專利名稱：乙型肝炎病毒感染肝臟的血清生物標(biāo)記和檢測該標(biāo)記的方法
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)，一種嚴(yán)重傳染性的和分布廣泛的人類病原體給全世界帶來一個重大的健康問題。慢性HBV感染演變成肝細(xì)胞癌的風(fēng)險非常高。雖然在過去的幾年中已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但HBV感染的發(fā)病機(jī)理仍然難以捉摸，且HBV感染肝臟的明確診斷信息仍依賴于活組織檢查。
乙型肝炎病毒(HBV)感染是人類最常見的病毒感染之一，大約有20億人被感染[1]。在這些被感染的人中，三億五千萬變?yōu)槁愿腥?。這在亞太地區(qū)，例如中國南部特別受關(guān)注[2]。大約25-40％最終死于肝臟疾病(即伴有或不伴有肝細(xì)胞癌的肝硬化)；男性死亡率為50％，女性為15％。流行病學(xué)研究表明HBV感染是一種復(fù)雜的狀況，且感染的致病機(jī)理還不是完全明確[2，3]。雖然在疾病的診斷和進(jìn)展監(jiān)控中已經(jīng)鑒定和使用了多種HBV標(biāo)記，例如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，乙型肝炎表面抗體，乙型肝炎e抗原，乙型肝炎e抗體，乙型肝炎核心抗原，乙型肝炎核心抗體，IgM和IgG，但能夠明確診斷感染的單一血清學(xué)試驗(yàn)卻不存在[4]。例如HBsAg陽性是HBV感染的特點(diǎn)，但HBsAg陰性不能夠排除HBV感染[4]。到目前為止，對HBV感染的肝臟炎癥的明確診斷仍依賴于血清學(xué)，生物化學(xué)和組織學(xué)檢查的結(jié)合。
目前有兩類藥物被用來治療慢性HBV[5，6]。第一類是通過調(diào)節(jié)宿主對HBV抗原的免疫反應(yīng)起作用的一類免疫調(diào)制劑。第二類是一類病毒抑制劑。目前最好的免疫調(diào)節(jié)藥物，干擾素α2b只具有有限的效果，特別是對亞洲病人。病毒抑制劑需要很長時間才能有效降低HBV水平。很明顯需要更特異和更有效的診斷和治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種檢測病人中存在乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，包括從病人獲取血清樣品；將樣品進(jìn)行蛋白凝膠電泳以分離其中包含的蛋白質(zhì)；用硝酸銀溶液對分離在電泳凝膠上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色；將染色蛋白質(zhì)的圖象掃描到圖象分析掃描儀中以獲取凝膠圖象；將凝膠圖象和由HBV陰性血清和HBV陽性血清制備的對照樣品的電泳凝膠進(jìn)行對比，以確定HBV感染病人的血清樣品是否包含有發(fā)生變化的血清蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也提供了診斷病人中HBV感染和肝臟炎癥的血清生物標(biāo)記(biomarker)，其中血清生物標(biāo)記包含一種或多種下列蛋白載脂蛋白A-I(apoA-I)、載脂蛋白A-I片段、觸珠蛋白β鏈、觸珠蛋白切割的β鏈、觸珠蛋白α2鏈、載脂蛋白A-IV(apoA-IV)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶片段/同種型或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(topo-II)。
附圖簡介

圖1分別顯示了正常、LNS和HNS這三種有代表性的血清樣品的2維(2D)凝膠圖象(A)，和顯示人血清蛋白共同特征的放大的主LNS凝膠(B)。(Norm正常，LNS & HNS低和高的壞死性炎癥(necroinflammatory)分?jǐn)?shù))。
圖2包括在1區(qū)和2區(qū)中顯示蛋白質(zhì)變化的觸珠蛋白模式(Norm正常，LNS & HNS低和高的壞死性炎癥分?jǐn)?shù))。
圖3在3區(qū)和4區(qū)顯示有關(guān)apoA-I、apoA-IV和甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)的蛋白質(zhì)變化(Norm正常，LNS & HNS低和高的壞死性炎癥分?jǐn)?shù))。
圖4在5區(qū)和6區(qū)顯示有關(guān)α1-抗胰蛋白酶的蛋白質(zhì)變化(Norm正常，LNS & HNS低和高的壞死性炎癥分?jǐn)?shù))。
