專利名稱：用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種快速檢測(cè)動(dòng)物性食品中氯霉素殘留的生物免疫測(cè)試技術(shù)。
背景技術(shù)：
牛奶中含有人體生長(zhǎng)發(fā)育和保持健康的全部營養(yǎng)素，而深受廣大群眾的喜愛，如上海的牛奶年人均消費(fèi)達(dá)到了25公斤。然而在牛奶的安全問題中首要問題即是抗生素在牛奶中的殘留。氯霉素是養(yǎng)殖業(yè)當(dāng)中經(jīng)常用到的抗生素，農(nóng)戶在出售牛奶時(shí)很少能按照國家的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，這給消費(fèi)者造成的很大的食品安全隱患。同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間的攝取抗生素會(huì)造成細(xì)菌的耐藥性。目前對(duì)氯霉素的檢測(cè)方法非常的繁瑣，耗時(shí)且檢測(cè)成本很高，同時(shí)還需要昂貴的儀器，很難進(jìn)行推廣。
當(dāng)前國內(nèi)外檢測(cè)氯霉素的方法主要有①儀器分析法。如高效液相色譜、氣相色譜、凝膠滲透色譜、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、毛細(xì)管區(qū)域電泳技術(shù)等。儀器分析法具有較高的精確性、準(zhǔn)確性和敏感性，但因其流程繁瑣、設(shè)備昂貴、檢測(cè)速度慢等原因，很難實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和普及推廣；②免疫分析法。如熒光免疫分析、放射免疫檢測(cè)、酶免疫技術(shù)。免疫分析技術(shù)靈敏度高(檢測(cè)限可達(dá)10-9～10-12g)、特異性強(qiáng)及樣品容量大、儀器化程度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來迅速發(fā)展，是目前最理想的殘留篩選性分析方法之一。但開發(fā)過程投入資金多，時(shí)間長(zhǎng)，樣品前處理較復(fù)雜、假陽性率高，較難實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求；③微生物檢測(cè)法。該方法是測(cè)定抗生素殘留的經(jīng)典方法，具有前處理簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、批量大等優(yōu)點(diǎn)，但精確度、準(zhǔn)確度和特異性不高。生物傳感器技術(shù)被列為邁向21世紀(jì)五大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)之一。具有精確度、靈敏度高(檢測(cè)下限可達(dá)0.003ng/g)、特異性強(qiáng)、樣品前處理簡(jiǎn)單(有的樣品無須前處理)、響應(yīng)和檢測(cè)迅速(每個(gè)樣品只需幾十秒~幾分鐘)，選擇性好、操作簡(jiǎn)單、攜帶方便、能重復(fù)利用并能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，有望開發(fā)成檢測(cè)激素、抗生素或農(nóng)藥殘留的最有效的新技術(shù)。國外已開發(fā)出檢測(cè)黃曲霉素、甲醇、硝酸鹽的傳感器等，但用于檢測(cè)氯霉素等抗生素的傳感器的研究處于起步階段。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有專利技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，專利申請(qǐng)?zhí)枮镃N02137940.8，一種動(dòng)物性食品中氯霉素酶免疫檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，在此發(fā)明中通過ELISA的方法對(duì)肉制品當(dāng)中的氯霉素殘留進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過程中涉及到10種試劑，使用過程較為繁瑣。并且ELISA方法存在假陽性及假陰性較高、重復(fù)性不好等問題，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)過程中需要其它的儀器進(jìn)行讀板，給快速檢測(cè)帶來了一定的麻煩。同時(shí)，通過搜索其它的相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)氯酶素的檢測(cè)現(xiàn)在較多的還是依靠液相及ELISA的方法，未有使用免疫傳感器進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道；迫切需要開發(fā)研制簡(jiǎn)便、快速、高效、準(zhǔn)確、微型、便攜、適合現(xiàn)場(chǎng)和在線檢測(cè)的檢測(cè)儀器和檢測(cè)工具。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法；所述免疫傳感電極用于能精確、靈敏、價(jià)廉、響應(yīng)和檢測(cè)迅速、選擇性好、操作簡(jiǎn)單、攜帶方便、能重復(fù)利用并能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和在線檢測(cè)的氯霉素殘留的生物(免疫)傳感器中。
