專利名稱：核酸檢測方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及核酸檢測方法及其應用，具體涉及高效率地擴增試料中微量核酸，并準確且迅速地檢測的方法，以及涉及應用該方法的基因檢測試劑盒。
背景技術：
在調查有無某一特定核酸或基因的存在時，采用擴增靶核酸或基因，并檢測其擴增產物的方法。作為將靶核酸或基因特異性擴增的方法，公知有PCR法(例如參照非專利文獻1、2)、RT-PCR法(例如參照非專利文獻1、2)、ICAN法(例如參照專利文獻1)、LAMP法(例如參照非專利文獻3)、RCA法(例如參照非專利文獻4)、引子延伸(primer extension)法(例如參照非專利文獻5)等。其中最常用PCR法、RT-PCR法。這些方法是使用包含目標核酸的鹽基序列的短的核酸作為引子，用體外(in vitro)進行DNA聚合酶或RNA聚合酶的鑄模特異性核酸合成反應的方法。
另外，在上述核酸擴增方法中，通過利用適當?shù)氖侄螌υ跀U增反應中或擴增反應后擴增的核酸片斷進行標記，能夠檢測出試料中僅存少量的核酸。另外，已知有使用隨機的鹽基序列的引子并非特異性地擴增及標記核酸，并用它檢測核酸的DNA微陣列(Microarray)法或差異顯示法等。近年，網羅地檢測與各式各樣的疾病相關聯(lián)的基因的DNA微陣列非常受人們注目。
另外，在調查某一特定核酸或基因時，作為上述核酸擴增方法以外的方法，有將組織或細胞中成為靶的核酸，以包含與其互補的鹽基序列的標記的核酸作探針雜交的ISH法(原位(in situ)雜交法)或FISH法(熒光原位雜交法)(例如參照非專利文獻1)。ISH法廣泛用于組織內特定基因的發(fā)現(xiàn)有無或量的比較。FISH法廣泛用于染色體上特定基因區(qū)域的判別。
另外，也有用PCR法擴增靶核酸，并通過ISH法利用探針雜交，最終用顯微鏡檢測的原位PCR法(例如參照非專利文獻2)，但由于很難給出反應最適條件，缺乏再現(xiàn)性，沒有得到普及。
本申請人，作為體外診斷用藥品(認證號AMZ00620000)銷售基于ISH法的末梢血白血球中的細菌檢測試劑盒(“ハイブリゼツプ(注冊商標)”)。當采用該試劑盒(“ハイブリゼツプ(注冊商標)”)時，與以往采用的血液培養(yǎng)法相比，可以約4倍的靈敏度檢測菌，至少可將需要3日以上的檢查在1日內進行，因此登上感染癥領域的舞臺(例如，參照非專利文獻6)。還有，本申請人提出了基于ISH法用以檢測及鑒定被吞噬細胞貪食的外來微生物的方法(參照專利文獻2)及其改良方法(參照專利文獻3)，該試劑盒(“ハイブリゼツプ(注冊商標)”)是基于這些發(fā)明開發(fā)的商品。
(專利文獻1)日本專利第3433929號公報(登記日2003年5月30日，發(fā)行日2003年8月4日)(專利文獻2)國際公開WO89/10411(國際
公開日1989年11月2日，對應公告公報日本特公平07-40號)(專利文獻3)國際公開WO02/099133(國際
公開日2002年12月12日)(非專利文獻1)J.Sambrook et al.“Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Third Edition”Cold Spring Harbor Laboratory(2001)(非專利文獻2)主編真木壽治，“PCR Tips-用以運用自如的要點與啟示-”(PCR Tips-使いこなすためのコツとヒント-)秀潤社(1999)(非專利文獻3)Tsugunori Notomi et al.Loop-mediated isothermalamplification of DNA.Nucleic Acids Research，vol.28，No.12e63(2000)(非專利文獻4)Lizardi PM et al.Mutation detection and single-moleculecounting using isothermal rolling-circle amplification.Nature Genetics，jul；19(3)225-32.(1998)(非專利文獻5)B.D.Hames，S.J.Higgins著，堀越正美譯“基因發(fā)現(xiàn)與轉錄因子”Medical Sciences International(1996)(非專利文獻6)松久明生、荒木宏昌，“基于原位雜交法的敗血癥診斷的臨床有用性”，BIO Clinica，北隆館，1999年，14卷、1號，p.97-101這里，用于調查有無某一特定核酸或基因存在的場合。在采用上述PCR法等的核酸擴增方法或ISH法等雜交法的方法中，若在試料中作為靶的核酸或基因只微量存在，則有不能實現(xiàn)充分的檢測靈敏度、再現(xiàn)性、簡便性等場合的課題。
首先，在采用PCR法等核酸擴增方法的方法中，需要從試料抽取核酸。在抽取該核酸的過程中，難以避免發(fā)生核酸的損耗。例如，即便試料中包含作為擴增用的鑄模所必要的量的靶核酸，也因核酸抽取過程的損耗而不能回收作為鑄模所必要的量的場合，擴增效率下降，因此不能將靶核酸充分擴增，出現(xiàn)不能檢測出試料中靶核酸的場合。在這種情況下，成為假陰性，得不到準確的結果。另外，即便在采用同一試料的場合，根據核酸抽取過程的損耗程度，可能得到不同的結果，缺乏再現(xiàn)性。即，在需要抽取核酸的核酸擴增方法中，若試料中包含的靶核酸非常微量，則存在因核酸抽取過程的核酸損耗而導致擴增效率下降帶來檢測靈敏度下降的問題。
另外，在試料溶液中也有包含阻礙擴增反應的物質(例如肝素、界面活性劑、蛋白質變性劑、有機溶劑等)的場合，與上述同樣，存在因擴增效率的下降而導致檢測靈敏度下降的問題。
接著，在采用ISH法等雜交法的方法中，由于無需從試料抽取核酸，不會出現(xiàn)核酸的損耗，但試料中包含的靶核酸非常微量時，存在難以檢測出靶核酸與形成雜種的探針核酸的問題。
另外，本申請人開發(fā)的試劑盒(“ハイブリゼツプ(注冊商標))可基于ISH法高靈敏度且迅速檢測出末梢血的白血球中的細菌，但其要克服的課題可列舉以下兩點1)菌的信號的有無依賴于用顯微鏡的肉眼觀察，要求一定程度的熟練度；2)只有被白血球貪食的細菌才為檢測靶，因此對于白血球數(shù)減少的患者的臨床檢體來說檢測率下降。
本發(fā)明鑒于上述問題構思，其目的在于提供即便試料中包含的靶核酸非常微量，也能準確且迅速地檢測出靶核酸的核酸檢測方法。
發(fā)明的公開本發(fā)明人為解決上述課題積極研究的結果，發(fā)現(xiàn)將試料固定于支持體中，并且不從試料抽取核酸而直接在支持體上擴增核酸，從而不會招來伴隨試料中核酸損耗的檢測靈敏度的下降，可簡便且迅速地檢測出試料中的靶核酸，以至完成本發(fā)明。即本發(fā)明包括以下的發(fā)明。
(1)一種核酸檢測方法，其特征在于包括將包含細胞的試料固定于支持體的試料固定化工序；將試料中的核酸在支持體上擴增的核酸擴增工序；以及判定擴增的核酸是否為靶核酸的判定工序。
(2)根據(1)所述的核酸檢測方法，其特征在于在上述核酸擴增工序的前段，包括使試料中包含的核酸露出的核酸露出工序。
