專利名稱：生物功能化熒光磁性納米粒子及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬納米材料領(lǐng)域，更具體地，是涉及應(yīng)用于生物領(lǐng)域的納米材料。
背景技術(shù)：
生物功能化材料一直是材料研究學(xué)領(lǐng)域的熱門領(lǐng)域，在生物功能化材料中，納米材料自從上個世紀(jì)80年代以來由于其特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，越來越收到科學(xué)家的重視，因而利用納米技術(shù)研究和解決生物領(lǐng)域的重大問題也成為重要的前沿研究領(lǐng)域之一。
有機熒光物質(zhì)是經(jīng)典的熒光物質(zhì)，雖然有機熒光物質(zhì)由于其固有的性質(zhì)有其缺點，如熒光效率問題等等，但作為經(jīng)典的熒光物質(zhì)相對于目前的無機熒光物質(zhì)仍有其廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域，如應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)，應(yīng)用于抗體標(biāo)記等等。
磁性材料的性質(zhì)早已為大家熟悉，利用磁性材料的有點將其應(yīng)用于生物領(lǐng)域也早有實踐，如利用磁性材料的性質(zhì)，應(yīng)用于細(xì)胞分離，核磁共振成像等等。
然而將有機熒光材料和磁性材料結(jié)合起來作為功能化材料應(yīng)用于生物領(lǐng)域卻沒有較多的深入研究。國外有研究將此類型的熒光材料通過化學(xué)的方法修飾在納米材料的表面，然而將熒光物質(zhì)和納米材料同時包裹于納米材料之內(nèi)卻沒有相關(guān)的報道，更沒有將熒光物質(zhì)和磁性材料同時包裹于納米粒子之內(nèi)，再通過納米粒子的表面功能化，使之可以應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域的研究。因而，制備和應(yīng)用生物功能化的熒光磁性納米粒子有著重要的研究價值。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種生物功能化熒光磁性納米粒子及其制備方法和應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)中熒光物質(zhì)僅修飾于納米材料表面，無法使納米材料同時具備生物功能的缺陷。
技術(shù)方案本發(fā)明的內(nèi)容之一是提供一種生物功能化的熒光磁性納米粒子，具備內(nèi)核和外殼的核殼型結(jié)構(gòu)，包括如下的結(jié)構(gòu)特點(1)內(nèi)核層中含熒光物質(zhì)和磁性物質(zhì)；(2)外殼層由熒光通透物質(zhì)構(gòu)成；(3)外殼層表面為有機官能團的修飾層。
上述的生物功能化熒光磁性納米粒子的一種優(yōu)選方案為，所說的有機官能團為氨基、羧基或者巰基，或者其組合。
上述的生物功能化熒光磁性納米粒子的另一種優(yōu)選方案為，所說的熒光物質(zhì)為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明，藻紅蛋白或者其組合，較佳地選擇異硫氰酸熒光素FITC。
上述的生物功能化熒光磁性納米粒子的又一種優(yōu)選方案為，所說的磁性物質(zhì)為鐵、鎳、鐵的氧化物或鎳鐵合金，或者其組合。
所述內(nèi)核層的內(nèi)核成分可以含有鐵、鐵的氧化物、鐵與其他金屬的合金，較佳地選自鐵的氧化物、鐵、鎳、鎳-鐵合金、或其組合，更佳地為鐵的氧化物。
上述的生物功能化熒光磁性納米粒子的另一種優(yōu)選方案為，所說的外殼層成分為二氧化硅、瓊脂糖、烯烴聚合物、聚丙烯腈或環(huán)氧化合物，或者其組合。
具體地，所述外殼層成分可以是無機包裹層，例如氨基硅烷、巰基硅烷，還可以是有機包裹層，例如糖苷、蛋白質(zhì)等。無機包裹層優(yōu)選氨基硅烷，有機包裹層優(yōu)選糖苷。較佳地，其成分選自二氧化硅、瓊脂糖、烯烴聚合物、聚丙烯腈、環(huán)氧化合物、或其組合；更佳地，所述內(nèi)核層的外殼成分是二氧化硅。
