專利名稱：一種用于氯霉素快速檢測(cè)的直接包被elisa方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氯霉素的ELISA快速檢測(cè)方法，特別涉及直接包被ELISA檢測(cè)方法，屬于檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，建立的直接包被ELISA檢測(cè)方法可以用于研制氯霉素免疫速測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
氯霉素(chloramphenicol,CAP)是一種常見(jiàn)的廣譜抗菌藥,1947年首次從鏈絲菌(Streptomyces Venezuela)培養(yǎng)液中提取得到,是第一個(gè)人工合成的抗生素。氯霉素在高濃度時(shí)有很好的殺菌作用，在低濃度時(shí)能抑制多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)，所以臨床上廣泛使用。對(duì)其敏感的細(xì)菌有布氏桿菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、流感桿菌、產(chǎn)氣桿菌、傷寒桿菌、胎孤菌、沙門(mén)氏菌、克雷伯氏桿菌等。氯霉素還能對(duì)部分衣原體、立克次氏體有作用。隨著氯霉素應(yīng)用的增加以及科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，氯霉素被證明對(duì)機(jī)體有非常大的毒副作用，如遺傳毒性，生殖毒性，骨髓造血機(jī)能抑制毒性，神經(jīng)毒性，灰嬰綜合癥。此外，長(zhǎng)期微量攝入氯霉素不僅使大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等產(chǎn)生抗藥性，而且還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體正常菌群失調(diào)，使人們易患各種疾?。坏?，氯霉素在動(dòng)物性食品中的殘留是通過(guò)水產(chǎn)品、肉制品、奶、蛋等作用于人類，使人們的健康在不易察覺(jué)中受到威脅。針對(duì)這一情況，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和許多國(guó)家規(guī)定限制或禁止氯霉素用于食品動(dòng)物，中國(guó)農(nóng)業(yè)部已將氯霉素從2000年版《中國(guó)獸藥典》中刪除并列為禁藥。而歐盟的進(jìn)口食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)是:在進(jìn)口動(dòng)物產(chǎn)品中不得檢出氯霉素，其“不得檢出”的含義是氯霉素含量在iyg kg—1以下，即含量在十億分之一以下。2002年歐盟對(duì)我國(guó)出口到歐盟的動(dòng)物源性產(chǎn)品實(shí)行禁運(yùn)，就意味著我國(guó)將在歐盟市場(chǎng)丟掉13萬(wàn)噸的市場(chǎng)份額和造成6億多美元的經(jīng)濟(jì)損失。并且由于歐盟的禁令，美國(guó)和日本等國(guó)已高度關(guān)注我國(guó)出口水產(chǎn)品的質(zhì)量。因此動(dòng)物性食品中氯霉素的殘留量分析，尤其是快速、準(zhǔn)確、高靈敏度的檢測(cè)方法，近年來(lái)得到國(guó)內(nèi)外食品分析工作者的高度關(guān)注。目前氯霉素殘留檢測(cè)的方法主要有微生物學(xué)方法、色譜分析方法和免疫學(xué)方法。微生物法耗時(shí)長(zhǎng)、重復(fù)性差、靈敏度低；色譜法需要昂貴的儀器，對(duì)技術(shù)人員要求高，樣品前處理煩瑣，成本高，分析速度慢，很難達(dá)到快速、簡(jiǎn)便和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求，更難以適應(yīng)大量復(fù)雜樣品的檢測(cè)。而免疫分析方法，尤其是ELISA技術(shù)，不僅具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析容量大等優(yōu)點(diǎn)，而且它對(duì)使用人員的技術(shù)要求不高也不需要貴重儀器設(shè)備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種直接包被ELISA方法用于氯霉素的快速檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:一種用于氯霉素快速檢測(cè)直接包被ELISA方法，具體步驟如下:1.氨基化氯霉素的合成
稱取氯霉素64.6mg溶于700 μ L無(wú)水乙醇中，緩慢加入29.2mg鋅粉，磁力攪拌器上加熱反應(yīng)40min。反應(yīng)結(jié)束后12000rpm/min離心5min除去不溶物。采用液液萃取法對(duì)
