步的快速的蛋白酶解性裂解，并且與內(nèi)皮素和受體的結(jié)合速率以及可裂解片段的蛋白酶解性裂解速率相比，其以明顯更慢的速率從循環(huán)或代謝中被清除。
由于所述的較長的穩(wěn)定性或“長壽性”，在存在這樣的片段的情況下，關(guān)于已經(jīng)流逝的分泌活性的信息被存貯了一段時間，這段時間至少對于無問題的測量是合適的。如果推測，例如，內(nèi)皮素前體以單次、短時間傾出的方式釋放，那么在某一時間之后可測量的“長壽的”片段的量相當(dāng)于最初傾出的量只減去與待測量的肽片段在循環(huán)中的生理半壽期相關(guān)聯(lián)的量。另一方面，如果推測，例如，在疾病發(fā)生期間，內(nèi)皮素前體或多或少地持續(xù)產(chǎn)生，那么在上述意義上長壽的肽片段的可測量的濃度中累積性地反映了過去的前體的生理產(chǎn)生，而只是再次要減去依照其生理清除速率的在同樣的時間內(nèi)發(fā)生的肽片段濃度降低。活性內(nèi)皮素或者其前體即大內(nèi)皮素在同樣的時間內(nèi)早已進(jìn)行了加工或者從循環(huán)中清除，和例如結(jié)合在受體上，因此不再是可測量的。肽片段越長壽，或者其清除速率越小，那么測量時間點對于上述的生物標(biāo)記物(即內(nèi)皮素)“形成”的測定準(zhǔn)確性的影響就越小。在這種情形下，在較長的時間內(nèi)恒定的濃度表明，形成和清除之間達(dá)到了平衡。如果濃度降低，那么這可能表明，前體分子(例如內(nèi)皮素原)的分泌已經(jīng)終止，例如因為分子儲庫被耗盡，和待觀察的濃度變化只由清除速率決定。
因此，沒有已知的生理功能的長壽肽片段的測量結(jié)果不僅定量地而且定性地提供了與相當(dāng)短壽的活性肽或者其同樣相對短壽的前體的測量不同的結(jié)果。
下面將詳細(xì)描述的申請人的研究表明，上述的方法在測定內(nèi)皮素形成的情況下提供了富有成效的結(jié)果。
所實施的研究和這些研究的最重要的結(jié)果在下文中將進(jìn)行更準(zhǔn)確的解釋，其中將參考附圖。


圖1在實驗部分更準(zhǔn)確描述的目前優(yōu)選的三明治測定法的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便測定人血漿中的C-末端內(nèi)皮素原肽序列，所述三明治測定法使用兩種抗體，其結(jié)合相當(dāng)于前內(nèi)皮素原-1的位置168-181和200-212的氨基酸序列；圖2圖，其顯示了，在敗血癥和心臟病患者的EDTA-血漿樣品于室溫放置12小時的情況下，在根據(jù)圖1的測定法中沒有出現(xiàn)顯著的免疫反應(yīng)性的損失；圖3a與顯然健康的個體的測量相比較，具有不同的疾病/診斷的5組人類患者的血漿測量；點狀線表示在健康個體中發(fā)現(xiàn)的最大值(基于健康的對照，100％特異性的線)；圖3b與圖3a相應(yīng)的圖，其對于另4組的患者血清。
本發(fā)明的方法在其最總括的方面涉及，當(dāng)嚴(yán)重疾病時，在患者的全血、血漿或血清樣品(即循環(huán))中測定內(nèi)皮素原-1的相對長壽的肽片段，其不含有內(nèi)皮素-1或者其前體即大內(nèi)皮素的氨基酸序列，以便間接地測定內(nèi)皮素(特別是內(nèi)皮素-1)的形成。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，所測定的肽片段是C-末端片段，有兩種抗體與之結(jié)合，這兩種抗體可結(jié)合具有相當(dāng)于前內(nèi)皮素原-1的位置168-181和200-212的氨基酸序列的肽。
對于本發(fā)明的實際轉(zhuǎn)化，特別優(yōu)選的是計劃采用非競爭性三明治測定法，例如用于繼續(xù)的深入研究并在下文中將更準(zhǔn)確地進(jìn)行描述的這種類型的。
相對于競爭性免疫測定法，非競爭性三明治免疫測定法(雙側(cè)免疫測定法)具有許多優(yōu)點，包括能夠比固相測定法(異相測定法)更好地進(jìn)行設(shè)計，能夠在可操作性方面更穩(wěn)固，能夠以更高的靈敏度提供測量結(jié)果，以及還更好地適合于自動化和批量測量。此外，與只用一種類型的抗體進(jìn)行工作的競爭性免疫測定法相比，非競爭性三明治免疫測定法還能夠提供額外的信息，這是通過三明治免疫測定法只識別這樣的分子或肽而完成的，即在這些分子或肽中，于同一個分子上存在兩個對于為了形成三明治而使用的抗體的結(jié)合位點。