本發(fā)明所要進(jìn)一步解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速、準(zhǔn)確、靈敏的、能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和在線檢測(cè)的用免疫傳感電極檢測(cè)氯霉素殘留的方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所提供的一種用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法，其特征在于，所述免疫傳感電極是貼有氯霉素抗體固定傳感膜的納米修飾印刷電極，所述免疫傳感電極的制作方法如下1)氯霉素單克隆抗體的制備其制備方法為混合酸酐法，將合成的免疫原CAP-BSA與等量福氏完全佐劑乳化后皮下注射，再選擇血清效價(jià)高且特異性的小鼠作為作為融合的脾細(xì)胞來源，通過與SP2/O骨髓瘤細(xì)胞融合制備單克隆抗體；2)氯霉素抗體固定膜的制備這是制備整個(gè)傳感器的核心和關(guān)鍵，采用雙酶系統(tǒng)來完成氧化還原反應(yīng)過程中的電子傳遞；即用醋酸纖維素的丙酮溶液為基質(zhì)液，制備成薄膜，用不同濃度的高碘酸鈉、乙二胺和戊二醛處理后，加入1)所述單克隆抗體溶液，并進(jìn)行固定和聚合；3)藥物酶標(biāo)記的制備氯霉素的酶標(biāo)記制備采用重氮化法；4)絲網(wǎng)印刷電極的制作將傳統(tǒng)的較為復(fù)雜的Clerk氧電極改制成絲網(wǎng)印刷電極；5)納米修飾電極的制作通過反向微乳液法制備二茂鐵-SiO2納米粒子并滴加于4)所述印刷電極表面構(gòu)成納米修飾電極；6)免疫傳感器電極(換能器)的制作在所述納米修飾電極貼上抗體傳感膜以完成免疫傳感器電極的制作；7)最后連接電信號(hào)輸出、顯示和數(shù)據(jù)處理、轉(zhuǎn)化的電子元件系統(tǒng)，在測(cè)量時(shí)可以直接顯示測(cè)得殘留物的含量或濃度值。
所述步驟2)氯霉素抗體固定膜的制備中，在抗體傳感膜經(jīng)固定和聚合后，然后測(cè)定微型固定膜中抗體的親和性和重復(fù)性；用絲素膜、聚乙烯碳酸酯膜和清蛋白-多聚甲醛膜法進(jìn)行比較，選擇出靈敏度高、響應(yīng)快、傳質(zhì)好、線性范圍寬的單克隆抗體固定膜。
所述步驟3)藥物酶標(biāo)記的制備中，先將氯霉素用鋅粉在稀鹽酸條件下還原成含氨基的衍生物，在溫度為0℃及pH為1.0-2.0條件下加入適量的亞硝酸鈉使上述衍生物形成重氮化結(jié)構(gòu)；再次調(diào)節(jié)合適的pH后，同相應(yīng)濃度的酶(本實(shí)驗(yàn)擬采用葡萄糖氧化酶或過氧化氫酶)進(jìn)行偶聯(lián)；用透析及層析(Sephadex-G50)程序純化合成產(chǎn)物，以紫外掃描法測(cè)定合成產(chǎn)物中氯霉素與酶蛋白的結(jié)合比。
所述步驟4)絲網(wǎng)印刷電極的制作中，基底材料選用PVC片，在其上再貼上一塊已刻制好電極形狀的粘性塑料薄膜，用反復(fù)銀鏡法沉淀出均勻的導(dǎo)電底層，每次反應(yīng)后再用三蒸水充分洗凈以保證銀膜具有足夠的厚度及牢度；也可以直接用絲網(wǎng)印刷工藝來完成導(dǎo)電底層的制作；鍍銀完成后剝離粘性塑料薄膜，在其上覆蓋硅酮膠覆蓋此銀膜以絕緣，保留兩個(gè)端部，一端作為接線端，在另一端印刷上由石墨粉、醋酸纖維素、丙酮、環(huán)己酮調(diào)制成的電極漿液，待溶劑揮發(fā)干燥后作為工作電極；然后分別用Ag/AgCl導(dǎo)電液印制參比電極；以噴鍍法制作超薄的鉑片對(duì)電極。
所述步驟5)納米修飾電極的制作中，先采用Emmanuel的反向微乳液法制備二茂鐵---SiO2納米粒子，即將適量的環(huán)己烷、正己醇和聚乙二醇辛基苯基醚混合攪拌均勻，加入二茂鐵及水溶液后再繼續(xù)攪拌成穩(wěn)定的水包油體系；在正硅酸四乙酯及氨水存在的條件下充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)后，用丙酮分離出納米顆粒，并分散在PBS溶液中，在修飾電極前加入殼聚糖溶液并超聲混勻，吸取適量的上述納米混懸液滴涂于4)所述印刷電極表面，制成納米修飾電極。
為了進(jìn)一步解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種使用免疫傳感電極組裝的生物傳感器，包括一檢測(cè)部分包括自動(dòng)定時(shí)、數(shù)據(jù)采集、顯示、打印接口等部分，對(duì)恒電位儀的給定電位、保護(hù)電位、輸出電壓、輸出電流等參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量、顯示及打?。灰豢刂撇糠譃榫чl管型直流穩(wěn)壓電源的恒電位系統(tǒng)、數(shù)模轉(zhuǎn)換器及程序存儲(chǔ)器等關(guān)鍵部件；一數(shù)據(jù)采集采用模擬開關(guān)選送A/D芯片及IC數(shù)字變量，使讀入的數(shù)據(jù)經(jīng)軟件處理后送LED顯示和打印機(jī)打??；一主機(jī)系統(tǒng)檢測(cè)部分采用單片機(jī)系統(tǒng)、E2PROM芯片、擴(kuò)展的程序存儲(chǔ)器以及擴(kuò)展的I/O接口；一應(yīng)用軟件系統(tǒng)包括時(shí)間采集、數(shù)制轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理、顯示及打印程序；其特征在于，還包括一免疫傳感電極以及連接所述免疫傳感電極的輸出顯示和微型化微分脈沖微電流顯示計(jì)和微型數(shù)據(jù)采集卡組成的信號(hào)處理系統(tǒng)。