(3)根據(2)所述的核酸檢測方法，其特征在于作為上述核酸露出工序中的核酸露出方法，采用界面活性劑處理法、加酶處理法或加熱處理法中任一種方法，或者組合兩種以上方法加以使用。
(4)根據(1)至(3)中任一項所述的核酸檢測方法，其特征在于作為上述核酸擴增工序中的核酸擴增方法，采用PCR(聚合酶連鎖反應)法。
(5)根據(1)至(4)中任一項所述的核酸檢測方法，其特征在于上述核酸擴增工序中標記擴增的核酸。
(6)根據(5)所述的核酸檢測方法，其特征在于作為上述判定工序中的判定方法，將核酸擴增工序中擴增且標記的核酸作探針，以該探針與已知基因片斷的互補的雜交為指標判定是否為靶核酸。
(7)根據(6)所述的核酸檢測方法，其特征在于上述已知基因片斷預先固定于支持體。
(8)根據(5)所述的核酸檢測方法，其特征在于作為上述判定工序中的判定方法，將核酸擴增工序中擴增且標記的核酸作探針，利用DNA微陣列判定是否為靶核酸。
(9)根據(1)至(8)中任一項所述的核酸檢測方法，其特征在于上述試料為生物源試料。
(10)根據(9)所述的核酸檢測方法，其特征在于上述生物源試料源自人體。
(11)一種基因檢測試劑盒，用以實施(1)至(10)中任一項所述的核酸檢測方法，該試劑盒用于檢測試料中的靶基因。
(12)一種基因檢測試劑盒，用以實施(10)所述的核酸檢測方法，該試劑盒用于檢測人體的疾病關聯(lián)基因。
(13)根據(12)所述的基因檢測試劑盒，其中，上述人體的疾病關聯(lián)基因為人體感染的感染癥原因微生物的基因。
(14)根據(13)所述的基因檢測試劑盒，其中，上述人體感染的感染癥原因微生物的基因為藥劑耐性基因。
(15)根據(13)所述的基因檢測試劑盒，其中，上述人體感染的感染癥原因微生物的基因為藥劑感受性基因。
(16)根據(12)所述的基因檢測試劑盒，其中，上述人體的疾病關聯(lián)基因為癌標準基因。
(17)根據(12)所述的基因檢測試劑盒，其中，上述人體的疾病關聯(lián)基因為遺傳性疾病關聯(lián)基因。
(18)根據(11)至(17)中任一項所述的基因檢測試劑盒，其特征在于至少包括靶基因擴增引子、PCR反應用緩沖液、脫氧核苷三磷酸混合液、標記脫氧核苷三磷酸、耐熱性DNA合成酶、試料固定化用支持體、擴增核酸檢測用指示藥。
依據上述構成，即便試料中包含的靶核酸非常微量，也能不引起由核酸抽取導致的核酸損耗而高靈敏度、高精度且再現(xiàn)性良好地檢測出靶核酸。另外，可簡便且迅速地實施，且結果的判定不需要熟練度。
本發(fā)明的其它的目的、特征及優(yōu)點，根據以下所示的記載將充分給出。另外，本發(fā)明的優(yōu)點，通過借助附圖的以下說明將更加清晰。
附圖的簡單說明

圖1是一例本發(fā)明的核酸檢測方法的示圖。
圖2是表示試料采用貪食樣品，并通過本發(fā)明的核酸檢測方法檢測被白血球貪食的微生物的結果的電泳圖像。
圖3是表示試料采用敗血癥患者的臨床檢體，并通過本發(fā)明的核酸檢測方法檢測被白血球貪食的微生物的結果的電泳圖像。
圖4是表示試料采用敗血癥血液模型，并通過本發(fā)明的核酸檢測方法檢測白血球中的IL6的發(fā)現(xiàn)增加的結果的電泳圖像。
實施本發(fā)明的最佳方式說明本發(fā)明的一實施方式，則如下。還有，本發(fā)明并不限于此。
1.本發(fā)明的核酸檢測方法本發(fā)明的核酸檢測方法的特征在于包括將包含細胞的試料固定于支持體的試料固定化工序；在支持體上擴增試料中的核酸的核酸擴增工序；以及判定擴增的核酸是否為靶核酸的判定工序。另外，核酸擴增工序的前段，可包括使試料中包含的核酸露出的核酸露出工序。圖1示出本發(fā)明的核酸檢測方法的一實施方式。在圖1所示實施方式中，在支持體上固定生物源試料(試料固定化工序)，加上包含疾病關聯(lián)基因源的引子的PCR混合料進行PCR(核酸擴增工序)。在該核酸擴增工序中對與核酸擴增同時，或在核酸擴增后擴增的核酸進行標記(將在后面詳細說明)。最后，利用電泳(瓊脂糖凝膠電泳、毛細管電泳等)、定量PCR、斑點雜交(宏陣列、微陣列等)等的核酸檢測方法，判定擴增的核酸是否為靶核酸(判定工序)。還有，本發(fā)明的核酸檢測方法并不限于圖1所示實施方式。以下就本核酸檢測方法詳細說明其特征。
(1)試料固定化工序試料固定化工序是將試料固定于支持體的工序。通過將試料固定于支持體，可省略一般在核酸擴增或標記時進行的核酸精制工序。另外，當試料溶液中含有阻礙核酸的擴增反應的物質(例如，肝素、EDTA-2Na、陽離子、高蛋白溶液、高鹽濃度溶液、界面活性劑含有溶液、蛋白變性溶液(尿素、胍鹽酸等)、有機溶劑等)時，由于這些擴增阻礙物質不會滯留在普通細胞內，可通過將試料固定于支持體來容易除去。而且，通過將試料固定于支持體，可穩(wěn)定地保存核酸。
(試料)在本發(fā)明的核酸檢測方法(以下適當簡化成“本檢測方法”)中使用的試料，只要是包含細胞的試料即可。由本檢測方法檢測的靶核酸可為DNA(脫氧核糖核酸)及RNA(核糖核酸)的任一種。由于在細胞中含有這些核酸(DNA及RNA)，可用本檢測方法檢測出其中的靶核酸。關于細胞的種類并無限定，可將動物細胞、植物細胞、微生物細胞等所有細胞作為對象。另外，試料的細胞以外的部分可在后述的核酸露出工序中通過化學處理、加酶處理、加熱處理等來消化，只要包含的細胞的核酸可以露出即可。作為本檢測方法中使用的試料，優(yōu)選包含細胞的生物源試料，但并不限定于此，在不源自生物的試料上也可適用本檢測方法。
作為不源自生物的試料，可列舉例如包含細胞的食品材料、土、水、纖維、灰塵等。作為生物源試料，可優(yōu)選使用動物及植物的生物構成組分。作為包括人體在內的動物源的試料，可列舉例如血液、組織液、淋巴液、腦脊髓液、膿、黏液、鼻涕、吐痰、尿、糞便、腹水等體液類；皮膚、肺、腎、黏膜、各種內臟器官、骨等組織；鼻腔、支氣管、皮膚、各種內臟器官、骨等清洗后的清洗液。另外，人體的場合也可將滲析排泄作為試料。
另外，本檢測方法中作為靶的核酸并不限于試料中包含的細胞固有的核酸，也可適用細胞中感染的病毒的核酸或細胞貪食的微生物等的核酸。因而，含有感染癥患者的貪食細胞(白血球等)的生物源試料適合作為本檢測方法的試料。
(支持體)支持體用于在其表面固定試料，同時在該支持體上擴增試料中的靶核酸。因而，只要是能夠達成這樣目的的支持體，其材質、形狀等并無特別限定。作為材質可列舉例如玻璃、金屬、合成樹脂(聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯酸酯、尼龍、聚縮醛、氟化樹脂等)、多糖類(纖維素、瓊脂糖等)、濾紙等。另外，作為形狀可為例如片狀、盆狀、球狀、纖維狀、棒狀、盤狀、容器狀、盒、管狀等各種形狀，只要對照實施本檢測方法的條件選擇合適的形狀即可。
對一個支持體固定1試料，使用對應于試料數(shù)的數(shù)量的支持體即可，但為了有效率地進行操作，優(yōu)選可對一個支持體固定多個試料的情況。另外，在本檢測方法中，在同一支持體上將試料固定化工序→核酸擴增工序或者試料固定化工序→核酸露出工序→核酸擴增工序作為一系列的操作進行，因此在一個支持體上固定多個試料的場合，需要使相鄰的試料不會混合。因而，作為本檢測方法中使用的支持體，優(yōu)選一個支持體上具有多個分離區(qū)域的支持體。還有，在本檢測方法的核酸擴增工序中，若利用PCR法擴增核酸，則優(yōu)選耐熱性素材。另外，尤其優(yōu)選適合市售的PCR用基因擴增設備(熱循環(huán)控制器)的形狀。