原則上，可使用的抗體可以是任何合適的單克隆和/或多克隆抗體，但是，其中經(jīng)親和純化的多克隆抗體在目前是優(yōu)選的。
特別優(yōu)選的是通過用抗原免疫動物(特別是綿羊)而獲得的抗體，所述抗原含有相應(yīng)于前內(nèi)皮素原-1的短氨基酸序列并在N-末端具有額外的半胱氨酸殘基的合成的肽序列。在隨后的實驗部分，特別描述了結(jié)合第161-181位和第200-212位的氨基酸序列的抗體或其在測定法中的應(yīng)用。但是，在研究的范圍內(nèi)還可以使用另外的抗體，其相應(yīng)地結(jié)合位置184-203和136-148。在測量中使用這些其他的抗體而獲得的額外的結(jié)果在本申請中只是概括性地進(jìn)行了討論。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法作為異相(heterogener)三明治免疫測定法來施行，其中一種抗體固定在任意的固相上，例如涂覆的測試小管(例如由聚苯乙烯制成；“包被的管(Coated Tubes)”；CT)的壁，或者固定在例如由聚苯乙烯制成的微量滴定板上，或者固定在顆粒例如磁性顆粒上，而另一種抗體具有這樣的殘基，即該殘基是可直接檢測的標(biāo)記物或使得能夠選擇性地與標(biāo)記物相連接，和有助于檢測所形成的三明治結(jié)構(gòu)。使用合適的固相的、在時間上延遲的或者說隨后的固定化也是可能的。
原則上，可以使用所有在所述類型的測定法中可使用的標(biāo)記技術(shù)，屬于此的有用放射性同位素、酶、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或生物發(fā)光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，和直接通過視覺可檢測的顏色標(biāo)記，例如金原子和染料微粒，正如其特別用于所謂的床旁(Point-of-Care，POC)測試或快速測試用于在全血樣品中的測定。在異相三明治免疫測定法的情況下，兩種抗體還可以具有下文中關(guān)于單相測定法(homogenenAssays)所描述的類型的檢測系統(tǒng)的部分。
因此，將本發(fā)明的方法布置成快速測試也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
此外，本發(fā)明的方法可以布置成單相方法，其中由兩種抗體和待檢測的肽片段所形成的三明治復(fù)合物保持懸浮在液相中。在這樣的情況下，優(yōu)選的是用檢測系統(tǒng)的部分標(biāo)記兩種抗體，如果兩種抗體整合入單個的三明治中，那么所述的檢測系統(tǒng)使得能夠產(chǎn)生信號或觸發(fā)信號。這樣的技術(shù)特別可布置成熒光增強(qiáng)或熒光猝滅檢測方法。一種特別優(yōu)選的這一類型的方法涉及使用成對使用的檢測試劑，如其例如在US-A-4 822 733、EP-B1-180 492或EP-B1-539 477以及其中所引用的現(xiàn)有技術(shù)中所描述的。其使得能夠直接在反應(yīng)混合物中進(jìn)行只選擇性地包括反應(yīng)產(chǎn)物的測量，所述反應(yīng)產(chǎn)物含有在單個免疫復(fù)合物中的兩個標(biāo)記組分。作為實例可參見以商標(biāo)TRACE(時間分辨擴(kuò)增穴合物發(fā)射(Time Resolved Amplified Cryptate Emission))或KRYPTOR提供的技術(shù)，其實現(xiàn)了上述申請的教導(dǎo)。
在申請人的研究中證實了，根據(jù)本發(fā)明測定前內(nèi)皮素原-1的C-末端肽片段提供了非常有意義的且相關(guān)的測量結(jié)果。正如下文中將要證實的，該信息不僅可應(yīng)用于敗血癥的診斷，而且可應(yīng)用于心臟病的診斷和癌癥的診斷。
此外，認(rèn)為本發(fā)明的測定方法還可以特別有利地在所謂的多參數(shù)診斷的范圍內(nèi)進(jìn)行實施，而且不僅可以應(yīng)用于心臟病診斷的領(lǐng)域，還可以應(yīng)用于敗血癥和癌癥診斷的領(lǐng)域。其他在此確定的參數(shù)例如為心臟參數(shù)ANP、BNP、proANP、proADM或proBNP，或者敗血癥參數(shù)，其例如選自抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體，蛋白質(zhì)降鈣素原，CA 125，CA 19-9，S100B，S100A-蛋白質(zhì)，LASP-1，可溶的細(xì)胞角蛋白片段，特別是CYFRA 21、TPS和/或可溶的細(xì)胞角蛋白-1片段(sCY1F)，肽Inflammin和CHP，其他肽類激素原，甘氨酸-N-?；D(zhuǎn)移酶(GNAT)，氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)和C-反應(yīng)性蛋白(CRP)或者其片段。在所述的多參數(shù)測定的情況下，預(yù)定同時或平行地測定多個參數(shù)的測量結(jié)果，并例如借助于計算機(jī)程序進(jìn)行評價，所述計算機(jī)程序還利用診斷上顯著的參數(shù)相關(guān)性。
