專利名稱：熒光顯微鏡裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種顯微鏡裝置，其具有用于成像樣品中熒光標(biāo)記物分布的熒光顯微鏡。本發(fā)明還涉及用于確定樣品中熒光標(biāo)記物的空間分布的方法。
背景技術(shù)：
在熒光顯微術(shù)中，用專門設(shè)計(jì)的顯微鏡觀察樣品中熒光標(biāo)記物的分布。熒光標(biāo)記物是化學(xué)物質(zhì)，其在受到適當(dāng)?shù)某跫?jí)輻射刺激之后發(fā)出特征光譜范圍的熒光，這就是常常用術(shù)語(yǔ)“熒光染料”來稱呼它的原因。通過將熒光標(biāo)記物結(jié)合到其它分子，例如藥劑或蛋白，可以獲得關(guān)于生物系統(tǒng)的代謝過程的信息。但是用目前的熒光顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)的分辨率被限制在大約100nm至30nm的范圍，因此對(duì)分子水平的較小結(jié)構(gòu)或過程的研究是不可能的。

發(fā)明內(nèi)容
基于該背景，本發(fā)明的目標(biāo)是提供在透明和混濁介質(zhì)中提高熒光顯微鏡的分辨率的手段。
具有權(quán)利要求1的特征的顯微鏡裝置和具有權(quán)利要求5的特征的方法實(shí)現(xiàn)了所述目標(biāo)。在從屬權(quán)利要求中包含了有利的實(shí)施方式。
根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡裝置用于成像包含熒光標(biāo)記物的樣品(例如生物樣品)。在這里，熒光標(biāo)記物將是磁和/或電敏感的，也就是說，所述標(biāo)記物的熒光性能(熒光強(qiáng)度，熒光的光譜移動(dòng)，極化，強(qiáng)度的時(shí)間變化，等等)受到外部磁場(chǎng)或電場(chǎng)影響。
所述顯微鏡裝置包括以下部件-熒光顯微鏡，用于激發(fā)和成像來自樣品的熒光輻射。用于該目的的合適顯微鏡可從熒光顯微術(shù)領(lǐng)域獲知。
-場(chǎng)發(fā)生器，用于在樣品中產(chǎn)生空間非均勻磁場(chǎng)和/或空間非均勻電場(chǎng)，其中所述場(chǎng)的非均勻性必須至少存在于局部區(qū)域中。
使用所述顯微鏡裝置，有可能比用傳統(tǒng)的熒光顯微術(shù)從樣品的研究中提取更多的信息。這歸結(jié)于這樣的事實(shí)，即有可能在樣品中產(chǎn)生空間非均勻場(chǎng)，所述空間非均勻場(chǎng)根據(jù)要求影響待觀察的熒光標(biāo)記物的發(fā)射性能。所以所述場(chǎng)給用戶機(jī)會(huì)來特定地和因而地改變樣品內(nèi)的局部條件以影響熒光。特別地，以這種方式可以在熒光輻射方面提高熒光顯微鏡的分辨率，該裝置的特定應(yīng)用在下面更具體地被描述。此外，使用所述顯微鏡裝置也有可能用提高的分辨率在混濁介質(zhì)中進(jìn)行分析。
根據(jù)第一、優(yōu)選實(shí)施方式，所述顯微鏡裝置被設(shè)計(jì)成以限定的方式改變樣品中的非均勻磁場(chǎng)和/或電場(chǎng)，例如從而移動(dòng)其位置和/或改變其分布。通過觀察給定樣品體積如何響應(yīng)所述場(chǎng)的變化，可以獲得關(guān)于包含在其中的熒光標(biāo)記物的重要信息。如果例如所述場(chǎng)具有帶特殊條件(例如場(chǎng)強(qiáng)的最小值)的小焦點(diǎn)區(qū)，那么這樣的話，可以選擇性地在樣品內(nèi)的不同點(diǎn)處分析熒光標(biāo)記物的存在。
構(gòu)造具有理想性質(zhì)的場(chǎng)發(fā)生器存在各種可能性。關(guān)于這一點(diǎn)在某種程度上可以求助于因其它應(yīng)用而眾所周知的方案，例如磁性粒子的成像(參照DE 10151778 A1，其全部?jī)?nèi)容被結(jié)合到本申請(qǐng)中以作參考)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，所述場(chǎng)發(fā)生器包括第一極性(在磁場(chǎng)的情況下，例如“北極”，在電場(chǎng)的情況下，例如“負(fù)極”)的第一極體，在至少兩個(gè)相對(duì)側(cè)上所述第一極體鄰近另一極性(分別為“南極”，“正極”)的第二極體。所述第一極體優(yōu)選地具有尖端。如將要在附圖的描述范圍內(nèi)具體說明的，在這樣一種配置的情況下，在所述場(chǎng)發(fā)生器附近通常存在點(diǎn)形區(qū)，在該區(qū)域場(chǎng)強(qiáng)呈現(xiàn)最小值。當(dāng)觀察樣品時(shí)于是這適合作為焦點(diǎn)區(qū)。