氨基化氯霉素進(jìn)行純化。2.氨基化氯霉素的直接偶聯(lián)微孔板使用0.0lmol Γ1，pH9.6碳酸鹽緩沖液將戊二醛(GA)稀釋成6%，加入到中度吸附微孔板中，每孔200 μ L，37°C孵育2h。洗滌液(PBST)洗滌3次。用PBS緩沖液(80mmolL—1，pH8.0)將25nM氨基化氯霉素稀釋成適當(dāng)濃度加入到微孔板中，37°C孵育2h。PBST洗滌后，加0.5%氨基乙酸溶液，37°C孵育lh。洗滌后干燥保存。3.直接包被ELISA方法的建立在偶聯(lián)好氨基化氯霉素的酶標(biāo)板中，加入用含0.1 % BSA的PBS稀釋的50 μ L生物素化一抗和一系列濃度(0,0.02,0.1,1,10,25,50, IOOngmr1)的氯霉素，37°C孵育1.5h，PBST洗滌四次后，每孔加入100 μ L SA-HRP, 37°C孵育45min。PBST洗滌6次，每孔加100 μ L底物顯色液，37°C孵育IOmin后每孔中加50 μ L 2mol Γ1 H2SO4終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。本發(fā)明的有益效果:基于氨基化小分子半抗原直接偶聯(lián)技術(shù)以及生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)建立了直接包被ELISA用于氯霉素檢測(cè)具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性，與傳統(tǒng)包被完全抗原的ELISA 方法相比，方法更簡(jiǎn)單快速。


圖1氨基化氯霉素直接偶聯(lián)聚苯乙烯微孔板示意2常規(guī)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線3直接包被ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試劑與材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從常規(guī)試劑公司購(gòu)買(mǎi)得到。實(shí)施例1，直接包被ELISA檢測(cè)方法的建立1.氨基化氯霉素的直接偶聯(lián)微孔板使用0.0lmol L—1，ρΗ9.6碳酸鹽緩沖液將戊二醛(GA)稀釋成6%的溶液，加入到中度吸附微孔板中，每孔200μ L，37°C孵育2h。洗滌液(PBST)洗滌3次。用PBS緩沖液(80mmol Γ',ρΗδ.0)將氨基化氯霉素稀釋成25nmol L—1加入到微孔板中，37°C孵育21UPBST洗滌后，加一定濃度的封閉溶液，37°C孵育lh。洗滌后干燥保存。2.直接包被ELISA方法的建立在偶聯(lián)好氨基化氯霉素的酶標(biāo)板中，加入50 μ L生物素化一抗和一系列濃度(0，
0.02,0.1,1,10,25,50, IOOng ι Γ1)的氯霉素，37°C孵育1.5h, PBST洗滌四次后，每孔加入100 μ L羊抗小鼠二抗，37°C孵育45min。PBST洗滌6次，每孔加100 μ L底物顯色液，37°C孵育IOmin后每孔中加50 μ L 2mol L4H2SO4終止反應(yīng)后,用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。實(shí)施例2直接包被ELISA方法的評(píng)估
一.靈敏度1.常規(guī)ELISA包被方法0.05mol Γ'ρΗΘ.6碳酸鹽緩沖液將氯霉素-OVA偶聯(lián)物稀釋到適當(dāng)濃度加入到微孔板內(nèi)，每孔100uL4°C反應(yīng)過(guò)夜。傾去包被液,滅菌水洗一次。每孔加入150yL 1% OVA,37V反應(yīng)1.5小時(shí)，除去封閉液。3.常規(guī)ELISA與直接包被ELISA檢測(cè)氯霉素分析方法的建立在固定好羧基化氯霉素或全抗原的酶標(biāo)板中，加入50 μ L生物素標(biāo)記的氯霉素抗體或氯霉素抗體和一系列濃度(0,0.025，0.12，0.6，3.2，16，80，400，2000，10000，50000ngmL—1)氯霉素小分子，37°C孵育1.5h，PBST洗滌四次后，每孔加入100 μ L SA-HRP或羊抗小鼠二抗，37°C反應(yīng)45分鐘。PBST洗滌6次，每孔加100 μ L底物顯色液，37°C孵育10分鐘后每孔中加50 μ L 2mol L—1 H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。根據(jù)下述公式求出ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制率: B/BO (% ) = (A-Aex) / (AO-Aex) X 100其中A:有競(jìng)爭(zhēng)抗原存在時(shí)的吸光值；A0:競(jìng)爭(zhēng)抗原為零時(shí)的吸光值;Aex:競(jìng)爭(zhēng)抗原過(guò)量時(shí)的吸光值。