在下文中，將通過對下述內(nèi)容的描述而更詳細(xì)地說明本發(fā)明優(yōu)選的測定法組分的制備，三明治類型的測定法的優(yōu)選實施方案的實施，和通過使用這樣的測定法而獲得的對照個體以及敗血癥、心臟病和癌癥患者的EDTA-血漿中的C-末端肽片段的測定結(jié)果。
實驗部分A.材料和方法1.肽的合成來源于已知的人前內(nèi)皮素原-1的氨基酸序列(SEQ ID NO1)，選擇出三個區(qū)域(位置168-181、184-203、200-212)。在每種情況下，以補(bǔ)充N-末端半胱氨酸殘基的方式，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法作為可溶的肽化學(xué)合成這些區(qū)域，純化，借助于質(zhì)譜法和反相HPLC進(jìn)行質(zhì)量控制，并凍干成等分試樣(JERINI AG公司，柏林，德國)。這些肽的氨基酸序列如下肽PCT15 (168-181+N-末端半胱氨酸)CRSSEEHLRQTRSET (SEQ ID NO4)肽PCW14 (200-212+N-末端半胱氨酸)CSRERYVTHNRAHW (SEQ ID NO5)肽PNR20 (184-203+N-末端半胱氨酸)NSVKSSFHDPKLKGKPSRER (SEQ ID NO6)。
此外，作為用于校準(zhǔn)測定法的標(biāo)準(zhǔn)，合成了下述的肽標(biāo)準(zhǔn)肽PSW44(169-212)SSEEHLRQTRSETMRNSVKSSFHDPKLKGKPSRERYVTHNRAHW(SEQ ID NO7)。
2.綴合和免疫借助于MBS(間馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯)，將肽PCT15和PCW14綴合在載體蛋白KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)上(參見操作指南“NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers”，PIERCE公司，Rockford，IL，USA)。根據(jù)下述的計劃方案，用這些綴合物免疫綿羊起初，每只綿羊得到100μg綴合物(基于綴合物的肽部分的質(zhì)量值)，隨后，每4個星期給予每只綿羊50μg綴合物(基于綴合物的肽部分的質(zhì)量值)。從開始免疫之后的第4個月開始，每4個星期對于每只綿羊抽血700ml，并通過離心從中獲得抗血清。綴合、免疫和抗血清的獲得由MicroPharm公司(Carmarthenshire，UK)來實施。
3.抗體的純化在1-步驟方法中，從在免疫之后的第4個月開始而獲得的抗血清中制備肽特異性抗體。
為此，首先將肽PCT15和PCW14偶聯(lián)在SulfoLink凝膠上(參見操作指南“SulfoLink Kit”，PIERCE公司，Rockford，IL，USA)。在此，每次對于每5ml凝膠提供5mg肽用于偶聯(lián)。
從綿羊抗這兩種肽的抗血清中親和純化出肽特異性抗體如下進(jìn)行首先，肽柱每次用10ml洗脫緩沖液(50mM檸檬酸，pH 2.2)和結(jié)合緩沖液(100mM磷酸鈉，0.1％Tween，pH 6.8)交替地洗滌三次。將100ml抗血清通過0.2μm進(jìn)行過濾，并摻入存在的柱材料中。為此，將凝膠定量地用10ml結(jié)合緩沖液從柱中漂洗出來。在室溫下，搖動溫育過夜。將溫育混雜物定量地轉(zhuǎn)移至空的柱(NAP 25，Pharmacia，排空的)中。丟棄流出物。隨后，用250ml結(jié)合緩沖液洗滌至無蛋白質(zhì)(洗滌洗出液的蛋白質(zhì)含量＜0.02，A280nm)。向經(jīng)洗滌的柱添加洗脫緩沖液，并以1ml的體積收集級分。借助于BCA-方法(參見操作指南，PIERCE公司，Rockford，IL，USA)測定每個級分中的蛋白質(zhì)含量。匯集蛋白質(zhì)濃度＞0.8mg/ml的級分。在借助于BCA-方法對匯集物進(jìn)行蛋白質(zhì)測定之后，收獲了97mg抗-PCT15抗體0407-pAk，和60mg抗-PCW14抗體0410-pAk。