為了進(jìn)一步解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種用免疫傳感電極檢測(cè)氯霉素殘留的方法，其特征在于，1)將氯霉素的單克隆抗體微型化膜(感受器，或分子識(shí)別物)固定于換能器表面；2)測(cè)定時(shí)在待測(cè)的樣品中加入已知濃度經(jīng)酶標(biāo)記的氯霉素，待測(cè)抗原與標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合電極上的抗體，使經(jīng)洗滌后的傳感電極與底物溶液接觸，標(biāo)記酶催化底物產(chǎn)生氧化電流；3)通過連接的電信號(hào)輸出、顯示和數(shù)據(jù)處理、轉(zhuǎn)化的電子元件系統(tǒng)，直接顯示測(cè)得殘留物的含量或濃度值。
利用本發(fā)明提供的用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法，由于免疫生物傳感器是現(xiàn)代高科技的產(chǎn)物，是現(xiàn)代生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)等多學(xué)科、多領(lǐng)域相交叉和結(jié)合的產(chǎn)物，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和樣品前處理簡(jiǎn)單(有的樣品無須前處理)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還具有響應(yīng)和檢測(cè)迅速(每個(gè)樣品只需幾十秒～幾分鐘)、操作簡(jiǎn)單、所需設(shè)備成本低等特點(diǎn)。本發(fā)明的免疫傳感器電極制作方法給免疫傳感器真正應(yīng)用于檢測(cè)提供了便利，簡(jiǎn)化了傳感器的構(gòu)造，提高了便攜性，使傳感器在檢測(cè)中的應(yīng)用得以真正的實(shí)現(xiàn)；而且生物傳感器分析技術(shù)的前景廣闊、市場(chǎng)潛力巨大，是多領(lǐng)域應(yīng)用研究開發(fā)的熱點(diǎn)。本發(fā)明的有益效果1)應(yīng)用生化電子、生物免疫技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物性食品中殘留的抗生素，方便、精確、靈敏、價(jià)廉，并將納米材料修飾絲網(wǎng)印刷電極應(yīng)用于免疫傳感器，簡(jiǎn)化了測(cè)試過程及提高了儀器的靈敏度；2)本發(fā)明的免疫生物傳感器具有操作簡(jiǎn)便、攜帶方便，準(zhǔn)確、特異、能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及能重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)(如檢測(cè)下限可達(dá)0.3ppb以下，檢測(cè)時(shí)間為45秒至2分鐘)；
3)本發(fā)明的免疫生物傳感器具有通用性。在標(biāo)記不同藥物抗體的條件下特異、快速地檢測(cè)相應(yīng)的殘留藥物。為農(nóng)產(chǎn)品中其他各類殘留藥物的系列傳感器研制打下基礎(chǔ)；因此，本發(fā)明的免疫生物傳感器具有精確、靈敏、價(jià)廉、響應(yīng)和檢測(cè)迅速、選擇性好、操作簡(jiǎn)單、攜帶方便、能重復(fù)利用并能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和在線檢測(cè)的氯霉素殘留的特點(diǎn)。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例電極工作原理示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例電極的改制示意圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例電子傳遞鏈?zhǔn)疽鈭D；圖4是本發(fā)明實(shí)施例抗原與酶標(biāo)抗原與膜的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合示意圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例中免疫傳感電極的制作方法示意框圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合

對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本實(shí)施例并不用于限制本發(fā)明，凡是采用本發(fā)明的相似結(jié)構(gòu)、方法及其相似變化，均應(yīng)列入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