(固定)在本發(fā)明的核酸檢測方法中，固定指的是用某種方法將試料固接并保持在支持體上。在本檢測方法中使用的固定方法并無特別限定，只要適當選擇使用傳統(tǒng)公知的固定方法即可。作為公知的固定方法，可列舉利用共價鍵或離子鍵等結合到不溶性載體的載體結合法；通過交聯(lián)試劑利用共價鍵結合并不溶化的交聯(lián)法；用高分子凝膠或半透膜等包進去的包括法；利用脫水使蛋白迅速變性并固接在載體上的方法等。更具體地說，可列舉卡諾(carnoy)固定、酒精固定、火焰固定、戊二醛固定、干燥固定、丙酮固定、甲醇固定、福爾馬林固定等。
另外，在支持體表面上粘接試料的情況也包括在固定。因而，可在支持載體表面預先涂敷粘接性高的物質例如3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)、聚L-賴氨酸、凝膠等。若使用經過這種處理的支持體，則根據試料的種類能夠充分地在支持體上固接并保持。另外，在支持體上粘接并固定的基礎上，也可并用上述例示的固定方法。
(2)核酸露出工序在核酸擴增工序中為擴增試料中包含的核酸，必須使引子或核酸合成酶到達靶核酸。根據試料也有靶核酸露出在試料表面的情況，對于這種試料能夠從試料固定化工序進行直接核酸擴增工序。因而，本核酸露出工序并非本檢測方法的必須工序。但是，靶核酸不在試料表面露出時，需要設置核酸露出工序，使靶核酸露出。
作為在核酸露出工序中使用的方法，可列舉界面活性劑處理法(SDS、TRITON-X、TWEEN-20、BRIJ、NP-40、CHAPS等)、蛋白酶等的加酶處理、加熱處理法等。但是，并不限定于此，按照所使用的試料及靶核酸，可適當選擇最佳方法。例如，在細菌感染引起的敗血癥中，檢測被白血球貪食的細菌的基因時，作為消化細菌的細胞壁的酶使用溶葡球菌酶、溶菌酶、N-乙酰胞壁質酶、ZAIMORAZE等，從而能夠使細菌、真菌等微生物的基因露出。
(3)核酸擴增工序核酸擴增工序為在試料固定的支持體上擴增靶核酸的工序。這里，本發(fā)明的核酸檢測方法的最大特征在于不對試料中的核酸進行抽取、精制，而在試料固定的支持體上進行靶核酸的擴增。從而，即使靶核酸在試料中只微量存在，因不發(fā)生抽取及精制過程的損耗，也可不使檢測靈敏度下降而檢測出微量的靶核酸。另外，可實現(xiàn)操作的簡便化，并可縮短操作時間。
核酸擴增指的是利用對靶核酸的任意序列特異性的引子或隨機序列的引子和DNA聚合酶或RNA聚合酶，擴增試料中的核酸。作為擴增方法，適合采用傳統(tǒng)公知的擴增方法。具體地說，可列舉例如PCR法、Nested-PCR法、RT-PCR法、ICAN法、UCAN法、LAMP法、引子延伸法、轉錄(transcription)、復制(replication)等。
在上述例示的擴增方法中PCR法適合作為檢測方法中使用的擴增方法。以下，就本檢測方法的核酸擴增工序中使用PCR法的場合進行說明。
PCR法指的是通過夾有特定DNA區(qū)域的2種引子與DNA合成酶(耐熱性DNA聚合酶，以下酌情記為“Taq聚合酶”。)的DNA合成反應在實驗管內的反復進行，擴增其特定DNA區(qū)域的方法，是一般在基因工學領域使用的公知技術。PCR法還包括Nested-PCR法、RT-PCR法等。
Nested-PCR法指的是使用外側的引子與內側的引子進行2階段的PCR的方法，是以來自目標區(qū)域的最初擴增產物為鑄模，從最初使用的引子位置兩側均在內側設定引子進行的方法。通過使用Nested-PCR，在第1次的PCR沒有充分擴增到可檢測出靶核酸的量時，能夠通過第2次的PCR擴增到可檢測的量。另外，在第1次的PCR中產生非特異性的擴增產物時，這些非特異性擴增產物具有與第2次的PCR中的引子類似的序列的概率極低。因而，在第2次的PCR中只將具有靶的序列的片斷擴增的概率變高，從而消除因非特異性擴增產物而發(fā)生的弊端，可更準確地檢測出靶核酸。
RT-PCR法指的是用以對mRNA適用PCR的變法，是作為PCR的前階段，包括利用逆轉錄酶進行逆轉錄反應的工序的PCR法。若在本檢測方法中使用RT-PCR法，可將靶核酸作為mRNA。即，可將本檢測方法應用在基因發(fā)現(xiàn)的檢測。
如在上述(支持體)一項中所描述的那樣，本檢測方法中在固定試料的支持體上進行PCR，因此支持體優(yōu)選具有多個分離區(qū)域的支持體。作為采用具有多個分離區(qū)域的支持體時的PCR具體步驟，可將PCR混合料(混合了緩沖液、dNTPmix、Taq聚合酶等)添加在支持載體上的各區(qū)域的試料中，再加引子后利用PCR用基因擴增設備(熱循環(huán)控制器)等進行PCR。關于引子，對于1個PCR采用將各式各樣的靶核酸特異性地擴增的引子組。對于PCR的條件(反應液的量、酶或基質的濃度、反應溫度等)并無特別限定，可根據所使用的試料及靶核酸，適當選擇最佳條件。
當進行Nested-PCR時，可在支持體上進行第1次的PCR，且第2次的PCR利用PCR管等進行。還有，在第2次的PCR中使用的引子必須設計成兩側均與最初使用的引子位置相同，或者設計在內側。
由PCR擴增的片斷最好是靶核酸具有特異性的序列部分。試料中包含的核酸大多數(shù)為靶部分以外的部分，因此若不在靶微生物中特異性的序列部分設計引子，則產生非特異性擴增產物的可能性變高。因而預先調查靶核酸的特異性序列，并設計引子以擴增該序列部分變得很重要。
擴增的片斷長度最好在50bp～5,000bp的范圍內，若為100bp～2,000bp的范圍內則更好。若在該范圍以外，則有可能不能有效地獲得特異性的擴增產物。
在核酸擴增工序中，最好標記擴增的核酸。從而，能夠高效率地實施后段的判定工序。核酸的標記可與擴增同時或在擴增后進行。作為標記方法，可列舉放射性標記、半抗源(生物素、地谷新配基等)標記、螢光標記等，但并不限定于此。
作為核酸擴增方法，在與核酸的擴增同時進行的場合，進行上述的PCR法、Nested-PCR法、RT-PCR法、ICAN法、UCAN法、LAMP法、引子延伸法、轉錄(transcription)、復制(replication)等的擴增反應時，例如將由地谷新配基或生物素等的半抗源、FITC、放射性同位素標記的核苷模擬物為基質，能夠在擴增反應中標記靶核酸。另外，在擴增反應時，通過使用將末端標記的引子，可標記靶核酸。在擴增反應后標記的場合，能夠采用缺口平移(Nick Translation)法或隨機引物法、引子延伸法、TdT法、5’運動法等。該場合也可將標記的核苷模擬物作為基質，或者通過使用將末端標記的引子來標記。
在核酸擴增工序中，對靶核酸的任意序列使用特異性的引子時，可將具有已知鹽基序列的核酸片斷擴增。另一方面，當使用隨機序列的引子時，由于非特異性地核酸擴增，不能預測會生成具有何種鹽基序列的核酸片斷。若在核酸擴增工序中使用已設計成擴增具有已知鹽基序列的核酸片斷的引子，則在后述的判定工序中，通過鹽基序列的確認或與具有已知鹽基序列的核酸片斷的雜交，能夠判定是否為靶核酸。當使用隨機序列的引子時，在后述的判定工序中，通過采用DNA微陣列等，能夠判定試料中是否含有靶核酸。