4.標(biāo)記將抗-PCW14抗體0410-pAk如下進(jìn)行處理根據(jù)操作指南，通過NAP-5凝膠過濾柱(Pharmacia)將500μl純化的抗體重新緩沖在1ml 100mM磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)中?？贵w溶液的蛋白質(zhì)濃度測定的結(jié)果是1.5mg/ml。
對于抗體的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，向67μl抗體溶液中摻入10μl MA70-吖啶鎓-NHS-酯(1mg/ml；HOECHST Behring公司)，并在室溫下溫育15分鐘。然后，加入423μl 1M甘氨酸，并再溫育10分鐘。隨后，根據(jù)操作指南，通過NAP-5凝膠過濾柱(Pharmacia)將標(biāo)記混雜物重新緩沖在1ml移動相A(50mM磷酸鉀，100mM NaCl，pH 7.4)中，并在此除去低分子量成分。為了分離未結(jié)合在抗體上的標(biāo)記物的最后的殘留物，進(jìn)行凝膠過濾-HPLC(柱Waters Protein Pak SW300)。施加樣品，并以1ml/分鐘的流速用流動相A施行色譜法。用流式光度計(Duchfluβphotometer)測量波長280nm和368nm。作為抗體標(biāo)記程度的量度的吸收率368nm/280nm在峰值為0.10。收集含有單體抗體的級分(保留時間8-10分鐘)，并收集在3ml 100mM磷酸鈉，150mM NaCl，5％牛血清清蛋白，0.1％疊氮化鈉，pH 7.4。
5.偶聯(lián)將抗-PCT15抗體0407-pAk如下進(jìn)行處理將經(jīng)輻射的5ml聚苯乙烯小管(Greiner公司)用純化的抗體如下進(jìn)行包被將抗體在50mM Tris，100mM NaCl，pH 7.8中稀釋至6.6μg/ml的濃度。在每個小管中，移入300μl這樣的溶液。將小管在22℃溫育20小時。吸去溶液。然后，用4.2ml 10mM磷酸鈉，2％Karion FP，0.3％牛血清清蛋白，pH 6.5充滿每個小管。20小時后，吸去溶液。最后，將小管在真空干燥器中進(jìn)行干燥。
B.免疫測定法的實施和評價制備具有下列組成的測定法緩沖液100mM磷酸鈉，150mM NaCl，5％牛血清清蛋白(BSA)，0.1％非特異性綿羊IgG，0.1％疊氮化鈉，pH7.4。
上述化學(xué)合成的肽(肽PSW44)用作標(biāo)準(zhǔn)材料，其相當(dāng)于前內(nèi)皮素原-1的位置169-212。該肽在馬正常血清(SIGMA公司)中作系列稀釋。將根據(jù)稱量肽而得到的濃度歸因于如此制備的標(biāo)準(zhǔn)。
測量樣品為看上去健康的個體、患敗血癥的患者和患不同的心血管疾病的患者的EDTA-血漿。
在測試小管中，移入50μl標(biāo)準(zhǔn)或樣品以及200μl測定法緩沖液。在22℃，搖動溫育2小時。然后，以每次每個小管1ml洗滌溶液(0.1％Tween 20)洗滌4次，并讓其控干。然后，移入200μl測定法緩沖液，其含有1百萬RLU(相對光單位)的MA70-標(biāo)記的抗體。在22℃，搖動溫育2小時。然后，以每次每個小管1ml洗滌溶液(0.1％Tween 20)洗滌4次，控干，并在發(fā)光計(BERTHOLD公司，LB952T；Basisreagenzien BRAHMS AG)中測量結(jié)合在小管上的化學(xué)發(fā)光。
使用軟件MultiCalc(Spline Fit)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品的濃度。
C.結(jié)果用所開發(fā)出的三明治免疫測定法(針對位置168-181和200-212的抗體)可測量的分析物在下文中稱為C-末端-內(nèi)皮素原或者Ct-內(nèi)皮素原。所開發(fā)出的測試的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示在圖1中。使用該測試，還能夠測定遠(yuǎn)低于50pg/ml的Ct-內(nèi)皮素原的濃度。