圖5在7區(qū)顯示DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II□的模式，顯示了蛋白質(zhì)變化(Norm正常，LNS & HNS低和高的壞死性炎癥分?jǐn)?shù))。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了一種在肝臟炎癥病人中檢測乙型肝炎病毒(HBV)感染存在的方法；包括(a)從病人獲取血清樣品；(b)分離存在于病人血清樣品中的蛋白質(zhì)以確定樣品中生物標(biāo)記的存在；和(c)將存在于步驟(b)中的蛋白質(zhì)和存在于正常病人對照血清樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，以確定從HBV感染病人獲得的血清樣品是否包含可指示炎癥性肝臟被HBV感染的發(fā)生變化的血清蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供了一種檢測病人中存在乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，包括從病人獲取血清樣品；將樣品進(jìn)行蛋白凝膠電泳以分離其中包含的蛋白質(zhì)；用硝酸銀溶液對分離在電泳凝膠上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色；將染色蛋白質(zhì)的圖象掃描到圖象分析掃描儀中以獲取凝膠圖象；將凝膠圖象與由正常病人的血清和HBV感染并伴有肝臟炎癥病人的血清制備的對照樣品的電泳凝膠進(jìn)行對比，以確定病人的血清樣品是否包含可指示炎癥性肝臟慢性HBV感染的發(fā)生變化的血清蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，HBV感染并伴有肝臟炎癥病人的樣品包含載脂蛋白A-I(apoA-I)、載脂蛋白A-I片段、觸珠蛋白β鏈、觸珠蛋白切割的β鏈、觸珠蛋白2鏈、載脂蛋白A-IV(apoA-IV)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶片段/同種型或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(topo-II)。在另一個實(shí)施方案中，此方法中所用的相同血清包含載脂蛋白A-I或其片段。
本發(fā)明也提供了診斷病人HBV感染性肝臟炎癥的血清生物標(biāo)記，其中血清生物標(biāo)記包含一種或多種下列已鑒定的蛋白載脂蛋白A-I(apoA-I)、載脂蛋白A-I片段、觸珠蛋白β鏈，觸珠蛋白切割的β鏈、觸珠蛋白2鏈、載脂蛋白A-IV(apoA-IV)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶片段/同種型或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(topo-II)。在另一個實(shí)施方案中，血清生物標(biāo)記包含純化的載脂蛋白A-I或其片段。
參考下面的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)可以更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員很容易理解這里詳細(xì)描述的具體實(shí)施例是用于解釋本發(fā)明，不意味著限制其后所描述的發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)i.引言蛋白質(zhì)組學(xué)分析是最近研發(fā)的一種具有較強(qiáng)功能的技術(shù)，可增強(qiáng)人類疾病診斷、治療和預(yù)防方面的研究[7，8]。蛋白質(zhì)組學(xué)通過2維電泳或蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對正常樣品和患病樣品或藥物治療樣品的不同的蛋白質(zhì)表達(dá)譜(表達(dá)水平、翻譯后修飾、相互作用等)進(jìn)行綜合檢查分析，可以提供有關(guān)新的生物標(biāo)記、疾病相關(guān)的靶和發(fā)病機(jī)制方面的信息。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于研究癌癥和其他疾病[9-11]，但目前還沒有關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于研究HBV感染性肝臟炎癥的報道。在這項(xiàng)研究中，我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)對HBV感染血清樣品進(jìn)行了全局性的分析。通過與正常血清樣品進(jìn)行比較，鑒定出了多種明顯不同的蛋白質(zhì)表達(dá)。對這些蛋白質(zhì)的詳細(xì)分析可能為HBV感染性肝臟疾病的診斷和治療揭示有價值的信息。