(4)判定工序判定工序是判定核酸擴增工序中擴增的核酸是否為靶核酸片斷的工序。本發(fā)明的核酸檢測方法中，由于在擴增核酸后進行檢測，不會發(fā)生靶核酸微量而難以檢測的問題。另外，由于能夠適當選擇公知的方法，判定不需要熟練度。
顯然判定包括確認擴增的核酸片斷長度或鹽基序列的情況，但也可包括確認擴增的DNA片斷的轉錄產物即RNA的情況或基于擴增的核酸片斷確認發(fā)現(xiàn)的蛋白質的情況。作為在判定工序中采用的方法的具體例，確認核酸(DNA或RNA)的方法可列舉瓊脂糖凝膠電泳、定量PCR、序列(sequence)、斑點雜交、DNA微陣列、南方(southern)雜交、北方(northem)雜交等；確認蛋白質的方法可列舉SDS-PAGE、西方(western)印跡法、質量分析法(MALDI-TOF-MS、LC-MS、LC-MS/MS等)等。但是，并不限定于這些方法，可選擇適當?shù)姆椒右允褂谩?br> 作為最簡便的判定方法，可列舉瓊脂糖凝膠電泳。但是，由于該方法對從試料擴增的核酸片斷的長度與僅以靶核酸為鑄模擴增時的核酸片斷的長度進行比較，確認是否一致，所以當非特異性的擴增產物偶然為類似的長度時會導致錯誤的結果(擬陽性)。為了準確判定擴增的核酸是否與靶核酸一致，可靠性最高的方法為確認擴增核酸的鹽基序列的方法(序列)。如果采用該方法，能夠檢出SNP(single nucleotide polymorphism)。
作為簡便且準確判定靶核酸是否擴增的方法，優(yōu)選采用將標記的擴增核酸作探針，以該探針與已知基因片斷的互補的雜交為指標判定是否為靶核酸的方法。另外，當采用該方法時，作為探針的核酸最好采用設計成具有作為雜交對象的上述已知基因片斷的鹽基序列的引子進行擴增。另外，作為雜交對象的上述已知基因片斷最好預先固定于支持體上。通過預先將已知基因片斷固定于支持體，可準確捕捉與探針的雜交。另外，能夠使已知基因片斷帶上位置信息，并通過使各式各樣的已知基因片斷排列，可一次檢出許多基因。
具體地說，例如將靶核酸預先定位(固定)于尼龍膜片等，以擴增的核酸為探針進行雜交。若定位的核酸與擴增的核酸之間雜交成立，可判定試料中存在靶核酸。另一方面，在核酸擴增工序中核酸不擴增時，或者非靶核酸的核酸非特異性地擴增時，雜交不成立，可判定試料中存在靶核酸。
作為雜交的對象的上述已知基因片斷，如果包含通過核酸擴增工序擴增的預定的鹽基序列部分，就無特別限定，但最好只是擴增的預定的鹽基序列部分或者是擴增的預定鹽基序列部分的一部分。這是由于當包含擴增的預定鹽基序列部分以外的鹽基序列序列時，若擴增的核酸為不具備目標序列的非特異性擴增產物，則有可能進行雜交。
雜交可將對已知基因片斷標記的擴增核酸為探針，用公知的方法進行。作為公知的方法，例如，可列舉J.Sambrook et al.Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)所述的方法等，但并不限定于此。
另外，也可采用以在核酸擴增工序中擴增且標記的核酸為探針，利用DNA微陣列判定有無靶核酸存在的方法。這里，DNA微陣列中包含所謂低聚DNA型和cDNA型的任一種。另外，DNA微陣列可采用市售的，也可用自制的。在判定工序中使用DNA微陣列時，如上所述，可判定核酸擴增工序中利用隨機序列的引子非特異性地擴增的核酸中是否存在靶核酸。
(5)本發(fā)明的核酸檢測方法的適用范圍本檢測方法可在傳統(tǒng)的稱為基因診斷的所有領域適用。其例示如下，但并不限定于此。
a)病原微生物(細菌、真菌、病毒、寄生蟲等)的檢測，即感染癥的分子診斷b)癌癥的分子診斷c)出生前的遺傳性疾病等的分子診斷d)藥物代謝相關的基因的分子診斷e)來自法醫(yī)學樣品的分子診斷f)疾病標準基因的分子診斷g)移植時的組織分型h)適合性測試i)SNPs檢測認為本發(fā)明的核酸檢測方法最適合用于上述a)所示的感染癥的分子診斷。以下說明其理由。
病原微生物在血液中或體液中懸浮存在的可能性低，侵入宿主細胞才開始出現(xiàn)感染癥的癥狀。因而，作為檢出感染癥的病原微生物的試料，白血球等的免疫類細胞合適。還有，作為檢測被細胞貪食的細菌或侵入細胞的病毒等的方法，在從試料抽取核酸后擴增的傳統(tǒng)的PCR法或不擴增核酸而進行靶核酸的檢測的ISH法中，有時不能實現(xiàn)充分的檢測靈敏度、再現(xiàn)性、簡便性等。另一方面，本發(fā)明的核酸檢測方法中，將貪食細菌的細胞或病毒等侵入的細胞直接固定于支持體，在這種狀態(tài)下擴增細胞中的細菌或病毒等的核酸并加以檢測，因此清楚比上述傳統(tǒng)的方法顯著提高了檢測靈敏度及精度。
另外，傳統(tǒng)的檢測細胞內病原微生物等的方法有原位PCR法。該方法中，將細胞固定于承物玻璃片，在細胞內進行PCR，通過用ISH法使探針雜交來使細胞內擴增的產物視覺化，用顯微鏡檢測。因而，原位PCR法可期待與本發(fā)明的核酸檢測方法相同的檢測靈敏度，但存在條件設定難、缺乏再現(xiàn)性的問題。而且，存在非特異性反應較多，且在細胞內難以區(qū)別非特異性擴增產物與靶的特異性擴增產物的問題。
由此，本發(fā)明的核酸檢測方法作為檢測被細胞貪食的細菌或侵入細胞的病毒等的方法，可稱得上是非常優(yōu)秀的方法。
2.本發(fā)明的基因檢測試劑盒將本發(fā)明的基因檢測試劑盒(以下適當簡化為“本試劑盒”)是利用本發(fā)明的核酸檢測方法檢測試料中靶基因用的試劑盒。通過將本檢測方法中使用的試劑、器具類試劑盒化，可簡便地實施本檢測方法，可在更短時間獲得準確的檢測結果。還有，基因中包含DNA及RNA。
(1)本試劑盒的構成本試劑盒中最好至少包括在試料固定化工序中使用的試料固定化用支持體；在核酸擴增工序中使用的引子、核酸合成酶、基質(核苷三磷酸)、緩沖液等的試劑；在判定工序中使用的擴增核酸檢測用指示藥等的試劑及器具等。另外，在將所使用的試料作為特定的試劑盒而需要核酸露出工序的場合，可包含核酸露出用試劑(界面活性劑或蛋白質分解酶等)。另外，可包含適合所使用的試料的固定用試劑。例如，特定為包含白血球的生物源試料，且將被白血球貪食的細菌等微生物的基因組作為靶核酸的試劑盒的場合，最好包含固定用試劑(例如卡諾固定液等)及核酸露出用試劑(微生物的細胞壁分解酶等)。
還有，通過將核酸擴增方法及判定方法特定，可將試劑盒中包含的試劑的構成具體化。例如，將核酸擴增方法作為PCR法的場合，核酸擴增工序中使用的試劑為PCR反應用緩沖液、脫氧核苷三磷酸混合液、耐熱性DNA合成酶(Taq聚合酶)。另外，如果需要用PCR標記核酸，只要再包含標記脫氧核苷三磷酸即可。
當判定方法采用瓊脂糖凝膠電泳法時，只要試劑盒中包含瓊脂糖凝膠、電泳用緩沖液、分子量標準、核酸染色用試劑等即可。當判定方法采用斑點雜交時，只要試劑盒中包含將靶核酸定位(固定)的1-苯基-2，3-二甲基吡唑啉酮碳酸鈉、雜交用緩沖液、對應于核酸的標記的檢測用指示藥(例如，在采用地谷新配基標記時酶標記的抗地谷新配基抗體、使標記的酶發(fā)色的基質等)、雜交袋(Hybri-Bag)、其它必要的試劑、器具等即可。當核酸檢測方法采用DNA微陣列時，只要試劑盒包含對應于靶核酸的DNA微陣列及必要的試劑、器具等即可。