本發(fā)明的內(nèi)容之二是提供一種制備所說的生物功能化熒光磁性納米粒子的方法，包括如下步驟(1)在含有磁性納米粒子和熒光物質(zhì)以及外殼層形成劑的微乳液體系中，通過油包水型反相微乳液法，形成核殼型納米粒子；(2)使用修飾劑對步驟(1)所說的的核殼型磁性納米粒子表面進行修飾，得到表面修飾有氨基、羧基或者巰基、或者其組合的生物功能化熒光磁性納米粒子；其中，所說的修飾劑為硅烷類修飾劑，優(yōu)選如[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]、巰基乙酸、巰基丙酸或3-巰基丙基三甲氧基硅烷，或者其組合。
對于選定的外殼成分，可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)選用合適的外殼層形成劑。例如當(dāng)外殼成分為二氧化硅時，可選用正硅酸乙酯或其它合適的外殼層形成劑。
上述的生物功能化熒光磁性納米粒子制備方法的一種優(yōu)選方案為，所說的微乳液體系中含有TritonX-100、正己醇、環(huán)己烷按，其體積比為1∶1～3∶4～6。
本發(fā)明的內(nèi)容之二是提供上述的生物功能化熒光磁性納米粒子的應(yīng)用，所說的有機化官能團通過化學(xué)鍵與核酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸或者其衍生物結(jié)合。
上述的生物功能化熒光磁性納米粒子的另一種應(yīng)用為，所說的有機化官能團與動植物細(xì)胞或者亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或者病毒顆粒結(jié)合。
有益效果1、本發(fā)明的生物功能化熒光磁性納米粒子與現(xiàn)有技術(shù)中熒光物質(zhì)僅修飾于納米材料表面相比，可以使納米材料不但具備磁性能夠方便地進行分離、以及具備熒光標(biāo)記能夠方便地指示的性能之外，還具備有機官能團，通過化學(xué)鍵與核酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸或者其衍生物結(jié)合，乃至與動植物細(xì)胞或者亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或者病毒顆粒結(jié)合的生物應(yīng)用功能。
2、本發(fā)明的生物功能化熒光磁性納米粒子其外殼層采用二氧化硅、瓊脂糖等無毒、具有生物相容性的材料，使應(yīng)用于生物化學(xué)領(lǐng)域成為可能。
3、本發(fā)明的制備方法采用成本低廉的有機熒光物質(zhì)、磁性材料、外殼形成劑等，使得實際大規(guī)模生產(chǎn)具有可行性。
4、采用納米顆粒包裹熒光物質(zhì)、磁性物質(zhì)和生物功能基團，可以有效的發(fā)揮納米材料的表面積優(yōu)勢，提高生物反應(yīng)的效率、加快反應(yīng)時間，同時減小反應(yīng)體系的總量，使得進行微量檢測和微量反應(yīng)簡便易行。
5、生物功能化的納米粒子對于納米水平上的生物材料的理化性質(zhì)的研究提供了基礎(chǔ)，同時進一步提供了擴大應(yīng)用的可能性。
6、在本發(fā)明的納米粒子上連接核酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸、抗體、多肽、動植物細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、病毒、細(xì)菌等等，可以廣泛應(yīng)用于各類疾病的檢測和治療。
如本文所用，術(shù)語“反相微乳液法”指微乳液法是利用兩種互補相溶的溶劑在表面活性劑的作用下形成一個均勻的乳液，從乳液中析出固體，這樣可使成核、成長、聚結(jié)和團聚等過程局限在一個微小的球形液滴內(nèi)，從而形成球形顆粒。微乳液通常由表面活性劑、助表面活性劑(通常為醇類)、油(通常為碳?xì)浠衔?和水(或電解質(zhì)的水溶液)組成的透明的各向同性的熱力學(xué)穩(wěn)定性體系。其中反相微乳液是指油包水(W/O)型乳液，即水相分散在油相而形成微小的不連續(xù)的“水池”，其大小可控制在幾十到幾百個埃之間。納米粒子的微乳液制備方法正是利用微乳液的“水池”作為“微反應(yīng)器”，從而達(dá)到控制納米粒子的粒徑和形狀。