為了檢查在測量C-末端肽片段時，是否必須考慮由于在樣品或測量溶液中的穩(wěn)定性不足而引起的問題這一疑問，將5個敗血癥血漿每次在新鮮時和貯存12小時之后于室溫進(jìn)行測量。結(jié)果概括在圖2中。其顯示出，在貯存12天之后，免疫反應(yīng)性仍有最初測量的免疫反應(yīng)性的大約93％，幾乎沒有變化。這種所檢測的穩(wěn)定性從對于診斷的操作觀點來看是很大的優(yōu)點。
使用該測試，測量了心臟病以及敗血癥患者的血漿。獲得的結(jié)果顯示在圖3a和3b中。對于所有的被研究的心臟病疾病病狀，發(fā)現(xiàn)對于正常對照均具有升高的值。同樣地，對于患有SIRS(全身性炎癥反應(yīng)綜合征)和敗血癥狀況的患者也發(fā)現(xiàn)具有升高的值。在此，診斷靈敏度(當(dāng)基于健康的對照，給定100％的特異性時)隨著疾病的嚴(yán)重程度而升高敗血癥32.3％，嚴(yán)重的敗血癥65.5％，和感染性休克75％。
當(dāng)用經(jīng)修改的測定法測量樣品時，如所預(yù)期的，得到了基本上相同的結(jié)果，在該經(jīng)修改的測定法中，上述三明治測定法的一種抗體用識別前內(nèi)皮素原-1的第184-203位氨基酸的抗體替代。
與此相反，如果所使用的抗體中的一種抗體識別位于更接近前內(nèi)皮素原的N-末端方向的氨基酸序列(32-52或136-148)，則不能獲得相對于健康個體來說升高的測量值。這表明，內(nèi)皮素原本身不存在于所測量的血漿樣品中，并且不僅經(jīng)蛋白酶解進(jìn)行加工而形成大內(nèi)皮素，而且在此釋放的C-末端序列93-212還進(jìn)一步進(jìn)行裂解，其中至少一個這樣的裂解位點必須位于第149-167位氨基酸的范圍內(nèi)。該信息適用于具有所研究的疾病的患者的血漿。但是，不能排除，在其他患者組中仍然獲得例如完整的C-末端片段93-212，和其選擇性的測量能夠提供在診斷上相關(guān)的結(jié)果。
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Ser Gln Lys Asp Lys Lys Cys Trp Asn Phe Cys Gln Ala Gly Lys Glu115 120 125Leu Arg Ala Glu Asp Ile Met Glu Lys Asp Trp Asn Asn His Lys Lys130 135 140Gly Lys Asp Cys Ser Lys Leu Gly Lys Lys Cys Ile Tyr Gln Gln Leu145 150 155 160Val Arg Gly Arg Lys Ile Arg Arg Ser Ser Glu Glu His Leu Arg Gln165 170 175Thr Arg Ser Glu Thr Met Arg Ash Ser Val Lys Ser Ser Phe His Asp180 185 190Pro Lys Leu Lys Gly Lys Pro Ser Arg Glu Arg Tyr Val Thr His Ash195 200 205Arg Ala His Trp210<210>2<211>21<212>PRT<213>智人<400>2Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His1 5 10 15Leu Asp Ile Ile Trp20<210>3<211>37<212>PRT<213>智人<400>3
Cys Ser Cys Ser Ser Leu Met Asp Lys Glu Cys Val Tyr Phe Cys His1 5 10 15Leu Asp Ile Ile Trp Val Asn Thr Pro Glu His Val Val Pro Tyr Gly20 25 30Leu Gly Ser Pro Arg Ser35<210>4<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述具體末端C的部分EN1序列<400>4Cys Arg Ser Ser Glu Glu His Leu Arg Gln Thr Arg Ser Glu Thr1 5 10 15<210>5<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述具體末端C的部分EN1序列<400>5Cys Ser Arg Glu Arg Tyr Val Thr His Asn Arg Ala His Trp1 5 10<210>6<211>20<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述具體末端C的部分EN1序列<400>6Asn