在最簡(jiǎn)單的情況下由磁場(chǎng)或電場(chǎng)導(dǎo)致的樣品中熒光性能的變化可以由顯微鏡裝置的用戶單純用眼睛觀察。然而，優(yōu)選地，借助于數(shù)據(jù)處理設(shè)備對(duì)顯微鏡裝置記錄的圖像進(jìn)行高級(jí)圖像處理。關(guān)于這一點(diǎn)，所述數(shù)據(jù)處理設(shè)備被設(shè)計(jì)成由在一個(gè)或多個(gè)記錄期間的(空間和任選地時(shí)間)非均勻場(chǎng)的已知強(qiáng)度分布和由測(cè)量的熒光輻射來重建樣品中熒光標(biāo)記物的分布。如果例如所述場(chǎng)具有最小場(chǎng)強(qiáng)的焦點(diǎn)區(qū)，則所述數(shù)據(jù)處理設(shè)備能夠考慮這樣的事實(shí)，即在該區(qū)域中的熒光相應(yīng)地變化(增加或減小)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于確定樣品中磁和/或電敏感熒光標(biāo)記物的空間分布的方法，所述方法包括以下步驟-在樣品中產(chǎn)生不時(shí)變的或時(shí)變的非均勻磁場(chǎng)和/或非均勻電場(chǎng)，從而熒光標(biāo)記物局部遇到不同條件。
-例如通過適當(dāng)量子能的初級(jí)輻射激發(fā)樣品中的熒光輻射。
-產(chǎn)生來自樣品的熒光輻射的至少一個(gè)光學(xué)圖像。
-借助于至少一個(gè)上述圖像和借助于所述非均勻場(chǎng)的已知相關(guān)強(qiáng)度分布，來計(jì)算熒光標(biāo)記物的空間分布。優(yōu)選地，在空間不同場(chǎng)強(qiáng)分布的情況下所述計(jì)算基于至少兩個(gè)圖像。如果場(chǎng)強(qiáng)分布使得它們均允許分析點(diǎn)形區(qū)或像素/體元，通常需要N個(gè)不同場(chǎng)強(qiáng)分布來代表N個(gè)像素/體元。
所述方法通常涉及可以用上述類型的顯微鏡裝置執(zhí)行的步驟。關(guān)于所述方法的細(xì)節(jié)、優(yōu)點(diǎn)和更多方面，特別參考以上描述。通過借助于空間非均勻場(chǎng)和使用對(duì)其敏感的熒光標(biāo)記物局部改變樣品內(nèi)熒光的條件，所述方法允許用高局部分辨率從樣品提取信息。
如果在所述方法中使用非均勻磁場(chǎng)，它優(yōu)選地具有(至少在一個(gè)點(diǎn))至少102T/m的梯度，特別優(yōu)選至少103T/m，尤其優(yōu)選至少106T/m。在這樣的梯度值下，每納米的磁場(chǎng)強(qiáng)度變化大約0.1-1mT，其中已知的磁敏感熒光標(biāo)記物已響應(yīng)這樣的變化。在所述梯度，可以在1nm的區(qū)域中實(shí)現(xiàn)空間分辨率。
如果在所述方法中使用非均勻電場(chǎng)，這優(yōu)選地具有(至少在一個(gè)點(diǎn))至少1011V/m2的梯度，特別優(yōu)選至少1015V/m2。在這些值下和使用普通電敏感熒光標(biāo)記物，類似地獲得在納米范圍中的分辨率。
根據(jù)所述方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述非均勻場(chǎng)被配置成使得它可以具有場(chǎng)強(qiáng)的局部最小值。特別地，該最小值可以具有零值，也就是可以對(duì)應(yīng)于無場(chǎng)區(qū)。優(yōu)選地，所述局部最小值的寬度小于所述熒光顯微鏡的光學(xué)分辨率。在這里，依賴所述場(chǎng)對(duì)所考慮的熒光標(biāo)記物的影響而方便地限定所述最小值的“寬度”。如果是后者，例如在消失場(chǎng)具有最小熒光產(chǎn)額的情況下，其中當(dāng)所述場(chǎng)增加時(shí)熒光產(chǎn)額增加到最大值，所述“寬度”可以被限定成熒光產(chǎn)額低于所述最大值的特定百分比(例如50％)的區(qū)域。在所述局部最小值的空間限制區(qū)域中，因此產(chǎn)生用于熒光的特殊條件，這導(dǎo)致從樣品發(fā)出的熒光輻射中的可觀察效果。所述最小值因此可以用作焦點(diǎn)區(qū)以用于目標(biāo)分析樣品內(nèi)的小體積。