參見圖5所示，本發(fā)明實(shí)施例所提供的一種用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法1、氯霉素單克隆抗體的制備其制備方法為混合酸酐法，將合成的免疫原CAP-BSA與等量福氏完全佐劑乳化后皮下注射，再選擇血清效價(jià)高且特異性的小鼠作為作為融合的脾細(xì)胞來源，通過與SP2/O骨髓瘤細(xì)胞融合制備單克隆抗體；具體如下所述混合酸酐法中；首先制備氯霉素半琥珀酸酯，即將氯霉素、琥珀酸酐、丙酮、吡啶按一定比例混合后(1∶031∶2∶0.1)，攪拌溶解，并在適宜的溫度下回流數(shù)小時(shí)。蒸去丙酮后加入乙酸乙酯和稀鹽酸，用堿轉(zhuǎn)溶后再加酸溶解，水洗后再溶于碳酸氫鉀液及醋酸鋇。80℃條件下攪拌反應(yīng)，冷卻及真空干燥后得單酯粗品。然后以二甲基甲酰胺為溶劑，在氯甲酸乙酯及正丁醇胺存在的條件下，將上述制得的單酯同卵清蛋白連接成全抗原。用紫外吸收光譜推算卵清蛋白與氯霉素的偶聯(lián)率。經(jīng)徹底透析后，再用紅外光譜法檢測(cè)合成物的特征譜線及峰形。具體步驟如下①將氯霉素琥珀酸酐、丙酮、吡啶按1∶0.31∶2∶0.1的比例混合均勻后，于58～60℃條件下回流2小時(shí)；②蒸去丙酮，加乙酸乙酯和稀鹽酸的混合液(2∶1，V/V)，振蕩后棄去酸層，再用10％NaHCO3轉(zhuǎn)溶，加入濃鹽酸并調(diào)節(jié)pH到3，放置2小時(shí)，等待析出糖漿狀物；③再次棄去酸層，用三蒸水洗滌后將析出物溶于10％碳酸鉀溶液中，并加入醋酸鋇，在80℃條件下加熱攪拌20分鐘；④冷卻后濾出沉淀得鋇鹽粗品，將此鋇鹽加蒸餾水加熱溶解，再次冷卻后用鹽酸調(diào)pH到3；⑤濾出沉淀，蒸餾水洗，真空干燥后得單酯粗品。用乙醇活性炭脫色并再次過濾，經(jīng)蒸餾水洗重結(jié)晶后得單酯純品；⑥牛血清白蛋白(BSA)與氯霉素單酯衍生物的偶聯(lián)(CAP-BSA)取上述衍生物384mg，溶于22.5mL的N，N-2二甲基甲酰胺(DM F)中，置4℃下10分鐘后加入三正丁胺212.5μL，混合后再加入氯甲酸乙酯160μL，于4℃磁力攪拌30分鐘，以此為甲液；⑦稱取BSA 113g，溶于45mL 50％DM F中，置冰浴上邊攪拌邊用1M的NaOH調(diào)pH到8.0，此為乙液；⑧隨后將乙液傾入甲液中，在4℃下攪拌反應(yīng)4小時(shí)，用滅菌的0.85％NaCl在4℃下透析，換水16次后凍干保存。用紅外吸收光譜法推算BSA與氯霉素單酯衍生物的偶聯(lián)率。
動(dòng)物免疫試驗(yàn)將合成的免疫原CAP-BSA與等量福氏完全佐劑乳化后皮下注射6-8周齡雄性BALB/C小鼠，劑量為200μg/只。二免、三免及四免改為福氏不完全佐劑，每隔兩周皮下加強(qiáng)免疫一次，劑量仍為200μg/只。最后一次免疫后7-10天采血檢測(cè)抗體效價(jià)。
單克隆抗體的制備①建立間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)；②選擇血清效價(jià)高及特異性好的小鼠于融合前3天腹腔注射加強(qiáng)免疫，不用佐劑；③將SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞在50％的PEG作用下融合。并用HAT選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(37℃，5％CO2)；④雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆化經(jīng)2-3次檢測(cè)均為陽性的細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)，同時(shí)把陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并及時(shí)凍存；⑤單克隆抗體的生產(chǎn)及效價(jià)鑒定用誘生腹水法制備大量的單抗，并用已建立好的間接ELISA法測(cè)定效價(jià)；⑥單克隆抗體性質(zhì)的鑒定主要是鑒定單抗分子量、亞型、染色體、單抗親和力及特異性。
2、氯霉素抗體固定膜的制備這是制備整個(gè)傳感器的核心和關(guān)鍵，采用雙酶系統(tǒng)來完成氧化還原反應(yīng)過程中的電子傳遞(參見圖1所示)；具體如下用5％醋酸纖維素的丙酮溶液為基質(zhì)液，制備成0.007mm-0.01mm厚的薄膜，用不同濃度的高碘酸鈉、乙二胺和戊二醛處理后，加入1)所述單克隆抗體溶液，并進(jìn)行固定和聚合，然后測(cè)定微型固定膜中抗體的親和性和重復(fù)性。在研制載體膜方面，可用絲素膜、聚乙烯碳酸酯膜和清蛋白-多聚甲醛膜法進(jìn)行比較，選擇出靈敏度高、響應(yīng)快、傳質(zhì)好、線性范圍寬的單克隆抗體固定膜。
為提高傳感器的靈敏度，本發(fā)明欲采用雙酶系統(tǒng)來完成氧化還原反應(yīng)過程中的電子傳遞(參見圖3所示)。在抗體膜制作程序中，將一定濃度的抗體及辣根過氧化物酶同時(shí)包被子納米材料修飾電極表面，在競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)時(shí)，酶標(biāo)氯霉素與被檢物中的氯霉素在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合過程中與感應(yīng)器上的單克隆抗體結(jié)合后(參見圖4所示)，同已經(jīng)包被的辣根過氧化物酶組成雙酶?jìng)麟娮芋w系。
摻和法制備傳感膜的具體方案如下
①將15克的乙酸纖維素溶解于200mL二氯甲烷與無水乙醇的混合液中(V∶V＝4∶1)，在4℃條件下靜置4小時(shí)，使醋酸纖維素完全溶解；②在上述溶液中加入30g 1，6-己二胺，邊加邊攪拌，使1，6-己二胺完全溶解；③逐滴加入9.6mL含有乙醇的戊二醛溶液(25％戊二醛∶無水乙醇∶純水的體積比為1∶1∶1)，攪拌均勻，8層紗布過濾，并減壓抽去氣泡；④每次取上述反應(yīng)液10mL傾倒在規(guī)格為10cm×10cm的方形玻璃模具上，自然晾干成膜；⑤將制得的傳感膜切成直接為8mm的圓形小片，并浸泡在的磷酸鹽緩沖液中(0.01M，pH7.0)4 ℃冷藏待用；⑥傳感膜性能鑒定主要包括感觀質(zhì)量評(píng)定、活性測(cè)試、靈敏度測(cè)試及儀器測(cè)試；⑦抗體在傳感膜上的固定用戊二醛交聯(lián)法將1)所述單克隆抗體共價(jià)固定于傳感膜上；⑧封閉及保存選擇合適的封閉劑(如高分子聚合物、脫脂奶粉、明膠)等封閉傳感膜上的活性基團(tuán)。