在這篇報道中，我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)對HBV感染的血清樣品進(jìn)行全局性檢測的目的是尋找能夠用作進(jìn)行診斷的血清生物標(biāo)記和/或發(fā)病機(jī)理研究靶蛋白的肝臟疾病相關(guān)蛋白質(zhì)。通過與正常血清樣品和HBV陰性血清樣品進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)在HBV感染并伴有肝臟炎癥病人的血清中至少有七種蛋白質(zhì)發(fā)生了明顯變化。經(jīng)鑒定這些變化較大的蛋白質(zhì)是觸珠蛋白β鏈和α2鏈、載脂蛋白A-I和載脂蛋白A-IV、α1-抗胰蛋白酶、甲狀腺素運(yùn)載蛋白和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα。這些蛋白質(zhì)的變化不僅表現(xiàn)在量上，而且表現(xiàn)在它們的模式(或特異性)上，而這與壞死性炎癥分?jǐn)?shù)相關(guān)。特別是載脂蛋白A-I表現(xiàn)出不同同種型表達(dá)水平的不均一變化，而α1-抗胰蛋白酶產(chǎn)生了暗示不同切割路徑的明顯不同的片段。這些獨(dú)特的現(xiàn)象似乎是HBV感染特有的。一種同時考慮這些蛋白質(zhì)的量和同種型的組合是HBV診斷和治療有用的血清生物標(biāo)記(或指標(biāo))。
i.材料和方法A.受試人我們在中國香港特別行政區(qū)(Hong Kong SAR)Queen Mary醫(yī)院的肝臟學(xué)研究診所(Hepatology Research Clinic)(屬于GKK Lau)對18名慢性乙型肝炎e抗原陽性的中國受試者進(jìn)行了隨訪研究。九人處于免疫耐受期(第1組)，九人處于免疫清除期(第2組)(表1)。他們都進(jìn)行了用于評估或用來進(jìn)行與臨床試驗(yàn)計劃一致的治療前評估的肝臟活組織檢查[12]。由不清楚病人臨床發(fā)現(xiàn)的2位病理學(xué)家對肝活組織檢查進(jìn)行評估。既從組織學(xué)也從修飾的組織活性指標(biāo)方面進(jìn)行評估[13]。對肝臟活組織檢查時收集的血清樣品的血清ALT水平進(jìn)行評估，并采用bDNA信號擴(kuò)增測定(bDNAQuantiplexTMHBV DNA，Chiron，Emeryville，CA，美國)對血清中的HBV DNA進(jìn)行定量[14]。第1組病人血清HBV DNA高(6554±1731×106/ml)，ALT水平低(33±14 IU/L)，壞死性炎癥分?jǐn)?shù)(LNS)低(≤2)，而第2組病人血清HBVDNA低(922±1388×106/ml)，ALT水平高(427±253 IU/L)，壞死性炎癥分?jǐn)?shù)(HNS)高(≥7)(表1)。另外，用5名乙型肝炎陰性和10名正常受試者作為對照。所有的血清樣品都儲存在-80C直到使用。采用Bradford方法確定所有樣品的蛋白質(zhì)濃度。
A.2D凝膠電泳用Amersham Pharmacia IPGphor IEF和Ettan Dalt的六電泳單元參照Amersham Pharmacia公司建議的規(guī)程進(jìn)行2D凝膠電泳。簡而言之，就是將250μg(～3μl)血清樣品混入含有8M尿素、4％ CHAPS、1mM PMSF、20mMDTT和0.5％IPG緩沖液的340μl再水化溶液中。在30V低電壓下對預(yù)制的18cm的IPG條進(jìn)行超過10小時的再水化步驟。遵循“逐步”電壓增加程序運(yùn)行IEF即500V和1000V各1小時，5000-8000V約10小時，總量為64KVh。IEF后，將條在平衡緩沖液中進(jìn)行兩步平衡，第一步在包含6M尿素、30％甘油、2％SDS和50mM Tris-HCl(pH6.8)及1％DTI(w/v)的緩沖液中進(jìn)行，第二步在包含6M尿素、30％甘油、2％SDS和50mM Tris-HCl(pH6.8)及2.5％IAA(w/v)的緩沖液中進(jìn)行。然后將條轉(zhuǎn)移到在10℃在1.5mm厚的12.5％的聚丙烯酰胺凝膠上運(yùn)行的二維SDS-PAGE上。
A.銀染色將凝膠在40％乙醇和10％乙酸水溶液中過夜進(jìn)行固定，接著在含有30％乙醇、41％乙酸鈉和0.2％硫代硫酸鈉的緩沖液中溫育30分鐘。在水中洗滌凝膠三次，每次5分鐘，然后在包含0.02％甲醛的0.1％的硝酸銀溶液中將凝膠染色40分鐘。在由2.5％碳酸鈉和0.01％甲醛組成的溶液中繼續(xù)進(jìn)行15分鐘顯影。用EDTA溶液(1.46％)終止顯影，然后在水中洗滌染色的凝膠三次，每次5分鐘。
A.圖象獲取和分析用Amersham Pharmacia Biotech的軟件LabScan 3.00操縱的ImageScanner(Amersham)掃描染色的凝膠。在獲取凝膠圖象前用強(qiáng)度階式光楔進(jìn)行強(qiáng)度校準(zhǔn)。使用Amersham Pharmacia的ImageMaster 2D Elite軟件4.01對圖象進(jìn)行分析。先對圖象點(diǎn)進(jìn)行檢測，配對，然后進(jìn)行手工編輯。正常血清樣品的十幅凝膠圖象被平均，作為用于比較的參考。通過本底扣除和總的點(diǎn)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化處理每一個點(diǎn)的強(qiáng)度值，所得到的點(diǎn)強(qiáng)度的百分比用來進(jìn)行比較。只選擇那些具有顯著差異的點(diǎn)(2倍增加或降低)用質(zhì)譜法進(jìn)行分析。