如本文所用，術(shù)語“官能團”指在化合物中決定化合物性質(zhì)的原子和原子團叫做官能團。在本文中如在熒光磁性納米粒子表面修飾的氨基，羧基以及巰基都是官能團。


圖1是二氧化硅包裹的熒光磁性納米粒子的透射電子顯微鏡照片。從圖中可以看出，包裹了熒光物質(zhì)和磁性納米材料的粒子具有很規(guī)則的形態(tài)，具有較好的單分散性，表明二氧化硅已經(jīng)很好的將磁性材料和熒光物質(zhì)包裹于其中。
圖2是二氧化硅包裹的熒光磁性納米粒子的熒光顯微鏡照片。圖中可以看出，包裹熒光物質(zhì)納米粒子具有很好的熒光性質(zhì)，同時也進一步證明二氧化硅已經(jīng)成功地將熒光物質(zhì)包裹于其中。
圖3是表面氨基功能化的熒光磁性納米粒子的紅外圖譜。從圖譜中可以看出，氨基的紅外峰在圖譜中顯示出來，表明氨基官能團已經(jīng)成功地修飾在納米粒子的表面。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如化工產(chǎn)品手冊，或按照制造廠商所建議的條件。所有無機化學(xué)試劑和有機溶劑購自上?；瘜W(xué)試劑廠，異硫氰酸熒光素、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、巰基乙酸、巰基丙酸、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明，藻紅蛋白3-巰基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)購自Sigma公司。
實施例一磁性納米粒子的內(nèi)核層的制備方法采用改進的化學(xué)共沉淀制備磁性粒子的內(nèi)核層，具體方法如下用二次蒸餾水分別配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的混合溶液及NaOH溶液。在鐵鹽的混合溶液中Fe2+離子的濃度為0.1～0.2mol/L，F(xiàn)e3+離子的濃度為0.1～0.3mol/L，NaOH溶液的濃度為2～3mol/L。在劇烈攪拌下將體積為混合鹽溶液體積一半的NaOH溶液緩慢地滴加到混合鹽溶液中。將所得到的固體沉淀在40℃～60℃陳化12h，用二次蒸餾水將沉淀物清洗數(shù)次，過濾后再在40℃～80℃的條件下干燥24h，在瑪瑙研缽中研磨后即得產(chǎn)物。
實施例二核殼型熒光磁性納米粒子的制備方法一將TritonX-100、正己醇、環(huán)己烷按1∶2∶5的比例均勻混合，形成透明穩(wěn)定的微乳液體系。將上述微乳液體系置于超聲波中處理30～60分鐘，向其中加入熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素FITC 0.5mg，再向其中加入0.5g的γ-Fe2O3，用超聲波處理6分鐘后取出上層液倒入三頸燒瓶中，攪拌30分鐘使之均勻。取1mL一定濃度的濃氨水用2mL二次蒸餾水稀釋，30分鐘后將其緩慢加入到不斷攪拌的微乳液中，持續(xù)攪拌30分鐘使氨水均勻分散在微乳液中。1小時后，向微乳液中滴加1～3mL的正硅酸乙酯，同時不斷地攪拌10小時，并將體系的溫度保持在15～30℃之間。向體系中加入丙酮使粒子沉淀，或者將體系靜置過夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。在真空的條件下干燥粒子樣品。從圖1中我們可以看出二氧化硅已經(jīng)很好地將熒光物質(zhì)和磁性納米粒子包裹在其中。
實施例三核殼型熒光磁性納米粒子的制備方法二將異丙醇和水按照5∶1的比例均勻混合，超聲5min。稱取0.1-0.8mg的熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素FITC、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、或者藻紅蛋白之中的一種，配置成水溶液。再稱量約1.0g的γ-Fe2O3加入到上述配制的溶液體系中，超聲處理10min。取上層清夜倒入三頸燒瓶中，不斷攪拌使其保持分散狀態(tài)。取1mL一定濃度的濃氨水，將其緩慢加入到不斷攪拌的溶液體系中。接著取1～3mL的正硅酸乙酯，同樣將其緩慢加入到不斷攪拌的溶液體系中。體系在室溫的條件下反應(yīng)3-5個小時。將反應(yīng)產(chǎn)物倒出，用二次蒸餾水洗滌粒子3-5次。清洗后的粒子在20-50℃的溫度下真空干燥5小時，收集粒子備用。從圖1中我們可以看出二氧化硅已經(jīng)很好地將熒光物質(zhì)和磁性納米粒子包裹在其中。