以抑制率為縱坐標(biāo)，氯霉素濃度(C)對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)作圖，建立回歸方程I = BLogC+A。根據(jù)回歸方程計(jì)算出抑制率10%和50%所需氯霉素濃度，即ICltl和IC5(I，以IClO為方法的檢測(cè)下限。檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2，3所示。二.實(shí)際樣品添加回收試驗(yàn)與方法比對(duì)選用蝦仁樣品，樣品前處理方法如下:
(I)免疫分析樣品的前處理準(zhǔn)確稱取2g勻漿處理后的蝦仁樣品，加入4mL乙酸乙酯，室溫下劇烈震搖20min,6000rpm/min離心lOmin。將上清液用氮?dú)獯蹈?加入ImL異辛烷/氯仿混合液(3: 2,v/v)以及ImL PBS (0.0lmol ΛρΗ 7.4)溶解，混合液振蕩lmin，3000rpm/min離心IOmin,取上清液直接用于酶聯(lián)免疫分析。⑵HPLC方法的樣品前處理準(zhǔn)確稱取2g勻漿處理的蝦仁，加入4mL乙酸乙酯室溫下振蕩20min,6000rpm/min離心IOmin,取上清液用氮?dú)獯蹈桑腆w殘洛使用2mL色譜純甲醇溶解用于HPLC分析。在不含氯霉素空白樣品中添加一系列氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(5，50，100μ g kg—1)，用于氨基化小分子半抗原直接偶聯(lián)ELISA和傳統(tǒng)ELISA分析。表I三種方法檢測(cè)蝦仁中氯霉素殘留的結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一種用于氯霉素快速檢測(cè)直接包被ELISA方法，具體步驟如下 (1)氨基化氯霉素的合成 稱取氯霉素64.6mg溶于700 μ L無(wú)水乙醇中，緩慢加入29.2mg鋅粉，磁力攪拌器上加熱反應(yīng)40min ;反應(yīng)結(jié)束后12000rpm/min離心5min除去不溶物；采用液液萃取法對(duì)氨基化氯霉素進(jìn)行純化； (2)氨基化氯霉素的直接偶聯(lián)微孔板 使用0.0lmol L—1，pH9.6碳酸鹽緩沖液將戊二醛(GA)稀釋成6%，加入到中度吸附微孔板中，每孔200μ L，37°C孵育2h ;洗滌液(PBST)洗滌3次；用PBS緩沖液(80mmol L-1，pH8.0)將25nM氨基化氯霉素稀釋成適當(dāng)濃度加入到微孔板中，37°C孵育2h ;PBST洗滌后，加0.5%氨基乙酸 溶液，37°C孵育Ih ;洗滌后干燥保存； (3)直接包被ELISA方法的建立 在偶聯(lián)好氨基化氯霉素的酶標(biāo)板中，加入用含0.1 % BSA的PBS稀釋的50 μ L生物素化一抗和一系列濃度(0,0.02,0.1,1,10,25,50, IOOng ι Γ1)的氯霉素，37°C孵育 1.5h, PBST洗滌四次后，每孔加入100 μ L SA-HRP, 37°C孵育45min ;PBST洗滌6次，每孔加100 μ L底物顯色液，37°C孵育IOmin后每孔中加50 μ L 2mol IZ1H2SO4終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種氯霉素的快速檢測(cè)方法，屬于檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明利用戊二醛對(duì)聚苯乙烯微孔板進(jìn)行處理，在微孔板表面產(chǎn)生帶有醛基基團(tuán)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過(guò)醛基與氨基化氯霉素的氨基反應(yīng)，從而將氨基化小分子半抗原直接偶聯(lián)到微孔板表面，基于氨基化小分子半抗原直接偶聯(lián)技術(shù)以及生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)建立了一種新型的氯霉素快速檢測(cè)ELISA。該方法不僅可以避免小分子半抗原與大分子蛋白偶聯(lián)的繁瑣過(guò)程，而且其靈敏度比傳統(tǒng)ELISA靈敏度提高了近20倍。氨基化小分子半抗原直接偶聯(lián)ELISA方法在農(nóng)藥、獸藥殘留的檢測(cè)應(yīng)用中具有很大的潛力，可以用于快速檢測(cè)試劑盒的研制。
文檔編號(hào)G01N33/543GK103175955SQ20111044057
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者高志賢, 白家磊, 寧保安, 彭媛, 于廣貴, 柳明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所