3、藥物酶標(biāo)記的制備氯霉素的酶標(biāo)記制備采用重氮化法；具體如下即先將氯霉素用鋅粉在稀鹽酸條件下還原成含氨基的衍生物，在溫度為0℃及pH為1.0--2.0條件下加入適量的亞硝酸鈉使上述衍生物形成重氮化結(jié)構(gòu)。再次調(diào)節(jié)合適的pH后，同相應(yīng)濃度的酶(本實(shí)驗(yàn)擬采用葡萄糖氧化酶或過氧化氫酶)進(jìn)行偶聯(lián)。用透析及層析(Sephadex-G50)程序純化合成產(chǎn)物，以紫外掃描法測(cè)定合成產(chǎn)物中氯霉素與酶蛋白的結(jié)合比。具體步驟如下(以葡萄糖氧化酶為例)①稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品3.9mg，加入1mL 1mol/L的鹽酸3mL，再加入鋅粉20mg，于80℃水浴中加熱15分鐘；②將上清液冷卻到0至5℃，在pH1-2的條件下逐滴加入加入含10mgNaNO2的水溶液100mL，操作時(shí)不要離開冰水復(fù)合物，放置30min后，加入5mL氨基磺酸銨(125mg)，直至無N2放出為止，即得到重氮化的CLB；③將上述重氮化的氯霉素溶液20mL加入到190mL 0.01mol/L的pH7.0 PBS液(含0.1M NaCl，1mM MgCl2)和10mL含葡萄糖氧化酶(GOD)224.75mg的混合物中，充分混勻；④用1N的NaOH調(diào)pH至7.5后，4℃黑暗條件下放置過夜，加入280mL上述緩沖液；⑤將上述溶液裝入預(yù)先浸泡和洗凈的透析袋中，在0.01mol/的pH7.5PBS液中，4℃黑暗條件下透析3天(每隔4小時(shí)換一次PBS液)。再用Sephadex-G50進(jìn)行柱層析純化；⑥收集并濃縮層析液，與等體積甘油混合，-20℃儲(chǔ)存；⑦以紫外掃描法測(cè)定合成產(chǎn)物中氯霉素與酶蛋白的結(jié)合比，并鑒定標(biāo)記酶的活性。
4、絲網(wǎng)印刷電極的制作將傳統(tǒng)的較為復(fù)雜的Clerk氧電極改制成絲網(wǎng)印刷電極(參見圖2所示)；具體如下參見圖2所示，本發(fā)明改變傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)較為繁雜的Clerk氧電極結(jié)構(gòu)，自行設(shè)計(jì)及制備絲網(wǎng)印刷電極來代替原有電極模式；基底材料選用PVC片，在其上再貼上一塊已刻制好電極形狀的粘性塑料薄膜，用反復(fù)銀鏡法沉淀出均勻的導(dǎo)電底層，每次反應(yīng)后以用三蒸水充分洗凈以保證銀膜具有足夠的厚度及牢度。也可以直接用絲網(wǎng)印刷工藝來完成導(dǎo)電底層的制作。鍍銀完成后剝離粘性塑料薄膜，在其上覆蓋硅酮膠覆蓋此銀膜以絕緣，保留兩個(gè)端部，一端作為接線端，在另一端印刷上由石墨粉、醋酸纖維素、丙酮、環(huán)己酮調(diào)制成的電極漿液，待溶劑揮發(fā)干燥后作為工作電極。然后分別用Ag/AgCl導(dǎo)電液印制參比電極；以噴鍍法制作超薄的鉑片對(duì)電極。絲網(wǎng)印刷電極制作的具體工藝流程如下①電極基板的準(zhǔn)備，可選用高質(zhì)量的聚氯乙烯板，按照該材料的要求進(jìn)行表面潔凈化處理。
②導(dǎo)電油墨的選擇及準(zhǔn)備在厚膜型印刷電路中主要需要導(dǎo)體漿料、電阻漿料和絕緣漿料，在制作過程中要注意各種漿料的材質(zhì)、粘度及膨脹系數(shù)等。在本項(xiàng)目研究中主要應(yīng)用導(dǎo)電銀漿、高純碳粉漿及導(dǎo)電金漿。
③制作絲網(wǎng)印版，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的電極規(guī)格制作絲網(wǎng)模具，材料選用尼龍絲網(wǎng)。
④導(dǎo)體漿料絲網(wǎng)印刷，擬采用半自動(dòng)絲網(wǎng)印刷機(jī)來印制電極；電極條由三部分組成，分別為電接觸端、支路及工作電極端，各部分均由導(dǎo)電漿液印刷制得，漿料的厚度控制在30-50μm之間；⑤干燥，可在80℃條件下干燥處理15-20分鐘；⑥電阻漿料準(zhǔn)備，選用商品化的標(biāo)準(zhǔn)電阻漿料，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整組分后備用；⑦電阻漿料絲網(wǎng)印刷及電阻調(diào)整，印制程序基本同導(dǎo)體漿料的絲網(wǎng)印刷，按具體要求可重復(fù)印刷2-3次，并及時(shí)檢查電阻和調(diào)整電阻；⑧絲網(wǎng)印刷電極的質(zhì)量檢驗(yàn)，主要檢查印刷電極的導(dǎo)電性、電極的均一性、穩(wěn)定性。
5、納米修飾電極的制作通過反向微乳液法制備二茂鐵-SiO2納米粒子并滴加于4)所述印刷電極表面構(gòu)成納米修飾電極；具體如下先采用Emmanuel的反向微乳液法制備二茂鐵-SiO2納米粒子，即將適量的環(huán)己烷、正己醇和聚乙二醇辛基苯基醚混合攪拌均勻，加入二茂鐵及水溶液后再繼續(xù)攪拌成穩(wěn)定的水包油體系；在正硅酸四乙酯及氨水存在的條件下充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)后，用丙酮分離出納米顆粒，并分散在PBS溶液中，在修飾電極前加入殼聚糖溶液并超聲混勻，吸取適量的上述納米混懸液滴涂于4)所述印刷電極表面，制成納米修飾電極；具體步聚如下①取7.5mL環(huán)己醇、1.8mL正丁醇及1.77mL聚乙二醇辛基苯基醚，旋渦混勻10分鐘。
②在攪拌情況下緩慢地逐滴加入400μL二茂鐵甲醇液(二茂鐵濃度為1.0×10-2mol/L)及100μL去離子水。
③在上述溶液中加入100μL正硅酸四乙酯，室溫下攪拌30分鐘。