即，通過具體地特定本發(fā)明的核酸檢測方法中使用的試料、靶基因、核酸擴增方法、核酸檢測方法，可將所使用的試劑、器具等各式各樣組合而構成試劑盒。還有，本試劑盒的構成并不限于上述例示的試劑、器具等，可根據目的適當?shù)剡x擇合適的公知試劑、器具等。
(2)靶基因一個試劑盒中包含的靶基因無需限于1基因，通過使試劑盒包含多個引子組(primer set)，可作成可檢出多個靶基因的試劑盒。例如，以疾病關聯(lián)基因為靶的試劑盒中，可將由同一試料能夠檢測的多個疾病關聯(lián)基因作為靶。更具體地說，以感染癥的原因微生物的基因為靶的場合，只要使試劑盒包含可將金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、綠膿假單胞菌、腸球菌、大腸菌等特異性地檢測的引子組即可。作為這種感染癥的原因微生物的靶基因，最好是藥劑耐性基因或感受性基因。
另外，以癌標準基因為靶的場合，只要使試劑盒包含可將p53、MDM2、H-ras、K-ras、N-ras、APC、Myc、HER2/neu、BRCA1、BRCA2、erbB、src、fos、jun、raf、fes、erb-A、fms、sis、Rb、WT1等特異性地檢測的引子組即可。另外，以遺傳性疾病關聯(lián)基因為靶的場合，只要使試劑盒包含可將例如色素性干皮癥關聯(lián)基因(XPA、XPB、XPC、XPD、XPE、XPF/ERCC1、XPV)、家族性大腸癌關聯(lián)基因(APC)、老年癡呆病關聯(lián)基因(apoE4)、冠狀動脈性疾病關聯(lián)基因(apoE2)、Von Hippel-Lindau病關聯(lián)基因(VHL)、筋萎縮關聯(lián)基因(dystrophyin)等特異性地檢測的引子組即可。
還有，本試劑盒的適用范圍與上述“1.(5)本發(fā)明的核酸檢測方法的適用范圍”相同，可適用于傳統(tǒng)的稱為基因診斷的所有領域。因而，本試劑盒的靶基因可從所有基因診斷領域選擇，并不限于上述例示。
以下，通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于實施例。
<實施例1.使用貪食樣品的核酸的檢測>
(試料調制)預先將外來微生物(金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus、以下SA)ATCC 126000、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermdis、以下SE)ATCC14990、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa、以下PA)ATCC 10145、腸球菌(Enterococcus faecalis、以下EF)ATCC 19433、大腸菌(Escherichia coli、以下EC)ATCC 11775)植菌在腦心浸液(BHI)培養(yǎng)液(DIFCO)中，在37℃培養(yǎng)8小時以上。
將培養(yǎng)的菌液，在4℃按2,000×g離心分離10分鐘后集菌。棄上清后，將菌的顆粒用PBS 5mL懸浮，再次在4℃按2,000×g離心分離10分鐘后集菌。將集菌的菌用PBS 5mL懸浮后，用PBS稀釋而制作15mL的由吸光度計將菌液的濁度(OD＝600nm)調整為0.01～0.03的菌液。將制作的菌液移到各175cm2的培養(yǎng)用燒瓶中，約30分鐘在室溫中靜放。
采集肝素加健常人體血液50mL，將血液分離試劑(氯化鈉225mg及葡聚糖(MW200,000～300,000)1.5g用消毒純凈水溶解，并攪拌成25mL的)約按4∶1的比例加入，在37℃(20～40℃)靜放30分鐘，分取白血球片斷。將分取的白血球片斷用PBS作成50mL。
將裝入上述菌液并靜放的培養(yǎng)用燒瓶的上清悄悄除去，將用上述PBS稀釋的白血球片斷在每個燒瓶加入10mL，并在室溫靜放約10分鐘。除去燒瓶內上清，將附著在燒瓶底部的白血球用0.02％EDTA含有PBS10mL回收到15mL的遠沉管，并在4℃按140×g～180×g離心分離10分鐘，并收集白血球。當確認收集的白血球中混入了紅血球時，通過消毒純凈水1mL將白血球的沉渣平穩(wěn)地懸浮并溶血后，加入PBS14mL，在等滲化后，再次在4℃按140×g～180×g離心分離10分鐘，并收集白血球。
將收集的白血球用PBS懸浮，并由血球計測量細胞數(shù)，調整到1×104個/μL～5×104個/μL。將該樣品稱為貪食樣品，并作為本實施例的試料。
(試料固定化工序)對以上述各貪食樣品為支持體加以使用的TopYield strips(NUNC248909)的各槽分別涂上5μL，并風干。各槽中注入100μL的75％乙醇并5分鐘固定及脫鹽。然后，棄75％乙醇，用熱循環(huán)控制器風干。
(核酸擴增工序)用Nested-PCR法進行了靶核酸的擴增。首先，在固定了各貪食樣品的槽中加入PCR關聯(lián)試劑(每個槽，TaKaRa Ex Taq(5單位/μL)0.5μL(final 2.5U)；10×Ex Taq Buffer5μL；dNTP mixture(各2.5mM)4μL；各細菌識別引子2種0.4μM；消毒純凈水up to 50μL)。第1次的PCR用引子中，作為SA識別引子使用以下所示SA1T(序列號1)及SA1B(序列號2)。
SA1T5’-GAGGATGCAGCGAATTAAACAACGTACTGCTGTTCAACGC-3’SA1B5’-AATGAAACTTTACCAACAATTTGGTCTTCATCAATGAGGC-3’作為SE識別引子，使用以下所示SE1T(序列號5)及SE1B(序列號6)。
SE1T5’-ACTGGAATAATCATTGGTATTATTGCTTTAATTCTAGTAA-3’SE1B5’-CTAACAAAATCTAAGTAGAGTTTCAGGAATTTTTCTGGTT-3’作為PA識別引子使用以下所示PA1T(序列號9)及PA1B(序列號10)。
PA1T5’-ACCTTGCCGATGATCAGGTCGAGCAGCAGCAGTTCCGCCG-3’PA1B5’-GTGTTCACCGGCTCCACCGAGGTCGGCAAGTACTTCATGC-3’作為EF識別引子使用以下所示EF1T(序列號13)及EF1B(序列號14)。
EF1T5’-CTTTTGCTAGTTCATGTTTATTGATTTTTCGTTCGATTAT-3’EF1B5’-TACCATTTCTTGCATGCTCATTTCTCCTTACTACTGAAAC-3’作為EC識別引子使用以下所示EC1T(序列號17)及EC1B(序列號18)。
EC1T5’-CATTTGTGAATGAGATGCACTGACTAAATCAATTGGCCCC-3’EC1B5’-CCGAGATGGGCTTCACCTGTCTGCGTATTTCCATTGCCTG-3’熱循環(huán)控制器使用GeneAmp PCR System9700(PE Applied Biosystems)，在94℃保持1分鐘后，在94℃中1分鐘、68℃中3分鐘的反應反復50周期，并在72℃保持1分鐘而結束第1次的PCR。