根據(jù)所述方法的另一方面，樣品在其分析期間位于包含熒光標(biāo)記物的溶液中。以這種方式，從所述溶液不斷地替換例如通過漂白而損失和/或降解的熒光標(biāo)記物，從而樣品中的熒光可以保持較長(zhǎng)的時(shí)期。
本發(fā)明的這些和其它方面從其后描述的實(shí)施方式顯而易見并且將參考其后描述的實(shí)施方式進(jìn)行闡述。


在圖中，單一的附圖示意性地顯示了根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡裝置的原理及其使用。
具體實(shí)施例方式
在熒光顯微術(shù)領(lǐng)域中，關(guān)鍵是確定樣品20內(nèi)熒光標(biāo)記物21的分布；例如在生物樣品的情況下，該分布可以提供關(guān)于解剖和/或代謝狀況的信息。例如可以在位于Oberkochen的Carl Zeiss公司的LSM510系列中找到合適的熒光顯微鏡。為了激發(fā)熒光，樣品20被輻射以(原始的)光子vE，所述光子由熒光標(biāo)記物21的原子和分子吸收并且因此將它們送入受激能態(tài)。該能態(tài)然后通過熒光光子vF的發(fā)射再次退化，其具有標(biāo)記物的波長(zhǎng)特征。
從進(jìn)入相關(guān)顯微鏡10的熒光光子vF中，由顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生熒光輻射的強(qiáng)度分布的圖像。在該圖像上，觀察者可以通過眼睛檢查例如熒光標(biāo)記物的濃度增加的區(qū)域。而且，在通常的高級(jí)評(píng)估方法的情況下，熒光輻射的強(qiáng)度分布被定量地測(cè)量。迄今為止根據(jù)所述原理工作的所有已知熒光顯微鏡的共同點(diǎn)在于這樣的事實(shí)，即光學(xué)分辨率被限制在大約100-30nm的值。
為了克服該限制，使用在圖中示出的裝置，提出了使用磁敏感熒光標(biāo)記物21以及樣品20內(nèi)的空間非均勻磁場(chǎng)33。磁敏感熒光標(biāo)記物依賴它們所處的外部磁場(chǎng)的強(qiáng)度改變它們的熒光性能。這樣的熒光標(biāo)記物的典型例子是所謂的“激態(tài)復(fù)合物”，其由受激復(fù)合物形成。也就是說，分子穿越原始光子進(jìn)入受激狀態(tài)并且與另一分子組合形成二聚物。在該二聚物中，單態(tài)和三重態(tài)的能級(jí)實(shí)際上隨著時(shí)間退化并慢慢移動(dòng)。如果使用外部磁場(chǎng)，三重態(tài)分成三個(gè)不同狀態(tài)，由此單態(tài)和三重態(tài)的混合速度改變。激態(tài)復(fù)合物可以越過進(jìn)入基態(tài)同時(shí)發(fā)出熒光光子，將發(fā)射該光子的概率取決于是否存在單態(tài)或三重態(tài)。以這種方式，熒光產(chǎn)額也取決于外部磁場(chǎng)。這里磁場(chǎng)引起的熒光變化總計(jì)可以超過30％，并且已經(jīng)可以用小于2mT的場(chǎng)實(shí)現(xiàn)效果。理想地，激態(tài)復(fù)合物的兩個(gè)反應(yīng)方彼此化學(xué)結(jié)合以形成所謂的分子內(nèi)激態(tài)復(fù)合物。磁敏感熒光標(biāo)記物的例子可以從涉及MARY(磁場(chǎng)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率的影響)光譜學(xué)的研究獲知，參照Günter Grampp等人RIEKEN ReviewNo.44(2002年2月)。