④緩慢加入60μL的濃氨水啟動(dòng)聚合反應(yīng)，在室溫及黑暗條件下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。
⑤將上述反應(yīng)產(chǎn)物——二茂鐵-SiO2納米顆粒用丙酮提取，6000轉(zhuǎn)/分離心分離后進(jìn)行超聲處理。
⑥分別用乙醇及去離子水洗滌納米離子數(shù)次，以除去二茂鐵-SiO2納米顆粒表面的未反應(yīng)的二茂鐵及表面活性劑。最后得到淡黃色的納米顆粒。
⑦將制得的納米顆粒用超聲法懸浮于2mL磷酸鹽緩沖鹽水中(PBS，pH6.9，0.01M)。
⑧將100μL含10％殼聚糖的溶液與1mL含有二茂鐵-SiO2納米顆粒的PBS液混合，使殼聚糖上的基團(tuán)與納米顆粒共價(jià)結(jié)合。
⑨取上述反應(yīng)物用陣列法點(diǎn)于絲網(wǎng)印刷電極上，每個(gè)電極片上加樣4μL，自然晾干。
6、免疫傳感器電極(換能器)的制作在5)所述納米修飾電極貼上2)所述抗體傳感膜以完成免疫傳感器電極的制作；最后連接電信號(hào)輸出、顯示和數(shù)據(jù)處理、轉(zhuǎn)化的電子元件系統(tǒng)，在測(cè)量時(shí)可以直接顯示測(cè)得殘留物的含量或濃度值。
本發(fā)明實(shí)施例中連接免疫傳感電極的輸出顯示和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的研制，安裝微型化微分脈沖微電流顯示計(jì)和微型數(shù)據(jù)采集卡組成信號(hào)處理系統(tǒng)；本發(fā)明擬根據(jù)電磁耦合原理對(duì)微電流傳感器進(jìn)行設(shè)計(jì)，主要目的是為了減少外界干擾對(duì)微弱電流傳感器測(cè)試的影響。在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中主要設(shè)計(jì)電磁耦合單元及信號(hào)處理單元。
1)微電流檢測(cè)系統(tǒng)整體設(shè)計(jì)內(nèi)容主要涉及恒電位系統(tǒng)、基底補(bǔ)償、I/V變換、50Hz陷波、低通濾波、電壓放大及輸出等。
2)電磁耦合單元設(shè)計(jì)電磁耦單元的設(shè)計(jì)是微電流型傳感器設(shè)計(jì)的核心，設(shè)計(jì)步驟主要包括以下三個(gè)部分①傳感器磁芯材料的選擇；可選擇高性能、高質(zhì)量的坡莫合金。
②磁芯長(zhǎng)度L及截面積S設(shè)計(jì)在準(zhǔn)確計(jì)算磁芯內(nèi)外徑比的基礎(chǔ)上，確定磁芯平均磁路長(zhǎng)度及線圈匝數(shù)。
③耦合阻抗Z設(shè)計(jì)及二次匝數(shù)設(shè)計(jì)在實(shí)驗(yàn)中可選擇不同的匝數(shù)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，并用不同的定值電阻來測(cè)試電信號(hào)，使理想信號(hào)曲線與實(shí)際測(cè)試曲線吻合。
3)測(cè)量系統(tǒng)的噪聲抑制主要選用低噪聲高輸入阻抗的IC器件，同時(shí)采用金屬膜電阻來降低過量的噪聲。
4)傳感器屏蔽設(shè)計(jì)擬采用2層高導(dǎo)磁鐵材料和坡莫合金多層屏蔽系統(tǒng)，使各層之間互相獨(dú)立，各屏蔽層之間用聚四氟乙烯絕緣。
5)信號(hào)調(diào)理單元設(shè)計(jì)本項(xiàng)目研究擬采用超低噪聲精密放大器，且要求電路板布線規(guī)則，信號(hào)線長(zhǎng)度適宜，走線平直，每級(jí)放大倍數(shù)限制在100倍之內(nèi)， 同時(shí)加覆銅層以提高抗干擾能力。
6)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，擬采用ZF-10型數(shù)據(jù)采集卡對(duì)測(cè)試的電信號(hào)進(jìn)行采集。
7)微電流顯示計(jì)的性能試驗(yàn)主要分析輸出電壓-輸入電流線性關(guān)系和輸出-輸出角差變化關(guān)系。
本發(fā)明實(shí)施例中使用免疫傳感電極的生物傳感器的組裝將免疫傳感換能器、恒電位系統(tǒng)、輸出顯示裝置及單片機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行組裝，研制成檢測(cè)抗生素的便攜式免疫傳感器測(cè)試系統(tǒng)。生物傳感器組裝主要分為硬件組裝及應(yīng)用軟件安裝兩大部分。組裝部件的名稱及要求如下1、檢測(cè)部分主要包括自動(dòng)定時(shí)、數(shù)據(jù)采集、顯示、打印接口等部分，對(duì)恒電位儀的給定電位、保護(hù)電位、輸出電壓、輸出電流等參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量、顯示及打印。
2、控制部分主要為晶閘管型直流穩(wěn)壓電源的恒電位系統(tǒng)、數(shù)模轉(zhuǎn)換器及程序存儲(chǔ)器等關(guān)鍵部件。
3、數(shù)據(jù)采集采用模擬開關(guān)CD4051選送12位A/D芯片ICL7109數(shù)字變量，使讀入的數(shù)據(jù)經(jīng)軟件處理后送LED顯示和打印機(jī)打印。
4、主機(jī)系統(tǒng)檢測(cè)部分采用8031單片機(jī)系統(tǒng)、E2PROM芯片及2864為擴(kuò)展的程序存儲(chǔ)器，8255為擴(kuò)展的I/O接口。
5、應(yīng)用軟件系統(tǒng)包括時(shí)間采集、數(shù)制轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理、顯示及打印程序。