第2次的PCR(Nested-PCR)在上述組分的PCR關聯(lián)試劑進入的PCR管中加入第1次的PCR反應液5μL后進行。第2次的PCR用引子中，作為SA識別引子使用以下所示SA2T(序列號3)及SA2B(序列號4)。
SA2T5’-TGTTCAACGCTTGATTAGTTTTATT-3’SA2B5’-TCAATGAGGCCAAACGCACGGCTAT-3’作為SE識別引子使用以下所示SE2T(序列號7)及SE2B(序列號8)。
SE2T5’-ATTCTAGTAATTATGCAAGGGTTTC-3’
SE2B5’-TTTTCTGGTTCCTCGATATGTGGTG-3’作為PA識別引子使用以下所示PA2T(序列號11)及PA2B(序列號12)。
PA2T5’-AGTTCCGCCGAGAGGGCGAACATCG-3’PA2B5’-TACTTCATGCAGTATTCCGCGCAAT-3’作為EF識別引子使用以下所示EF2T(序列號15)及EF2B(序列號16)。
EF2T5’-GTTCGATTATCCCACAAGATTATAT-3’EF2B5’-CTACTGAAACATCGTCTTAAAAAAA-3’作為EC識別引子使用以下所示EC2T(序列號19)及EC2B(序列號20)。
EC2T5’-AATTGGCCCCCAACTGGTGTACCCC-3’EC2B5’-CCATTGCCTGGGCGCGAATTTTCCC-3’熱循環(huán)控制器與第1次同樣使用GeneAmp PCR System9700(PE AppliedBiosystems)，在94℃保持1分鐘后，在94℃中1分鐘、68℃中1分鐘的反應反復30周期，并在72℃保持1分鐘而結束第2次的PCR。
(判定工序)通過1％瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖Agarose-RE for≥1Kbp fragment，forRestriction and Ligation(nacalai tesque))，將擴增的PCR產物分離，并用溴化乙錠染色。通過與以使用的各細菌為鑄模使用同一引子進行的PCR的結果相比，確認靶核酸是否擴增。
(結果)在圖2示出結果。左側表示以各細菌為鑄模進行PCR的結果，右側表示以各貪食樣品為試料用本發(fā)明的核酸檢測方法將各細菌的靶核酸擴增的結果。圖中M表示分子量標準，左端的數(shù)值表示分子量(bp)。由圖1可知貪食樣品的第2次的PCR(2ND-PCR(nested))的線條(band)的位置與以各細菌為鑄模進行PCR時的第2次的PCR(2ND-PCR(nested))的線條位置相同，表示檢出了靶核酸。
<實施例2.從敗血癥患者判定原因菌>
(試料調制)從疑為敗血癥的患者采集血液5mL，并加入肝素(肝素加血液)。在肝素加血液中按約4∶1的比例加入血液分離試劑(將氯化鈉225mg、葡聚糖(MW200,000～300,000)1.5g用消毒純凈水溶解，攪拌成25mL)，在37℃(20～40℃)靜放30分鐘，分取白血球片斷。在4℃按140～180×g離心分離10分鐘，并收集了白血球。當確認收集的白血球中混入了紅血球時，用消毒純凈水1mL使白血球的沉渣平衡地懸浮而溶血后，加入PBS 14mL進行等滲化，然后再次在4℃按140～180×g離心分離10分鐘，并收集了白血球。使收集的白血球在PBS150μL懸浮。將它稱為臨床檢體，并作為試料。
(試料的固定)對以上述試料為支持體加以使用的TopYield strips(NUNC248909)各槽上分別涂上5μL，并利用熱循環(huán)控制器(GeneAmp PCR System9700(PE AppleidBiosystems))在42℃風干。向各槽注入100μL的75％乙醇進行5分鐘的固定及脫鹽。然后，棄75％乙醇，利用熱循環(huán)控制器在42℃風干。
(試料的前處理(核酸露出工序))向各槽加入酶試劑(在消毒純凈水1mL中溶解皂草苷125μg；t-辛基苯氧聚乙氧基乙醇(比重1.068～1.075(20/4℃)、pH(5w/v％)5.5～7.5)125nL；N-乙酰胞壁質酶(生化學工業(yè)社制)50單位；溶菌酶(生化學工業(yè)社制)5000單位；溶葡球菌酶(SIGMA社制)5單位而調制的試劑)10μL，利用熱循環(huán)控制器，在37℃處理10分鐘后，在95℃處理10分鐘并使酶失活及槽風干。
但是，N-乙酰胞壁質酶將S.salivarius IF03350的熱處理細胞在37℃、pH7.0的情況下1分鐘溶菌1μg的酶活性為1單位。溶菌酶將M.luteus在35℃、pH6.2的情況下1分鐘540nm的吸收降低0.001時的酶活性為1單位。溶葡球菌酶將S.aureus在37℃、pH7.5的情況下10分鐘620nm的吸收從0.240降低到0.125時的酶活性為1單位。
(核酸擴增工序)利用Nested-PCR法進行了靶核酸的擴增。首先，向試料固定的槽加入PCR關聯(lián)試劑(每個槽，用消毒純凈水將TaKaRa LA Taq0.2μL；10×LA Taq Buffer2μL；25mM MgCl22μL；dNTP mixture(各2.5mM)3.2μL；各細菌識別引子2種各0.16μM調整為20μL)。
第1次的PCR用引子使用上述實施例1中使用的引子相同的引子。即，作為SA識別引子使用了SA1T(序列號1)及SA1B(序列號2)。作為SE識別引子使用了SE1T(序列號5)及SE1B(序列號6)。作為PA識別引子使用了PA1T(序列號9)及PA1B(序列號10)。作為EF識別引子使用了EF1T(序列號13)及EF1B(序列號14)。作為EC識別引子使用了EC1T(序列號17)及EC1B(序列號18)。
熱循環(huán)控制器使用GeneAmp PCR System9700(PE Appleid Biosystems)，在94℃保持1分鐘后，98℃中20秒、68℃中3分鐘的反應循環(huán)反復30周期，在72℃保持5分鐘而結束了第1次的PCR反應。
第2次的PCR(Nested-PCR)是在裝入上述組分的PCR關聯(lián)試劑的PCR管加入第1次的PCR反應液1μL后進行。在第2次的PCR反應中使用以下的引子。
