專利名稱：一種微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，具體地說是一種微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞計(jì)數(shù)是細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)基本技術(shù)，它是了解培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，繪制生長(zhǎng)曲線，測(cè)定培養(yǎng)基、血清、藥物等物質(zhì)生物學(xué)作用的重要手段。在動(dòng)物細(xì)胞原代與傳代培養(yǎng)、細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇等眾多技術(shù)中需要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，植物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)也需要測(cè)定細(xì)胞數(shù)目。常用的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法有經(jīng)典計(jì)數(shù)法、電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法、MTT比色法等等。此外，還有一些針對(duì)某些特定標(biāo)本進(jìn)行改良的計(jì)數(shù)方法。經(jīng)典法就是用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法，其是先用酒精清潔計(jì)數(shù)板及專用蓋玻片，隨后用綢布拭干。上覆蓋玻片，用吸管將待測(cè)的細(xì)胞液打均勻，中層吸取10μ1細(xì)胞液放于蓋玻片邊緣上，待毛細(xì)作用使液體進(jìn)入蓋片和玻片之間的空隙中，不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡，放置1～2分鐘，用10X物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞壓中線時(shí)，只計(jì)左側(cè)和上方者，不計(jì)右側(cè)和下方者。全部計(jì)數(shù)完后，用蒸餾水沖洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片，再用70％乙醇沖洗，用擦鏡紙吸干。按下列公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞數(shù)每ml原液中含有細(xì)胞數(shù)＝(4大格細(xì)胞數(shù)之和/4)×104×稀釋倍數(shù)。到目前為止血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法最為經(jīng)典的計(jì)數(shù)技術(shù)，它可用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)，培養(yǎng)的細(xì)胞及需要在顯微鏡下計(jì)數(shù)的各種樣品。但是使用經(jīng)典計(jì)數(shù)法時(shí)也有局限性，即計(jì)數(shù)時(shí)細(xì)胞濃度必須大于2×104個(gè)/ml，所以經(jīng)典法不適合濃度小于2×104個(gè)/ml的細(xì)胞液計(jì)數(shù)。如在進(jìn)行PCR操作時(shí)，最后的細(xì)胞液往往只有幾微升，而且細(xì)胞液濃度又很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快捷、有效的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法，以適合各種試驗(yàn)研究的需要。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題可以采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。
一種微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法，其是用吸管充分打勻待測(cè)細(xì)胞液，在中層吸取1μl的細(xì)胞液；輕輕拭去槍頭周圍的液體；將薄壁EP管平放在桌面，槍頭快速地在小管內(nèi)加入1μl細(xì)胞懸液，使其成為一個(gè)小圓點(diǎn)狀的液滴，蓋上蓋子；放置1～2分鐘后，在倒置顯微鏡下直接計(jì)數(shù)液滴內(nèi)的全部細(xì)胞。
本發(fā)明的方法對(duì)設(shè)備、試劑的要求很低，一般的實(shí)驗(yàn)室條件即可滿足要求。另外，該方法還可將細(xì)胞按任意比例稀釋，對(duì)各種濃度水平的細(xì)胞數(shù)均能準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，適合各種試驗(yàn)研究的需要。該方法還能在其他如臨床檢測(cè)腫瘤細(xì)胞、制備單克隆抗體、單細(xì)胞PCR擴(kuò)增等許多實(shí)驗(yàn)室技術(shù)中得到應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合經(jīng)典法和本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法的比較來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
1 材料與方法1.1 材料選用中科院上海細(xì)胞所的K562腫瘤細(xì)胞，用含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，按常規(guī)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)3次，取其平均值(以其作為標(biāo)準(zhǔn)濃度)。取5μl的細(xì)胞液用PBS平衡鹽溶液稀釋1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50，得已知不同濃度腫瘤細(xì)胞的樣品，用經(jīng)典法和本發(fā)明的方法取以上樣品計(jì)數(shù)細(xì)胞，每種方法平均測(cè)試3次，取其平均值。
1.2 儀器血球計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、加樣槍、無菌吸管、薄壁EP管、普通光學(xué)顯微鏡或倒置顯微鏡。