此外，在這方面可以參考N.Kh.Petrov的出版物(例如N.Kh.Petrov，V.N.Borisenko，A.V.Starostin，M.V.Alfimov，Amplification of the cage effect in binarysolvents detected by technique of magnetic modulation ofexciplex fluorescence，Izv.AN SSSR，ser.chim.，1991，no.11，p.2456；N.Kh.Petrov，V.N.Borisenko，A.V.Starostin，M.V.Alfimov，Polar molecular clusters produced upon photoinduced electrontransfer in an intermolecular exciplex in binary solvents，J.Phys.Chem.，1992，vol.96，no.7，p.2901；N.Kh.Petrov，V.N.Borisenko，M.V.Alfimov，Study ofpreferential solvation in binary solvent mixtures by thefluorescence-detected magnetic field effect，J.Chem.Soc.，F(xiàn)araday Trans.，1994，vol.90，no.1，109-111；N.Kh.Petrov，V.N.Borisenko，M.V.Alfimov，Magnetic Field Effects ofExciplex Fluorescence of the Pyrene-Azacrown Ether System inthe presence of Alkali and Alkaline Earth Salts，J.Chem.Soc.，Mendeleev Commun.1995；N.Kh.Petrov，V.N.Borisenko，M.V.Alfimov，T.Fiebig，H.Staerk，F(xiàn)luorescence-detectedMagnetic Field Effects in Exciplex Systems Containing AzacrownEthers as Electron Donor，J.Phys.Chem.，1996，vol.100，no.16，6368-6370。
作為另一選擇，替代磁敏感熒光標(biāo)記物，可以使用電敏感熒光標(biāo)記物。這些由于這樣的事實(shí)而相應(yīng)地被辨別，即它們的熒光性能取決于它們所處的外部電場(chǎng)。熒光性能的明顯變化頻繁發(fā)生在106V/m量級(jí)的電場(chǎng)強(qiáng)度中的差異處。電敏感熒光標(biāo)記物也用于測(cè)量自然發(fā)生的電場(chǎng)強(qiáng)度(例如，細(xì)胞膜內(nèi)的)。為此，電敏感熒光標(biāo)記物例如在美國(guó)專利說明書2002/0155520A9中記載；在此描述的標(biāo)記物也可以用于本情況中，并且所述文獻(xiàn)被全部結(jié)合到本申請(qǐng)中以作參考。此外，關(guān)于該主題可以參考作為更多的出版物代表的Jian-young Wu等人的Histochemical Journal，30169-187(1998)。為了記錄，下面描述的用于磁敏感熒光標(biāo)記物的方法同樣可以類似地用于電敏感標(biāo)記物。
為了能夠利用熒光標(biāo)記物21對(duì)磁場(chǎng)的敏感性，能夠在樣品20內(nèi)產(chǎn)生非均勻磁場(chǎng)33的場(chǎng)發(fā)生器30放置在探頭20附近。在所示的例子中，場(chǎng)發(fā)生器30包括三個(gè)(例如永磁)極體。具有“磁北極”極性的第一極體31優(yōu)選地具有尖端以便提高對(duì)樣品的光學(xué)可達(dá)性。在第一極體31的相對(duì)側(cè)上存在兩個(gè)另外的具有“磁南極”極性的極體32。這些可以替換地環(huán)形圍繞第一極體31。使用該配置，其中磁場(chǎng)強(qiáng)度大約為零的焦點(diǎn)區(qū)22出現(xiàn)在第一極體31的尖端前面，如虛場(chǎng)力線33所示。尖端距焦點(diǎn)區(qū)22的距離取決于期望的梯度，對(duì)于106T/m的梯度典型地大約為1μm，對(duì)于103T/m的梯度為毫米范圍。焦點(diǎn)區(qū)的寬度例如大約可以為1nm。此外，確定場(chǎng)發(fā)生器30的尺寸，使得焦點(diǎn)區(qū)22周圍的磁場(chǎng)33的梯度超過106T/m(在非均勻電場(chǎng)的情況下，所述梯度應(yīng)當(dāng)超過1015V/m2)。