SA識別引子SA3T5’-ACTGTTCGTACAAACTTTTGTAATAGTTGGTCATG-3’(序列號21)SA3B5’-CTCGCCATCTTTCAAAGTTGGATCCATTGATTCAC-3’(序列號22)SE識別引子SE3T5’-GGTATATAAATGACTAAAGGGAGGTGCCAAGATGA-3’(序列號23)SE3B5’-GCAATGCACGTACTGCAATTGCACTTTCTTCCGGAG-3’(序列號24)PA識別引子PA3T5’-ATTCGATCGTCCTCTTGTTGTCGTTATCGGCATCG-3’(序列號25)PA3B5’-TGGTGGAGCGTTCGATCCACGACGAGTTCGTCGAG-3’(序列號26)EF識別引子EF3T5’-ATCAGGCGTATCCATTATTGGATTAACCACGATTG-3’(序列號27)EF3B5’-TTGCTCCTGACGATATTCACGATTCCCTAAAATCC-3’(序列號28)EC識別引子EC3T5’-AGATGCGGATTGGGGATCATATTCAGTATGTTGCC-3’(序列號29)EC3B5’-GATCACTTCGAACATTACGCCCGCACGGTCTTTAC-3’(序列號30)熱循環(huán)控制器與第1次同樣使用GeneAmp PCR System9700(PE AppleidBiosystems)，在94℃保持1分鐘后，98℃中20秒、68℃中1分鐘的反應循環(huán)反復30周期，在72℃保持5分鐘而結束了第2次的PCR反應。
(判定工序)通過1％瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖Agarose-RE for≥1Kbp fragment，forRestriction and Ligation(nacalai tesque))，將擴增的PCR產物分離，并用溴化乙錠染色。以與使用的引子對應的各細菌為鑄模進行PCR反應，確認了靶核酸擴增(正調節(jié))。另外，在不將試料涂上的狀態(tài)下進行PCR反應，確認了靶核酸非特異性地擴增(負調節(jié))。
(結果)在圖3示出電泳的結果。圖中左端的數(shù)值表示分子量(bp)。
由圖3可知由于可確認Lane13及Lane15上特異性的核酸的擴增，判定該臨床檢體被SA(金黃色葡萄球菌)及PA(綠膿假單胞菌)感染(陽性)。
還有，在表1示出對于包括該臨床檢體(臨床檢體1)在內的4個例的臨床檢體，用與上述相同的方法判定原因菌的結果。


由表1可知本發(fā)明的核酸檢測方法表示對判定敗血癥患者的原因菌有效。
<實施例3.從敗血癥血液模型檢測生物因子(RNA)>
(敗血癥血液模型的調制)預先將外來微生物(大腸菌(Escherichia coli、以下EC)ATCC11775)植菌到腦心浸液(BHI)培養(yǎng)液(DIFCO)，在37℃培養(yǎng)了8小時以上。將培養(yǎng)的菌液在4℃按2000×g離心分離10分鐘后集菌。在棄上清后，將菌的顆粒用PBS 5mL懸浮，再次在4℃按2000×g離心分離10分鐘后集菌。將集菌的菌用PBS 5mL懸浮后，用PBS稀釋并用吸光度計將菌液的濁度(OD＝600nm)調整為0.1～0.15而制作5mL。采集肝素加健常人體血液8mL，在兩個15mL的遠沉管分別注入4mL。在肝素加血液4mL加入制作的菌液及PBS 400μL，在37℃靜放3小時，誘導發(fā)現(xiàn)炎癥性細胞素。
向上述肝素加血液按約4∶1的比例加入血液分離試劑(用消毒純凈水溶解氯化鈉225mg、葡聚糖(MW200,000～300,000)1.5g，攪拌成25mL)，在37℃(20～40℃)靜放30分鐘，分取白血球片斷。在4℃按140～180×g離心分離10分鐘，并收集了白血球。當確認收集的白血球中混入了紅血球時，用消毒純凈水1mL使白血球的沉渣平衡地懸浮而溶血后，加入PBS 14mL進行等滲化，然后再次在4℃按140～180×g離心分離10分鐘，并收集了白血球。使收集的白血球在PBS 150μL懸浮。將它作為敗血癥血液模型，并作為試料。
(試料的固定)對以上述試料為支持體加以使用的TopYield strips(NUNC248909)各槽上分別涂上5μL，并利用熱循環(huán)控制器(GeneAmp PCR System9700(PE AppleidBiosystems))在70℃風干。向各槽注入100μL的75％乙醇進行5分鐘的固定及脫鹽。然后，棄75％乙醇，利用熱循環(huán)控制器在42℃風干。
(試料的前處理)向各槽加入DNA分解酶(DNasel，RNase-free(Roche Diagnostics GmbH社制)0.1單位/μL、Tris-HCl 10mM、MgCl2 10mM、DTT 1mM、消毒蒸留水)10μL，利用熱循環(huán)控制器，在37℃處理10分鐘并分解白血球基因組DNA后，在70℃處理10分鐘并使酶失活及槽風干。
但是，以小牛胸腺DNA為基質在25℃、pH5.0的情況下1分鐘將反應液260nm的吸光度增加0.001增加的酶活性為1單位。
(核酸擴增工序)利用RT-PCR法進行了靶核酸的擴增。首先，進行了逆轉錄反應(reversetranscriptionRT)。逆轉錄反應中使用上標第一鏈系統(tǒng)(RT-PCR用)(Invitrogen)。在試料固定的槽中加入Oligo(dT)12-18(0.5μg/μL)1μL和消毒蒸留水9μL，在70℃處理10分鐘后，在4℃靜放1分鐘。接著加入10×PCR buffer[200mMTTris-HCl(pH8.4)，500mM KCl]2μL；25mM MgCl22μL；10mM dNTP mix1μL；0.1M DTT2μL，在25℃靜放5分鐘。然后，加入SuperScript II RT1μL(50單位)，在25℃處理10分鐘、42℃處理50分鐘、70℃處理15分鐘后，在4℃靜放5分鐘。在逆轉錄反應結束后，加入E.coli RNaseH(2單位/μL)1μL，在37℃處理20分鐘，將RNA完全分解。
PCR反應中，對裝入PCR關聯(lián)試劑(每個槽，用消毒純凈水將TaKaRa LATaq0.2μL；10×LA Taq Buffer2μL；25mM MgCl22μL；dNTP mixture(各2.5mM)3.2μL；IL6識別引子各0.16μM調整為18μL)的PCR管，加入逆轉錄反應液2μL而加以進行。
還有，在PCR反應中使用以下的白細胞介素6(IL6)用引子。
IL6識別引子IL6-T5’-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGG-3’(序列號31)IL6-B5’-ATTCTTTGCCTTTTTCTGCAGGAACTGGAT-3’(序列號32)熱循環(huán)控制器使用GeneAmp PCR System9700(PE Appleid Biosystems)，在94℃保持1分鐘后，將94℃中30秒、55℃中30秒、72℃中30秒鐘的反應循環(huán)反復50周期，并在72℃保持5分鐘而結束了PCR反應。
(判定工序)通過2％瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖Agarose-RE for≥1Kbp fragment，forRestriction and Ligation(nacalai tesque))，將擴增的PCR產物分離，并用溴化乙錠染色。通過在電泳中獲得特異性線條，確認靶核酸擴增。
(結果)在圖4示出電泳的結果。圖中左端的數(shù)值表示分子量(bp)。
由圖4可知由于在Lane3可觀察到來自IL6的特異性的核酸的擴增，大腸菌感染的血液中的IL6的發(fā)現(xiàn)上升，但證明了根據本發(fā)明的核酸檢測方法能夠檢測。
還有，用以實施發(fā)明的最佳方式中呈現(xiàn)的具體實施方式
