專利名稱：快速檢測(cè)硫丹、ddt殘留的膠體金試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于蔬菜及原糧類食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)試紙及其檢測(cè)方法，屬膠體金免疫檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于蔬菜生長(zhǎng)期短且病蟲害較為嚴(yán)重，因而，在蔬菜種植過(guò)程中常常需要連續(xù)多次施藥。而不少蔬菜需要多次采收，采收與施藥的時(shí)間間隔短，造成采收時(shí)蔬菜中的農(nóng)藥殘留量往往較高，很容易超過(guò)國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。而蔬菜中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)會(huì)嚴(yán)重影響人類健康水平，已成為不容忽視的食品污染源。政府和各職能部門對(duì)食品的農(nóng)藥殘留問(wèn)題十分關(guān)注。但由于農(nóng)藥的毒性和害蟲的抗藥性形成一個(gè)惡性循環(huán)，因此全面徹底禁止高劇毒農(nóng)藥的使用將有一個(gè)較長(zhǎng)的過(guò)程，即使是全面使用中、低毒農(nóng)藥，農(nóng)藥惡性中毒事件仍然發(fā)生。因此對(duì)分析檢測(cè)的對(duì)象、種類、數(shù)量、范圍、指標(biāo)等諸多方面都提出了新的要求和更高標(biāo)準(zhǔn)。
硫丹(6，7，8，9，10，10’-六氯-1，5，5a，6，9，9a-六氫-6，9-甲撐-2，4，3-苯并-二氧硫庚-3-氧化物)，一種具有殺菌作用的有機(jī)氯類殺蟲劑，屬于高毒性農(nóng)藥。從今年8月份開始，歐盟(EU)對(duì)“硫丹”的農(nóng)藥殘留檢出標(biāo)準(zhǔn)由30mg/kg提高到了0.01mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格了3000倍。中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)于2005年1月25日發(fā)布，2005年10月1日實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量(GB 2763-2005)，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了農(nóng)藥硫丹在甘蔗中的最大允許殘留量為0.5mg/kg；梨類水果中的最大允許殘留量為1mg/kg。
DDT(2，2-雙(對(duì)氯苯基)-1，1，1-三氯乙烷)，一種高毒性有機(jī)氯殺蟲劑。高致癌性，為國(guó)家明令禁止使用的農(nóng)藥。
目前，檢測(cè)農(nóng)藥殘留的分析方法主要是依靠、氣相色譜法(GC)或氣相色譜與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用法(GC/MS)?！懊敢种坡史?分光光度法”已被列為國(guó)家推薦標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 5009.199-2003)。該法快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便且成本低廉，可實(shí)現(xiàn)快速初篩，但受檢測(cè)范圍和精度的限制。而氣相色譜法(GC)可實(shí)現(xiàn)精度的定量分析但速度較慢，檢測(cè)成本較高?？傊@些方法普遍存在著樣品前處理過(guò)程復(fù)雜，靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，耗時(shí)，檢測(cè)設(shè)備昂貴，并要求有專業(yè)的技術(shù)人員及較長(zhǎng)的分析周期。
因此，利用競(jìng)爭(zhēng)法原理，在傳統(tǒng)免疫檢測(cè)法的基礎(chǔ)上引入了膠體金快速檢測(cè)技術(shù)，研制出硫丹膠體金競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)試紙、DDT膠體金競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)試紙。該方法具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)需專業(yè)人員檢測(cè)，真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡(jiǎn)易操作的有機(jī)統(tǒng)一，同時(shí)具有保存方便，有效期長(zhǎng)的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述存在的一些問(wèn)題，提供了一種適用于檢測(cè)硫丹、DDT是否超標(biāo)的膠體金測(cè)定試紙。