實施例四生物功能化熒光磁性納米粒子的制備一取20mg實施例2或3中制得的熒光磁性納米粒子，加入30-50mL的甲醇和丙三醇按5∶3比例組成的混合液中，用超聲波處理20～60分鐘；稱取1-3mLAEAPS[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]，用超聲波處理10～60分鐘；將這兩種溶液混合均勻，在60℃的條件下反應(yīng)5小時，然后取出粒子并用甲醇清洗3次，接著在40～80℃真空干燥2小時，收集粒子得到表面修飾有氨基的生物功能化的熒光磁性納米粒子。從圖3的紅外表征圖譜中可以看出，氨基已經(jīng)被修飾到磁性納米粒子的表面。
實施例五生物功能化熒光磁性納米粒子的制備二取實施例2或3中制得的熒光磁性納米粒子加入到乙酸乙醇緩沖液中(pH＝4.5)，超聲混和均勻；同時，將一定量3-巰基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)加入到另一乙酸乙醇緩沖液中。混合上述兩種溶液，在25℃的情況下反應(yīng)1h后，取出粒子，用乙酸乙醇的緩沖液(pH＝4.5)清洗三次后，在60℃時真空干燥2h，收集表粒子得到表明修飾有巰基的生物功能化熒光磁性納米粒子。
實施例六生物功能化熒光磁性納米粒子的制備三取實施例2或3中制得的熒光磁性納米粒子加入到組成為乙酸乙醇的緩沖溶液中(pH＝4.5)，超聲混合均勻；3-巰基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)加入到同樣的緩沖溶液中。將兩種緩沖溶液混合，在一定的溫度條件下反應(yīng)2-4個小時，磁性分離粒子，用同樣的緩沖溶液洗滌三次后，在60℃下真空干燥，收集粒子。
將收集的粒子分散于同樣的緩沖溶液中，向溶液體系中加入巰基乙酸，將溶液分散均勻，體系在常溫下反應(yīng)2-4個小時后，磁性收集粒子，洗滌數(shù)遍后真空干燥，得到表面修飾羧基的生物功能化的熒光磁性納米粒子。
實施例七生物功能化磁性納米粒子的生物應(yīng)用之一取1-3mg如實施例4制備的表面修飾氨基的生物功能化熒光磁性納米粒子，加入到pH為7.0-8.0的磷酸鹽緩沖體系中，加入用量為50-200μL交聯(lián)劑(戊二醛)，形成混合溶液。所述的混合溶液用超聲波處理10-30分鐘。然后用磷酸鹽緩沖液洗滌2-3次。
取約3微克的單克隆抗體，加入到含約2mL的上述粒子的混合溶液中。在2-10℃的反應(yīng)溫度下反應(yīng)3小時，從而將抗體上的氨基與外殼層上的氨基在固定劑的作用下進行反應(yīng)，使抗體通過Schiff Bond(席夫鍵)直接連接于外殼層。反應(yīng)結(jié)束后，磁性分離出所述的粒子，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。這樣得到的修飾有單克隆抗體的熒光磁性納米粒子置于磷酸鹽緩沖液中保存，可以用于生物學(xué)中的細(xì)菌細(xì)胞分離和實時監(jiān)測。
實施例八生物功能化磁性納米粒子的生物應(yīng)用二取一定量已修飾好過硫鍵的寡聚脫氧核苷酸oligoDNA片斷，加入到500μL的NaHCO3和Na2CO3的緩沖液(pH＝8.5)中，混合均勻；取少量的上述實施例5中制備的表面修飾巰基的熒光磁性納米粒子加入到上述寡聚脫氧核苷酸溶液中，均勻分散，在一定濕度，25℃的情況下反應(yīng)24h。分離清洗粒子并在50℃的條件下真空干燥10h，得到oligoDNA修飾的熒光磁性納米粒子，該功能化的熒光磁性納米粒子可以用于目標(biāo)DNA的分離和DNA雜交過程的實時監(jiān)測。
實施例九生物功能化磁性納米粒子的生物應(yīng)用三取一定量上述實施例6中制備的已修飾好羧基的生物功能化熒光磁性納米粒子，加入到pH為7.0-8.0的磷酸鹽緩沖體系中，形成混合溶液。所述的混合溶液用超聲波處理10-30分鐘。
取約10微克量的煙草花葉病毒顆粒，加入到含約2mL的上述粒子的混合溶液中。在2-10℃的反應(yīng)溫度下反應(yīng)3小時，從而將病毒外殼上的氨基與外殼層上的羧基在固定劑的作用下進行反應(yīng)，并直接連接于外殼層。反應(yīng)結(jié)束后，磁性分離出所述的粒子，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。這樣得到的連接有煙草花葉病毒的熒光磁性納米粒子置于磷酸鹽緩沖液中保存，可以用于植物病毒學(xué)中的病毒感染示蹤和實時監(jiān)測。