Ser Val Lys Ser Ser Phe His Asp Pro Lys Leu Lys Gly Lys Pro1 5 10 15Ser Arg Glu Arg20<210>7<211>44<212>PRT<213>智人<400>7Ser Ser Glu Glu His Leu Arg Gln Thr Arg Ser Glu Thr Met Arg Asn1 5 10 15Ser Val Lys Ser Ser Phe His Asp Pro Lys Leu Lys Gly Lys Pro Ser20 25 30Arg Glu Arg Tyr Val Thr His Asn Arg Ala His Trp35 40
權(quán)利要求
1.在嚴(yán)重疾病的情況下，特別是在心血管疾病、炎癥、敗血癥和癌癥的情況下，出于醫(yī)學(xué)診斷目的而測定人類患者的全血、血漿或血清中的內(nèi)皮素形成的體外方法，其特征在于，測量內(nèi)皮素-1(SEQ ID NO2)和大內(nèi)皮素-1(SEQ ID NO3)的形成，方法是測定前內(nèi)皮素原-1(SEQ ID NO1)的這樣的C-末端片段，其被與相應(yīng)于前內(nèi)皮素原-1的第93-212位氨基酸范圍內(nèi)的肽序列的肽相結(jié)合的抗體識別。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，借助于免疫測定法來進(jìn)行生物流體中的測定，所述免疫測定法用至少一種只特異地識別待測定的肽片段的、經(jīng)標(biāo)記的抗體來進(jìn)行工作。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述免疫測定法是競爭性免疫測定法或三明治免疫測定法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，測定前內(nèi)皮素原-1的這樣的C-末端片段，其被與相應(yīng)于前內(nèi)皮素原-1的第168-212位氨基酸(SEQ ID NO7)范圍內(nèi)的肽序列的肽相結(jié)合的抗體識別。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，使用抗體對來測定具有前內(nèi)皮素原-1的第168-212位氨基酸(SEQ ID NO7)的C-末端片段，所述的抗體對結(jié)合選自具有前內(nèi)皮素原-1的第168-181位、第184-203位和第200-212位氨基酸的肽序列的兩種不同的肽序列。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于，其是用于定量或半定量測定待測定的肽片段的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于，其是免疫層析床旁測試法或其他快速測定法。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項的方法，其特征在于，用于測定的抗體是單克隆抗體和/或經(jīng)親和純化的多克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一項的方法，其特征在于，使用通過用抗原免疫動物而獲得的抗體，所述抗原含有選自肽(SEQ ID NO4)、(SEQ ID NO5)和(SEQ ID NO6)的合成的肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項的方法，其特征在于，使用兩種抗體用于測定，這兩種抗體中的一種進(jìn)行標(biāo)記，而另一種結(jié)合在固相上或者可以選擇性地結(jié)合在固相上。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項的方法，其特征在于，使用兩種抗體用于測定，這兩種抗體分散存在于液態(tài)反應(yīng)混合物中，其中第一種抗體結(jié)合第一種標(biāo)記組分，該標(biāo)記組分是基于熒光或化學(xué)發(fā)光猝滅或增強(qiáng)的標(biāo)記系統(tǒng)的部分，和第二種抗體結(jié)合該標(biāo)記系統(tǒng)的第二種標(biāo)記組分，從而在這兩種抗體結(jié)合在待檢測的肽片段上之后，產(chǎn)生了可測量的信號，該信號使得能夠檢測在測量溶液中形成的三明治復(fù)合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于，所述標(biāo)記系統(tǒng)包含稀土元素穴狀化合物或螯合物，以及熒光或化學(xué)發(fā)光染料，特別是花青類型的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的方法，其特征在于，用于敗血癥的診斷以確定嚴(yán)重程度和進(jìn)行預(yù)后，以及用于敗血癥的與過程相伴的治療控制。