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在硫丹或DDT殘留檢測(cè)試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗(yàn)線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水層，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水層和硫丹、DDT單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接(交疊連接部分在1-2毫米范圍)，在硫丹單克隆抗體、DDT單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層。關(guān)于底板、硝酸纖維素膜、吸水紙、膠體金標(biāo)墊的組合方法按專利CN 2741052Y執(zhí)行。
農(nóng)藥硫丹或DDT殘留檢測(cè)試紙的控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，試驗(yàn)線檢測(cè)硫丹是由硫丹合成免疫原包被、檢測(cè)DDT是由DDT合成免疫原包被。把檢測(cè)硫丹或DDT殘留的膠體金試紙的樣品吸液層端放入果汁、蔬菜浸汁中，由于毛細(xì)管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至單克隆抗體金標(biāo)墊時(shí)，樣品中的硫丹與硫丹單克隆抗體金標(biāo)探針、DDT與DDT單克隆抗體金標(biāo)探針發(fā)生特異結(jié)合，當(dāng)移動(dòng)至固定有硫丹合成免疫原試驗(yàn)線、DDT合成免疫原試驗(yàn)線時(shí)，由于硫丹單克隆抗體金標(biāo)墊中的抗體與樣品中硫丹、DDT單克隆抗體金標(biāo)墊中的抗體與樣品中DDT優(yōu)先結(jié)合成復(fù)合物而失去其與硫丹或DDT合成免疫原結(jié)合，因此其膠體金不能滯留于試驗(yàn)線上，試驗(yàn)線處沒有紅色線顯示，即只有一條紅色控制線為陽(yáng)性；相反如果樣品中沒有硫丹、DDT，單克隆抗體金標(biāo)墊中的抗體移動(dòng)到試驗(yàn)線上，硫丹單克隆抗體就會(huì)與硫丹合成免疫原、DDT單克隆抗體就會(huì)與DDT合成免疫原發(fā)生特異結(jié)合，使膠體金滯留于試驗(yàn)線上，即二條紅色線為陰性，這就是免疫競(jìng)爭(zhēng)法原理。試驗(yàn)線的顏色深淺與樣品中硫丹或DDT含量高低成反比。從陽(yáng)性過(guò)渡到陰性，由于所測(cè)硫丹或DDT含量不同，試驗(yàn)線的顏色也不同，形成一個(gè)紅色顏色梯度差，以這種原理檢測(cè)出OD值，從而推斷出試驗(yàn)線所反應(yīng)實(shí)際硫丹或DDT的量。
用競(jìng)爭(zhēng)法制成試紙其檢測(cè)硫丹、DDT設(shè)定檢出量以上，觀察窗處出現(xiàn)一條紅線為陽(yáng)性；設(shè)定檢出量以下出現(xiàn)雙紅線為陰性；設(shè)定檢出量時(shí)在試驗(yàn)線處為一條模糊陰影線為界限值，從而得出判斷。
當(dāng)移動(dòng)至羊抗鼠多克隆抗體控制線時(shí)，無(wú)論樣品中有無(wú)硫丹、DDT，標(biāo)記的金標(biāo)探針都會(huì)與已設(shè)定好的羊抗鼠多克隆抗體結(jié)合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無(wú)色帶產(chǎn)生則代表操作有誤，檢測(cè)時(shí)樣品液面超過(guò)MAX線或試紙已經(jīng)過(guò)期。
由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的一種快速檢測(cè)硫丹、DDT殘留的膠體金試紙具有這樣的有益效果，即特異性強(qiáng)，靈敏度高，易儲(chǔ)存，無(wú)須專門技術(shù)人員操作，而且結(jié)果易讀。


圖1為本發(fā)明一種快速檢測(cè)硫丹、DDT殘留的膠體金試紙的主視結(jié)構(gòu)圖。
圖2為發(fā)明圖一的側(cè)視結(jié)構(gòu)圖。
圖3為檢測(cè)顯示陽(yáng)性結(jié)果圖。
圖4為檢測(cè)顯示陰性結(jié)果圖。
圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗(yàn)線，5、單克隆抗體金標(biāo)墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、MAX線。
具體實(shí)施例1.根據(jù)硫丹分子結(jié)構(gòu)，推斷其分子中的抗原決定區(qū)，選用硫丹農(nóng)藥原藥經(jīng)化學(xué)反應(yīng)合成一種與硫丹分子結(jié)構(gòu)相近的且具有羧基或氨基等易于蛋白質(zhì)大分子相連接基團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)(半抗原)。在縮合劑作用下使半抗原小分子與蛋白質(zhì)大分子相連接制得硫丹免疫抗原。DDT抗原制備方法同硫丹。
2.單克隆抗體的制備(1)用合成的免疫原免疫BALB/c小鼠。用SP2/0細(xì)胞融合建立瘤株進(jìn)行篩選，取瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹水。