在圖中，在顯微鏡裝置之上，來自樣品20的熒光輻射vF在位置x上的強(qiáng)度IF的分布被再現(xiàn)。假設(shè)在這里的例子中熒光標(biāo)記物21在樣品20中大致均勻分布，從而原則上所有點(diǎn)發(fā)出強(qiáng)度相同的熒光輻射。然而，除此之外的是非均勻磁場(chǎng)33的小焦點(diǎn)區(qū)22，在該區(qū)域中強(qiáng)度減小。在相關(guān)點(diǎn)x0處，強(qiáng)度分布IF因此呈現(xiàn)最小值。但是由于顯微鏡10的有限光學(xué)分辨率，因此所述最小值不能被直接清晰地再現(xiàn)。相反地，用顯微鏡裝置觀察的熒光強(qiáng)度IFM的過程具有在圖的上部圖表中示出的過程，其中所述最小值相應(yīng)地被加寬和展平。由于非均勻磁場(chǎng)33的位置和因此樣品內(nèi)焦點(diǎn)區(qū)22的位置可以變化，因此焦點(diǎn)區(qū)22的該“模糊”再現(xiàn)仍然可以用于提高顯微鏡裝置的分辨率。通過同時(shí)觀察被測(cè)強(qiáng)度分布IFM中的變化，可以得出關(guān)于局部限定區(qū)域22中的狀況的數(shù)學(xué)結(jié)論。結(jié)果，通過移動(dòng)焦點(diǎn)區(qū)22，可以用納米范圍的分辨率掃描熒光標(biāo)記物的濃度。
為了優(yōu)化可用顯微鏡裝置獲得的再現(xiàn)質(zhì)量，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地使背景輻射的比例最小化，因此信噪比被最大化。這樣做的一種方式包括通過初級(jí)輻射vE僅僅激發(fā)小樣品區(qū)，并且將觀察限制在相應(yīng)的小區(qū)域。理想地，因此使用高質(zhì)量共焦掃描顯微鏡。此外，諸如雙光子激發(fā)和受激發(fā)射這樣的技術(shù)是有用的。也可以通過在時(shí)間上積分和/或用于激發(fā)的高亮級(jí)來提高信噪比。在這方面熒光標(biāo)記物的光致退色限制了該方法。與所有上述技術(shù)類似，通常從熒光顯微術(shù)獲知的許多其它技術(shù)也可以與本方法結(jié)合使用。
而且，可能出現(xiàn)的情況是熒光標(biāo)記物21將由于受激狀態(tài)的化學(xué)反應(yīng)(例如與氧氣)而隨著時(shí)間退化。在這種情況下，優(yōu)選地通過擴(kuò)散替換退化標(biāo)記物分子。如果例如將要觀察樣品的表面，這可以被浸入到熒光標(biāo)記物的溶液中。熒光標(biāo)記物的分子然后在樣品的表面吸收退化分子，所述退化分子不時(shí)地由來自所述溶液的熒光標(biāo)記物的未消耗分子替換。
所述顯微鏡裝置可以用于成像固體，其方式與目前用電子顯微鏡進(jìn)行的掃描類似。在上述基于磁場(chǎng)的方法中有利地是樣品并不需要被干燥，并且生物樣品甚至可以仍然是活的。如果使用電場(chǎng)，樣品應(yīng)當(dāng)被電絕緣。這例如可以通過將其放置在油或去礦化水中或者通過冷凍來實(shí)現(xiàn)。
而且，所述方法可以用于檢測(cè)生物分子。在這種情況下，不同分子的樣品可以與熒光標(biāo)記物(一種或多種的顏色)混合，其特異地或非特異地結(jié)合到待標(biāo)識(shí)的分子。然后借助于觀察到的熒光標(biāo)記物的空間分布實(shí)現(xiàn)分子的標(biāo)識(shí)。在熒光標(biāo)記物與分子非特異結(jié)合的情況下，例如可以通過這樣的事實(shí)來標(biāo)識(shí)大分子，即熒光標(biāo)記物結(jié)合到分子的不同點(diǎn)，因此致使分子的特征空間形式可識(shí)別。在熒光標(biāo)記物的特異結(jié)合的情況下，所述方法例如可以允許DNA樣品的快速分段；在這里，不同顏色可以編碼不同的核苷酸。
權(quán)利要求