本發(fā)明實(shí)施例中利用免疫傳感電極檢測(cè)氯霉素殘留的方法將氯霉素的單克隆抗體微型化膜(感受器，或分子識(shí)別物)固定于換能器表面，測(cè)定時(shí)在待測(cè)的樣品中加入已知濃度經(jīng)酶標(biāo)記的氯霉素，待測(cè)抗原與標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合電極上的抗體(參見圖3所示)，使經(jīng)洗滌后的傳感電極與底物溶液接觸，標(biāo)記酶催化底物產(chǎn)生氧化電流，再通過連接的電信號(hào)輸出、顯示和數(shù)據(jù)處理、轉(zhuǎn)化的電子元件系統(tǒng)，直接顯示測(cè)得殘留物的含量或濃度值。
1、抗體及抗體膜的制備、電極的修飾、緩沖液的配制及酶標(biāo)抗原的合成與純化等如前述。
2、氯酶素標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備將事先準(zhǔn)備好的0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L的六個(gè)濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品分別取30μL放入6個(gè)1.5mL的小離心管中，并做好標(biāo)記，然后在每個(gè)小離心管中加入30μL的酶標(biāo)抗原，充分混勻，即為檢測(cè)所需的氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
3、抗體測(cè)試膜的制備分別取30μL上述配制好的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品加到不同的抗體酶膜上，密封，37℃條件下，孵育30分鐘，蒸餾水沖洗。
4、準(zhǔn)備10mL葡萄糖底物液。
5、將未貼上抗體酶膜的電極與換能器和輸出顯示系統(tǒng)相連后，在電極上滴加葡萄糖物液，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，進(jìn)至顯示屏上的讀數(shù)穩(wěn)定。
6、用水清洗工作電極，然后將抗體酶膜貼于工作電極上，同樣條件下掃描記錄電流值作為基底值。再次清洗后的工作電極上分別貼上不同的抗體測(cè)試膜，進(jìn)行掃描，記錄得到的電流值。
7、已濃度為橫從標(biāo)，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，利用儀器自帶功能繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
8、樣品中氯霉素的提取，取5mL牛奶與20mL乙酸乙酯混和，震蕩3分鐘，離心10分鐘(15、3000g/m)取4mL上清液至10mL玻璃管中，用氮?dú)庠?0度水浴中吹干，加入1mL異辛烷/三氯甲烷(2∶3)混合液溶解殘?jiān)尤?mL緩沖溶液，充分震蕩混勻，離心10分鐘(6000g/m)，取上層水相50μL備用。
將提取的氯霉素樣品溶液與等體積的酶標(biāo)抗原充分混勻后，加到抗體酶膜上，37℃條件下，孵育30分鐘，蒸餾水沖洗后，貼于工作電極上，與上述條件相同測(cè)量電流值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得出的值即為樣品中所含有的氯霉素濃度。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法，其特征在于，所述免疫傳感電極是貼有氯霉素抗體固定傳感膜的納米修飾印刷電極，所述免疫傳感電極的制作方法如下1)氯霉素單克隆抗體的制備其制備方法為混合酸酐法，將合成的免疫原CAP-BSA與等量福氏完全佐劑乳化后皮下注射，再選擇血清效價(jià)高且特異性好的小鼠作為融合的脾細(xì)胞來源，通過與SP2/O骨髓瘤細(xì)胞融合制備單克隆抗體；2)氯霉素抗體固定膜的制備這是制備整個(gè)傳感器的核心和關(guān)鍵，采用雙酶系統(tǒng)來完成氧化還原反應(yīng)過程中的電子傳遞；即用醋酸纖維素的丙酮溶液為基質(zhì)液，制備成薄膜，用不同濃度的高碘酸鈉、乙二胺和戊二醛處理后，加入步驟1)所述單克隆抗體溶液，并進(jìn)行固定和聚合；3)藥物酶標(biāo)記的制備氯霉素的酶標(biāo)記制備采用重氮化法；4)絲網(wǎng)印刷電極的制作將傳統(tǒng)的較為復(fù)雜的Clerk氧電極改制成絲網(wǎng)印刷電極；5)納米修飾電極的制作通過反向微乳液法制備二茂鐵-SiO2納米粒子并滴加于步驟4)所述印刷電極表面構(gòu)成納米修飾電極；6)免疫傳感器電極(換能器)的制作在所述納米修飾電極貼上抗體傳感膜以完成免疫傳感器電極的制作；7)最后連接電信號(hào)輸出、顯示和數(shù)據(jù)處理、轉(zhuǎn)化的電子元件系統(tǒng)，在測(cè)量時(shí)可以直接顯示測(cè)得殘留物的含量或濃度值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法，其特征是，所述步驟2)氯霉素抗體固定膜的制備中，在抗體傳感膜經(jīng)固定和聚合后，然后測(cè)定微型固定膜中抗體的親和性和重復(fù)性；用絲素膜、聚乙烯碳酸酯膜和清蛋白-多聚甲醛膜法進(jìn)行比較，選擇出靈敏度高、響應(yīng)快、傳質(zhì)好、線性范圍寬的單克隆抗體固定膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法，其特征是，所述步驟3)藥物酶標(biāo)記的制備中，先將氯霉素用鋅粉在稀鹽酸條件下還原成含氨基的衍生物，在溫度為0℃及pH為1.0-2.0條件下加入適量的亞硝酸鈉使上述衍生物形成重氮化結(jié)構(gòu)；再次調(diào)節(jié)合適的pH后，同相應(yīng)濃度的酶進(jìn)行偶聯(lián)；用透析及層析(Sephadex-G50)程序純化合成產(chǎn)物，以紫外掃描法測(cè)定合成產(chǎn)物中氯霉素與酶蛋白的結(jié)合比。