或實施例只為使本發(fā)明的技術內容清楚，并不僅限定于這些具體例，不必作狹義的解釋，可在本發(fā)明的精神與接著描述的權利要求的范圍內，作各種變更而加以實施。
工業(yè)上的利用可能性本發(fā)明的核酸檢測方法，包括將包含細胞的試料固定于支持體的試料固定化工序；將試料中的核酸在支持體上擴增的核酸擴增工序；以及檢測擴增的核酸的核酸檢測工序，不需要從試料抽取核酸的工序。因而，幾乎不會發(fā)生因抽取核酸而導致的核酸的損耗，即便試料中包含的靶核酸非常微量，只要包含用以擴增的作為鑄模所需要的量的靶核酸，就可檢測出，伴隨這樣的效果，起到提高再現(xiàn)性及檢測精度的效果。另外，由于不需要從試料抽取核酸的工序，具有操作簡便，且可縮短到獲得結果為止所需要的時間的效果。
本發(fā)明的核酸檢測方法中，將試料固定地支持體上，因此在試料溶液中含有擴增阻礙物質的場合，也能容易除去細胞外存在的擴增阻礙物質。因而，具有不會隨著擴增效率下降而導致檢測靈敏度下降的效果。
本發(fā)明的核酸檢測方法中，將試料固定于支持體上，并在該支持體上擴增核酸，因此無需將試料轉移到PCR管等其它容器等。因而，不會出現(xiàn)試料移動而產生的核酸的損耗，因此具有不會導致檢測靈敏度下降的效果。另外，具有操作變得簡便，且能夠縮短所需時間的效果。
本發(fā)明的核酸檢測方法中，在擴增核酸后進行檢測，因此不會發(fā)生因檢測對象的靶核酸微量而難以檢測的問題。因而，具有提高再現(xiàn)性及檢測精度的效果。另外，由于檢測方法不需要特別的工夫，具有可適當選擇公知的檢測方法加以使用的效果。另外，具有結果的判定不需要熟練度的效果。
本發(fā)明的基因檢測試劑盒是利用本發(fā)明的核酸檢測方法檢測試料中的靶基因的試劑盒。因而，通過使用該試劑盒，具有可以非常簡便且迅速實施本發(fā)明的核酸檢測方法的效果。
如上所述，本發(fā)明可在傳統(tǒng)的稱為基因診斷的所有領域適用。因而，本發(fā)明可在以醫(yī)療、制藥、試劑領域為首的廣泛的生物關聯(lián)產業(yè)利用。尤其，通過在醫(yī)療領域的臨床檢查中利用本發(fā)明，可對確切的治療方針的選擇作貢獻。另外，也可在生物關聯(lián)領域的基礎研究中利用，可期待對生物學發(fā)展作大貢獻。
序列表<110>扶桑藥品工業(yè)株式會社<120>核酸檢測方法及其應用<130>FP0505<150>JP 2004-32617<151>2004-02-09<160>32<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述；人工合成引子序列<400>1gaggatgcag cgaattaaac aacgtactgc tgttcaacgc40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述；人工合成引子序列<400>2aatgaaactt taccaacaat ttggtcttca tcaatgaggc40<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述；人工合成引子序列
<400>28ttgctcctga cgatattcac gattccctaa aatcc35<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述；人工合成引子序列<400>29agatgcggat tggggatcat attcagtatg ttgcc35<210>30<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述；人工合成引子序列<400>32attctttgcc tttttctgca ggaactggat 30
權利要求
1.一種核酸檢測方法，其特征在于包括將包含細胞的試料固定于支持體的試料固定化工序；將試料中的核酸在支持體上擴增的核酸擴增工序；以及判定擴增的核酸是否為靶核酸的判定工序。
2.如權利要求1所述的核酸檢測方法，其特征在于在上述核酸擴增工序的前段，包括使試料中包含的核酸露出的核酸露出工序。
3.如權利要求2所述的核酸檢測方法，其特征在于作為上述核酸露出工序中的核酸露出方法，采用界面活性劑處理法、加酶處理法或加熱處理法中任一種方法，或者組合兩種以上方法加以使用。
4.如權利要求1至3中任一項所述的核酸檢測方法，其特征在于作為上述核酸擴增工序中的核酸擴增方法，采用PCR(聚合酶連鎖反應)法。
5.如權利要求1至4中任一項所述的核酸檢測方法，其特征在于上述核酸擴增工序中標記擴增的核酸。
6.如權利要求5所述的核酸檢測方法，其特征在于作為上述判定工序中的判定方法，將核酸擴增工序中擴增且標記的核酸作探針，以該探針與已知基因片斷的互補的雜交為指標判定是否為靶核酸。
7.如權利要求6所述的核酸檢測方法，其特征在于上述已知基因片斷預先固定于支持體。
8.如權利要求5所述的核酸檢測方法，其特征在于作為上述判定工序中的判定方法，將核酸擴增工序中擴增且標記的核酸作探針，利用DNA微陣列判定是否為靶核酸。
9.如權利要求1至8中任一項所述的核酸檢測方法，其特征在于上述試料為生物源試料。
10.如權利要求9所述的核酸檢測方法，其特征在于上述生物源試料源自人體。
11.一種基因檢測試劑盒，用以實施權利要求1至10中任一項所述的核酸檢測方法，該試劑盒用于檢測試料中的靶基因。
12.一種基因檢測試劑盒，用以實施權利要求10所述的核酸檢測方法，該試劑盒用于檢測人體的疾病關聯(lián)基因。
13.如權利要求12所述的基因檢測試劑盒，其中，上述人體的疾病關聯(lián)基因為人體感染的感染癥原因微生物的基因。
14.如權利要求13所述的基因檢測試劑盒，其中，上述人體感染的感染癥原因微生物的基因為藥劑耐性基因。
15.如權利要求13所述的基因檢測試劑盒，其中，上述人體感染的感染癥原因微生物的基因為藥劑感受性基因。
16.如權利要求12所述的基因檢測試劑盒，其中，上述人體的疾病關聯(lián)基因為癌標準基因。
17.如權利要求12所述的基因檢測試劑盒，其中，上述人體的疾病關聯(lián)基因為遺傳性疾病關聯(lián)基因。
18.如權利要求11至17中任一項所述的基因檢測試劑盒，其特征在于至少包括靶基因擴增引子、PCR反應用緩沖液、脫氧核苷三磷酸混合液、標記脫氧核苷三磷酸、耐熱性DNA合成酶、試料固定化用支持體、擴增核酸檢測用指示藥。
全文摘要
本發(fā)明提供檢測靈敏度比傳統(tǒng)方法高，同時可準確且迅速地檢測出靶核酸的核酸檢測方法及使用該方法的基因檢測試劑盒。將包含細胞的試料固定于支持體，以這樣的狀態(tài)在支持體上擴增核酸，并檢測擴增的核酸。由于不從試料抽取核酸，可防止伴隨核酸抽取過程的核酸損耗的檢測靈敏度的下降。另外，由于檢測擴增后的核酸，即便試料中包含的靶核酸微量，也可檢測出。
文檔編號G01N33/50GK1918305SQ20058000433
公開日2007年2月21日 申請日期2005年2月8日 優(yōu)先權日2004年2月9日
發(fā)明者松久明生, 山本誠司, 江田宗司, 山崎伸二 申請人:扶桑藥品工業(yè)株式會社