1.一種顯微鏡裝置，用于成像包含磁和/或電敏感熒光標(biāo)記物(21)的樣品(20)，包括-熒光顯微鏡(10)，用于激發(fā)和成像來自樣品(20)的熒光輻射(vF)；-場(chǎng)發(fā)生器(30)，用于在樣品(20)中產(chǎn)生非均勻磁場(chǎng)和/或非均勻電場(chǎng)(33)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯微鏡裝置，其被設(shè)計(jì)成以限定的方式改變樣品(20)中的非均勻場(chǎng)(33)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于用于產(chǎn)生非均勻場(chǎng)(33)的所述場(chǎng)發(fā)生器(30)具有第一極性(N)的第一極體(31)，其在至少兩個(gè)相對(duì)側(cè)上鄰近于不同極性(S)的第二極體(32)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯微鏡裝置，其特征在于它包括用于對(duì)所述熒光顯微鏡(10)記錄的圖像(IFM)進(jìn)行圖像處理的數(shù)據(jù)處理設(shè)備，所述數(shù)據(jù)處理設(shè)備被設(shè)計(jì)成由在一個(gè)或優(yōu)選若干個(gè)記錄期間的非均勻場(chǎng)(33)的已知空間強(qiáng)度分布來重建樣品(20)中熒光標(biāo)記物(21)的分布。
5.一種用于確定樣品(20)中磁和/或電敏感熒光標(biāo)記物(21)的空間分布的方法，所述方法包括以下步驟-在樣品(20)中產(chǎn)生非均勻磁場(chǎng)和/或非均勻電場(chǎng)(33)；-激發(fā)樣品(20)中的熒光輻射(vF)；-借助于熒光顯微鏡(10)產(chǎn)生來自樣品(20)的熒光輻射(vF)的圖像(IFM)；-借助于產(chǎn)生的圖像(IFM)和借助于所述場(chǎng)(33)的已知強(qiáng)度分布，計(jì)算熒光標(biāo)記物(21)的空間分布。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述非均勻磁場(chǎng)(33)具有至少102T/m的梯度，優(yōu)選至少為106T/m。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述非均勻電場(chǎng)具有至少1011V/m2的梯度，優(yōu)選至少為1015V/m2。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述非均勻場(chǎng)(33)具有場(chǎng)強(qiáng)的局部最小值(22)，尤其是無場(chǎng)點(diǎn)或區(qū)域。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述局部最小值(22)的寬度小于熒光顯微鏡(10)的光學(xué)分辨率。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于樣品(20)位于具有熒光標(biāo)記物的溶液中。
全文摘要
本發(fā)明涉及顯微鏡裝置和可以用所述顯微鏡裝置確定樣品(20)中磁和/或電敏感熒光標(biāo)記物(21)的空間分布的方法。熒光輻射(VF)由樣品(20)中的初級(jí)輻射(VE)激發(fā)并且由顯微鏡成像。同時(shí)，在樣品(20)內(nèi)產(chǎn)生空間非均勻磁場(chǎng)和/或電場(chǎng)(33)，其例如具有最小場(chǎng)強(qiáng)的小焦點(diǎn)區(qū)(22)。熒光輻射的發(fā)射在焦點(diǎn)區(qū)(22)中被局部改變，這可以在測(cè)量的強(qiáng)度分布(IFM)中被觀察。以這種方式，甚至可以在具有小于顯微鏡(10)的光學(xué)分辨率的尺寸的區(qū)域(22)中重建熒光標(biāo)記物(21)的分布。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1918501SQ200580004313
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月9日
發(fā)明者B·格萊希 申請(qǐng)人:皇家飛利浦電子股份有限公司