1.3 方法1.3.1 經(jīng)典計(jì)數(shù)法先用酒精清潔計(jì)數(shù)板及專用蓋玻片，隨后用綢布拭干。上覆蓋玻片，用吸管將待測(cè)的細(xì)胞液打均勻，中層吸取10μl細(xì)胞液放于蓋玻片邊緣上，待毛細(xì)作用使液體進(jìn)入蓋片和玻片之間的空隙中，不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡，放置1～2分鐘，用10X物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞壓中線時(shí)，只計(jì)左側(cè)和上方者，不計(jì)右側(cè)和下方者。全部計(jì)數(shù)完后，用蒸餾水沖洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片，再用70％乙醇沖洗，用擦鏡紙吸干。按下列公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞數(shù)每ml原液中含有細(xì)胞數(shù)＝(4大格細(xì)胞數(shù)之和/4)×104×稀釋倍數(shù)。
1.3.2 本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法先用吸管充分打勻待測(cè)細(xì)胞液，快速在中層吸取1μl的細(xì)胞液。用綢布輕輕拭去槍頭周圍的液體。將0.2cm薄壁EP管平放在桌面，槍頭快速地在小管內(nèi)加入1μl細(xì)胞懸液，使其成為一個(gè)小圓點(diǎn)狀的液滴，蓋上蓋子。放置1～2分鐘后，在倒置顯微鏡下直接計(jì)數(shù)液滴內(nèi)的全部細(xì)胞。
1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，所得數(shù)據(jù)以(x±s)表示，前后數(shù)值差異比較用t檢驗(yàn)、直線回歸、相關(guān)分析。
2 結(jié)果2.1 未稀釋細(xì)胞，經(jīng)典法與本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法兩種計(jì)數(shù)方法比較。其結(jié)果見表1。
表1 未稀釋兩種計(jì)數(shù)方法結(jié)果比較(單位×104個(gè)/ml)

※通過計(jì)算t＝2.138，查表得知t0.05＞t，P＞0.05，計(jì)數(shù)結(jié)果沒有顯著性差異。表明這兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果一致。在某些情況下，可以用本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法替代經(jīng)典法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
2.2 稀釋后的細(xì)胞，經(jīng)典法與本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法(兩種計(jì)數(shù)方法)比較。
未稀釋標(biāo)本中細(xì)胞濃度為67×104/ml，用經(jīng)典法與本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)細(xì)胞的方法測(cè)定同一稀釋倍數(shù)的標(biāo)本，其結(jié)果見表2。
2.2.1 以經(jīng)典計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度值為X，微量計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果值為Y，兩者之間的線性關(guān)系為相關(guān)系數(shù)r＝0.998461。查表P＝0.01時(shí)，r0.01＜r，相關(guān)性極顯著，為強(qiáng)直線相關(guān)。
2.2.2 分別以經(jīng)典法與本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)的稀釋倍數(shù)為自變量，對(duì)各濃度梯度進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果為(1)經(jīng)典計(jì)數(shù)法 相關(guān)系數(shù)r＝-0.89462；結(jié)果表明稀釋倍數(shù)與細(xì)胞濃度之間相關(guān)性較強(qiáng)，為負(fù)強(qiáng)直線相關(guān)?；貧w方程y＝124.0167-4.07476x；(2)微量計(jì)數(shù)法 相關(guān)系數(shù)r＝-0.80930；結(jié)果表明稀釋倍數(shù)與細(xì)胞濃度之間相關(guān)性較強(qiáng)，為負(fù)強(qiáng)直線相關(guān)。回歸方程y＝92.54143-2.03931x；
表2 稀釋后，兩種計(jì)數(shù)方法結(jié)果比較(單位個(gè)/μl)

從以上的數(shù)據(jù)可以看出兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果相差不大，其結(jié)果顯示經(jīng)典計(jì)數(shù)法在細(xì)胞濃度＜2×104個(gè)/ml時(shí)，其實(shí)際測(cè)得值均為“0”。本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法在細(xì)胞濃度＜2×104個(gè)/ml時(shí)，其測(cè)定值與期望值相接近。
從以上結(jié)果可以得知，稀釋操作不會(huì)影響本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法的結(jié)果。無論有沒有稀釋處理，微量法測(cè)定的結(jié)果都與經(jīng)典計(jì)數(shù)法這種基本測(cè)定方法的結(jié)果相近。當(dāng)細(xì)胞液濃度低于2×104個(gè)/ml時(shí)，經(jīng)典法計(jì)數(shù)測(cè)得值均為“0”，而微量法計(jì)數(shù)的結(jié)果仍然與期望值相接近。
所以，雖然本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法的精確度沒有經(jīng)典法好，但是在細(xì)胞液濃度低于2×104個(gè)/ml時(shí)，可以使用微量法來替代經(jīng)典計(jì)數(shù)法。在進(jìn)行操作時(shí)，要注意盡量使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸浮液，在連續(xù)取樣計(jì)數(shù)時(shí)，尤應(yīng)注意這一點(diǎn)，否則會(huì)影響細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，使前后計(jì)數(shù)結(jié)果出現(xiàn)很大的誤差。顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到2個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，如細(xì)胞團(tuán)＞10％，說明分散不充分。
本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)的原理就是把一定體積的細(xì)胞液，在顯微鏡下直接計(jì)算其個(gè)數(shù)，利用所得出的結(jié)果推算出每毫升細(xì)胞液中的細(xì)胞數(shù)量。微量法測(cè)定和分析不僅僅局限于某一種單一的方法，其實(shí)微量法也可以應(yīng)用于很多領(lǐng)域。