(2)提取小鼠腹水純化篩選，獲得能與硫丹分子結(jié)合的單克隆抗體用于膠體金標(biāo)記。DDT單克隆抗體制備方法同硫丹。
3.膠體金的制備及與單克隆抗體的結(jié)合(1)取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到85～95℃，加入適量檸檬酸三納繼續(xù)加熱攪拌至沸騰3～10分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)把硫丹單克隆抗體標(biāo)記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。
DDT單克隆抗體結(jié)合膠體金方法同硫丹。
4.制膜機(jī)制膜利用電腦控制傳動(dòng)速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5.試紙條組合見說(shuō)明書附圖圖2，同專利CN 2741052Y。
6.使用方法把試紙的樣品吸液層端放入蔬菜浸汁中(液面不得超過(guò)MAX線圖中8)，1分鐘后取出試紙平放，由于毛細(xì)管和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動(dòng)，5分鐘時(shí)觀察結(jié)果。
7.結(jié)果判斷檢測(cè)硫丹濃度0.5mg/kg以上，觀察窗處出現(xiàn)一條紅線為陽(yáng)性；0.5mg/kg以下出現(xiàn)雙紅線為陰性；0.5mg/kg時(shí)在試驗(yàn)線處為一條模糊陰影線為界限值，此界限值為國(guó)家頒布的蔬菜農(nóng)藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)0.5mg/kg。從而得出判斷。
權(quán)利要求1.一種快速檢測(cè)硫丹、DDT殘留的膠體金試紙，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、硫丹、DDT單克隆抗體金標(biāo)墊(5)、樣品吸液層(6)、MAX線(8)組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗(yàn)線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)硫丹、DDT殘留的膠體金試紙，其特征在于控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)硫丹、DDT殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗(yàn)線是由硫丹合成免疫原或DDT合成免疫原包被制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種快速檢測(cè)硫丹、DDT殘留的膠體金試紙，其特征在于根據(jù)調(diào)節(jié)金標(biāo)墊和試驗(yàn)線包被物的成分，此試紙可以檢測(cè)硫丹、DDT原藥或混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)硫丹、DDT殘留的膠體金試紙，其特征在于金標(biāo)墊是由單克隆抗體作為膠體金標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測(cè)硫丹、DDT殘留的膠體金試紙，其特征在于試驗(yàn)線的檢測(cè)值設(shè)定為最低檢出量為硫丹0.5～1mg/kg、DDT 0.01～2mg/kg。
專利摘要一種快速檢測(cè)硫丹、DDT殘留的膠體金試紙，由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、單克隆抗體金標(biāo)墊、樣品吸液層組成。底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有硫丹合成免疫原試驗(yàn)線或DDT合成免疫原試驗(yàn)線和一條多克隆抗體控制線，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層，通過(guò)膠體金免疫競(jìng)爭(zhēng)方法制成試紙，利用免疫膠體金法來(lái)檢測(cè)果蔬中的硫丹或DDT殘留量是否超標(biāo)。該方法具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)需專業(yè)人員檢測(cè)，真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡(jiǎn)易操作的有機(jī)統(tǒng)一，同時(shí)具有保存方便，有效期長(zhǎng)的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK2844924SQ20052014262
公開日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2005年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月6日
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