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于，其在多參數(shù)測定的范圍內(nèi)施行，在所述的多參數(shù)測定中同時測定至少另一個與敗血癥診斷相關(guān)的參數(shù)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于，另外的與敗血癥診斷相關(guān)的參數(shù)選自抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體，蛋白質(zhì)降鈣素原，CA125，CA19-9，S100B，S100A-蛋白質(zhì)，LASP-1，可溶的細(xì)胞角蛋白片段，特別是CYFRA21、TPS和/或可溶的細(xì)胞角蛋白-1片段(sCY1F)，肽Inflammin和CHP，激素原pro-ANP、pro-BNP或pro-ADM的片段，甘氨酸-N-酰基轉(zhuǎn)移酶(GNAT)，氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)和C-反應(yīng)性蛋白(CRP)或者其片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的方法，其特征在于，其用于心臟病診斷的領(lǐng)域。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其特征在于，其在多參數(shù)測定的范圍內(nèi)施行，在所述的多參數(shù)測定中同時測定其他與心臟病診斷相關(guān)的參數(shù)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的方法，其特征在于，其用于癌癥診斷的領(lǐng)域。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于，其在多參數(shù)測定的范圍內(nèi)施行，在所述的多參數(shù)測定中同時測定其他與癌癥診斷相關(guān)的參數(shù)。
20.抗體，其特異地結(jié)合由相應(yīng)于前內(nèi)皮素原-1的第168-181位、第184-203位和第200-212位氨基酸的氨基酸序列組成的肽。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的抗體，其特征在于，其是經(jīng)親和純化的多克隆抗體或單克隆抗體。
22.用于實施根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項的方法的試劑盒，其特征在于，其至少包含(a)根據(jù)權(quán)利要求20和21中任一項的第一種抗體，(b)根據(jù)權(quán)利要求20和21中任一項的第二種其他抗體，其中一種抗體進(jìn)行標(biāo)記，而另一種抗體被固定化或者是可固定化的，以及(c)具有至少包含前內(nèi)皮素原的第168-203位或第168-212位氨基酸的氨基酸序列的標(biāo)準(zhǔn)肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的試劑盒，其特征在于，固定化的抗體以固定在測試小管的壁上的方式存在(CT)。
全文摘要
本發(fā)明涉及在嚴(yán)重疾病的情況下，特別是在心血管疾病、炎癥、敗血癥和癌癥的情況下，出于醫(yī)學(xué)診斷目的而測定人類患者的全血、血漿或血清中的內(nèi)皮素形成的體外方法，在該方法中，測定經(jīng)加工的原初前內(nèi)皮素原或內(nèi)皮素原的相對長壽的肽片段，特別是C－末端肽片段，所述肽片段既不包含真正的具有生物活性的內(nèi)皮素，也不包含其直接的前體，即大內(nèi)皮素。
文檔編號G01N33/68GK1918473SQ200580004634
公開日2007年2月21日 申請日期2005年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月13日
發(fā)明者A·貝格曼, J·施圖克 申請人:B.R.A.H.M.S股份公司