本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法可以應(yīng)用于臨床檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。惡性腫瘤是目前威脅人類健康和生命的主要疾病之一，人們一直在探索腫瘤診斷治療的新途徑和新方法。腫瘤細(xì)胞不斷分裂，形成新的腫瘤細(xì)胞，并由原發(fā)部位向周圍組織浸潤(rùn)和它處轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)移如無法控制，將進(jìn)一步侵犯要害器官和引起衰竭，最后導(dǎo)致死亡。有實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)小量瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，可形成致死性腫瘤，而大量相同腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移則大都被排斥。所以當(dāng)只有少數(shù)的幾個(gè)腫瘤細(xì)胞開始轉(zhuǎn)移時(shí)，用一般的影像學(xué)診斷方法更是不可能發(fā)現(xiàn)，往往導(dǎo)致臨床的錯(cuò)誤判斷，喪失治療時(shí)機(jī)。我們可以考慮利用免疫組化和本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，然后獲得單個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行研究。
具體做法是臨床檢測(cè)中，1μl血液中通常含有7000-10000個(gè)細(xì)胞。在1μl的血液中，加入抗體、抗原，通過抗體抗原結(jié)合反應(yīng)，分離出的幾個(gè)含有癌抗原的細(xì)胞，此時(shí)經(jīng)典法肯定計(jì)數(shù)不出結(jié)果。在這種情況下，可以用本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法測(cè)定出管內(nèi)癌抗細(xì)胞含量，推算出全身有幾個(gè)癌抗細(xì)胞。這種方法測(cè)定的結(jié)果可以作為術(shù)后隨訪，監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。
用本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法還可以從大量的細(xì)胞懸液中制取出一個(gè)細(xì)胞。按照經(jīng)典的研究提示，體內(nèi)的B細(xì)胞分泌抗體，每一個(gè)B細(xì)胞分泌一種類型的免疫球蛋白。自然界內(nèi)存在的抗原達(dá)到108以上，人體為了生存應(yīng)付這樣復(fù)雜的環(huán)境，必須建立一個(gè)龐大的抗體庫，因此每個(gè)B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體我們可以用微量法來制備單克隆抗體。單克隆抗體的制備主要涉及動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇培養(yǎng)、克隆化等技術(shù)。其中克隆化就是分離出單個(gè)細(xì)胞，使其通過分裂增殖而獲得一個(gè)遺傳性十分均一的細(xì)胞群體的全部過程。經(jīng)過數(shù)次克隆化后，可建立單克隆細(xì)胞系。我們可以使用微量法來進(jìn)行克隆化。將細(xì)胞懸液經(jīng)過多次稀釋，直至96孔培養(yǎng)板的每孔中可能只含有1個(gè)細(xì)胞的濃度，并使細(xì)胞增殖，從而獲得單克隆抗體細(xì)胞系。
單細(xì)胞基因診斷是一項(xiàng)高新技術(shù)，隨生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)應(yīng)用于這一領(lǐng)域，使更多的遺傳疾病得以根治。同樣地，可以使用本發(fā)明的微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法從大約106個(gè)/ml的細(xì)胞液中取出一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞PCR擴(kuò)增。
權(quán)利要求
1.一種微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法，其是用吸管充分打勻待測(cè)細(xì)胞液，在中層吸取1μl的細(xì)胞液；輕輕拭去槍頭周圍的液體；將薄壁EP管平放在桌面，槍頭快速地在小管內(nèi)加入1μl細(xì)胞懸液，使其成為一個(gè)小圓點(diǎn)狀的液滴，蓋上蓋子；放置1～2分鐘后，在倒置顯微鏡下直接計(jì)數(shù)液滴內(nèi)的全部細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法，其特征在于顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到2個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，如細(xì)胞團(tuán)＞10％，說明分散不充分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微量懸浮腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法，其是用吸管充分打勻待測(cè)細(xì)胞液，在中層吸取1μl的細(xì)胞液；輕輕拭去槍頭周圍的液體；將薄壁EP管平放在桌面，槍頭快速地在小管內(nèi)加入1μl細(xì)胞懸液，使其成為一個(gè)小圓點(diǎn)狀的液滴，蓋上蓋子；放置1～2分鐘后，在倒置顯微鏡下直接計(jì)數(shù)液滴內(nèi)的全部細(xì)胞。本發(fā)明的方法對(duì)設(shè)備、試劑的要求很低，一般的實(shí)驗(yàn)室條件即可滿足要求。另外，該方法還可將細(xì)胞按任意比例稀釋，對(duì)各種濃度水平的細(xì)胞數(shù)均能準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，適合各種試驗(yàn)研究的需要。該方法還能在其他如臨床檢測(cè)腫瘤細(xì)胞、制備單克隆抗體、單細(xì)胞PCR擴(kuò)增等許多實(shí)驗(yàn)室技術(shù)中得到應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N1/34GK1715867SQ20051002814
公開日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2005年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月26日
發(fā)明者李興玉, 陸穎, 丁煥平, 李靜 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)