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法，其特征是，所述步驟4)絲網(wǎng)印刷電極的制作中，基底材料選用PVC片，在其上再貼上一塊已刻制好電極形狀的粘性塑料薄膜，用反復(fù)銀鏡法沉淀出均勻的導(dǎo)電底層，每次反應(yīng)后再用三蒸水充分洗凈以保證銀膜具有足夠的厚度及牢度；也可以直接用絲網(wǎng)印刷工藝來完成導(dǎo)電底層的制作；鍍銀完成后剝離粘性塑料薄膜，在其上覆蓋硅酮膠覆蓋此銀膜以絕緣，保留兩個(gè)端部，一端作為接線端，在另一端印刷上由石墨粉、醋酸纖維素、丙酮、環(huán)己酮調(diào)制成的電極漿液，待溶劑揮發(fā)干燥后作為工作電極，然后分別用Ag/AgCl導(dǎo)電液印制參比電極；以噴鍍法制作超薄的鉑片對(duì)電極。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法，其特征是，所述步驟5)納米修飾電極的制作中，先采用Emmanuel的反向微乳液法制備二茂鐵---SiO2納米粒子，即將適量的環(huán)己烷、正己醇和聚乙二醇辛基苯基醚混合攪拌均勻，加入二茂鐵及水溶液后再繼續(xù)攪拌成穩(wěn)定的水包油體系；在正硅酸四乙酯及氨水存在的條件下充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)后，用丙酮分離出納米顆粒，并分散在PBS溶液中，在修飾電極前加入殼聚糖溶液并超聲混勻，吸取適量的上述納米混懸液滴涂于4)所述印刷電極表面，制成納米修飾電極。
6.一種使用權(quán)利要求1所述的免疫傳感電極組裝的生物傳感器，包括一檢測(cè)部分包括自動(dòng)定時(shí)、數(shù)據(jù)采集、顯示、打印接口等部分，對(duì)恒電位儀的給定電位、保護(hù)電位、輸出電壓、輸出電流等參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量、顯示及打??；一控制部分為晶閘管型直流穩(wěn)壓電源的恒電位系統(tǒng)、數(shù)模轉(zhuǎn)換器及程序存儲(chǔ)器等關(guān)鍵部件；一數(shù)據(jù)采集采用模擬開關(guān)選送A/D芯片及IC數(shù)字變量，使讀入的數(shù)據(jù)經(jīng)軟件處理后送LED顯示和打印機(jī)打??；一主機(jī)系統(tǒng)檢測(cè)部分采用單片機(jī)系統(tǒng)、E2PROM芯片、擴(kuò)展的程序存儲(chǔ)器以及擴(kuò)展的I/O接口；一應(yīng)用軟件系統(tǒng)包括時(shí)間采集、數(shù)制轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理、顯示及打印程序；其特征在于，還包括一免疫傳感電極以及連接所述免疫傳感電極的輸出顯示和微型化微分脈沖微電流顯示計(jì)和微型數(shù)據(jù)采集卡組成的信號(hào)處理系統(tǒng)。
7.一種用權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法，其特征在于，1)將氯霉素的單克隆抗體微型化膜固定于換能器表面；2)測(cè)定時(shí)在待測(cè)的樣品中加入已知濃度經(jīng)酶標(biāo)記的氯霉素，待測(cè)抗原與標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合電極上的抗體，使經(jīng)洗滌后的傳感電極與底物溶液接觸，標(biāo)記酶催化底物產(chǎn)生氧化電流；3)通過連接的電信號(hào)輸出、顯示和數(shù)據(jù)處理、轉(zhuǎn)化的電子元件系統(tǒng)，直接顯示測(cè)得殘留物的含量或濃度值。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于檢測(cè)氯霉素殘留的免疫傳感電極的制作方法，涉及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域；其特征在于，所述免疫傳感電極是貼有氯霉素抗體固定傳感膜的納米修飾印刷電極，所述免疫傳感電極的制作方法如下1)氯霉素單克隆抗體的制備；2)氯霉素抗體固定膜的制備；3)藥物酶標(biāo)記的制備；4)絲網(wǎng)印刷電極的制作；5)納米修飾電極的制作；6)免疫傳感器電極的制作；7)最后連接電信號(hào)輸出、顯示和數(shù)據(jù)處理、轉(zhuǎn)化的電子元件系統(tǒng)，在測(cè)量時(shí)可以直接顯示測(cè)得殘留物的含量或濃度值；使用所述免疫傳感電極的生物傳感器檢測(cè)精確、靈敏、價(jià)廉、響應(yīng)和檢測(cè)迅速、選擇性好、操作簡(jiǎn)單、攜帶方便、能重復(fù)利用并能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和在線檢測(cè)氯霉素殘留的。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1967228SQ20051011054
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2005年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月18日
發(fā)明者柴春彥, 劉國艷, 陳永輝 申請(qǐng)人:上海環(huán)軒信息技術(shù)有限公司, 柴春彥