權(quán)利要求
1.一種生物功能化熒光磁性納米粒子，具備內(nèi)核和外殼的核殼型結(jié)構(gòu)，包括如下的結(jié)構(gòu)特點(1)內(nèi)核層中含熒光物質(zhì)和磁性物質(zhì)；(2)外殼層由熒光通透物質(zhì)構(gòu)成；(3)外殼層表面為有機官能團的修飾層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物功能化熒光磁性納米粒子，其特征在于，所說的有機官能團為氨基、羧基或者巰基，或者其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物功能化熒光磁性納米粒子，其特征在于，所說的熒光物質(zhì)為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、或藻紅蛋白，或者其組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物功能化熒光磁性納米粒子，其特征在于，所說的磁性物質(zhì)為鐵、鎳、鐵的氧化物或鎳鐵合金，或者其組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物功能化熒光磁性納米粒子，其特征在于，所說的外殼層成分為二氧化硅、瓊脂糖、烯烴聚合物、聚丙烯腈或環(huán)氧化合物，或者其組合。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的生物功能化熒光磁性納米粒子的方法，包括如下步驟(1)在含有磁性納米粒子和熒光物質(zhì)以及外殼層形成劑的微乳液體系中，通過油包水型反相微乳液法，形成核殼型納米粒子；(2)使用修飾劑對步驟(1)所說的核殼型磁性納米粒子表面進行修飾，得到表面修飾有氨基、羧基或者巰基、或者其組合的生物功能化熒光磁性納米粒子；其中，所說的修飾劑為硅烷類修飾劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物功能化熒光磁性納米粒子的制備方法，其特征在于，所說的硅烷類修飾劑為[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷]、巰基乙酸、巰基丙酸或3-巰基丙基三甲氧基硅烷，或者其組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物功能化熒光磁性納米粒子的制備方法，其特征在于，所說的微乳液體系中含有TritonX-100、正己醇、環(huán)己烷按，其體積比為1∶1～3∶4～6。
9.權(quán)利要求1所述的生物功能化熒光磁性納米粒子的應(yīng)用，其特征在于，所說的有機化官能團通過化學(xué)鍵與核酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸或者其衍生物結(jié)合。
10.權(quán)利要求1所述的生物功能化熒光磁性納米粒子的應(yīng)用，其特征在于，所說的有機化官能團與動植物細(xì)胞或者亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或者病毒顆粒結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物功能化熒光磁性納米粒子及其制備方法和應(yīng)用。該粒子具備核殼型結(jié)構(gòu)，包括內(nèi)核層中的熒光物質(zhì)和磁性物質(zhì)；由熒光通透物質(zhì)構(gòu)成的外殼層；和外殼層表面有機官能團的修飾層。通過反相微乳液法可合成具有熒光和磁性雙重功能的納米粒子，繼而在其表面進行化學(xué)修飾使其成為生物功能化磁性納米粒子。該納米粒子可以用于生物標(biāo)記、生物成像和生物分離等。
文檔編號G01N33/569GK1967248SQ200510110380
公開日2007年5月23日 申請日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日
發(fā)明者沈鶴柏, 周麗佳, 陳偉, 朱龍章 申請人:上海師范大學(xué)