A.凝膠內(nèi)的胰蛋白酶消化將蛋白點(diǎn)切下，轉(zhuǎn)移到硅烷化處理的1.5ml Eppendorf管中。在1∶1的30mM的鐵氰化鉀和100mM硫代硫酸鈉的混合溶液中對凝膠芯片進(jìn)行脫色后，在50mM碳酸氫銨中平衡以使pH為8.0。用乙腈水合以及在SpeedVac中干燥凝膠后，將凝膠在最少量的胰蛋白酶溶液(在25mM NH4HCO3中10μg/ml)中進(jìn)行再水化，并于37C溫育過夜。上清液直接用于有等量基質(zhì)的樣品盤中。如果需要，接下來可以用50％和80％乙腈提取凝膠內(nèi)的消化物，然后在樣品盤中使用前用Zip尖端對其進(jìn)行濃縮和脫鹽處理。
A.MALDI-TOF質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)鑒定用Voyage-DE STR MALDI-TOF質(zhì)譜儀(Applied Biosystems)獲取胰蛋白酶肽的質(zhì)譜圖。儀器設(shè)置為延遲提取時間為175ns、柵壓為60-65％和加速電壓為20k的反射器模式。用每一個光譜中的250個激光點(diǎn)獲取質(zhì)量為600到2500道爾頓的圖譜。胰蛋白酶自溶片段峰(906.5049、1153.5741和2163.0570)作為質(zhì)量校準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)物。通過使用MS-Fit(http//prospector.ucsf.edu/)在NCBI nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索來鑒定蛋白質(zhì)。用50ppm或更好的質(zhì)量精確度，至少4個匹配肽質(zhì)量和分子量和與凝膠的估計值匹配的pI設(shè)定檢索標(biāo)準(zhǔn)。也進(jìn)行了發(fā)射源衰減后(post-source decay)MS/MS測定和MS-Tag(http//prospector.ucsf.edu/)搜索來證實(shí)MS-Fit的結(jié)果。物種搜索只限于智人(Homo sapiens)。
i結(jié)果A.蛋白質(zhì)分離對兩組HBV感染血清樣品和對照樣品進(jìn)行了2D-PAGE，并通過銀染色顯現(xiàn)蛋白質(zhì)。對每一份樣品進(jìn)行三次2D凝膠，以使凝膠間差異最小化。圖1A分別顯示了正常、HBV感染的低和高壞死性炎癥分?jǐn)?shù)(LNS and HNS)這三種血清的代表性凝膠圖象。圖1B是顯示人血清蛋白質(zhì)共同特征的放大的主LNS凝膠。總之，在SWISS-2D數(shù)據(jù)庫(http//www.expasy.ch/ch2d/)中凝膠具有與血漿圖譜非常相似的模式，只除了缺少纖維蛋白原外。對凝膠上分子量在6k-20k Da，以及pIs在4-10的超過1000個點(diǎn)進(jìn)行了檢測。多個系列的點(diǎn)代表那些一級結(jié)構(gòu)具有不同程度糖基化和/或磷酸化(同種型)，從而導(dǎo)致pI和分子量漸進(jìn)性變化的蛋白質(zhì)。借助于ImageMaster程序，在三類樣品之間對點(diǎn)強(qiáng)度進(jìn)行了比較。在圖1B顯示的至少七個區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了明顯且恒定的差異。
A.蛋白質(zhì)鑒定將具有明顯差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)切割下來，并用胰蛋白酶進(jìn)行消化，進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜測量和數(shù)據(jù)庫檢索。通過將點(diǎn)的位置和模式與SWISS數(shù)據(jù)庫血漿圖譜中的那些進(jìn)行比較來對蛋白質(zhì)鑒定進(jìn)行適當(dāng)?shù)拇_認(rèn)。表2概括了七個區(qū)內(nèi)已鑒定的蛋白質(zhì)和它們在正常、LNS和HNS血清樣品中的變化。總之，在慢性HBV感染和肝臟炎癥病人的血清中有3種蛋白質(zhì)(組)的表達(dá)被抑制，且5種蛋白質(zhì)(組)的表達(dá)增強(qiáng)。
有關(guān)觸珠蛋白的一個顯著變化顯示在圖2(圖1B的1和2區(qū))中。觸珠蛋白α2鏈、β鏈和切割的β鏈在2D凝膠中表現(xiàn)出它們特有的系列模式，特征在于分別具有三種、七種和六種可檢測的同種型。與正常樣品相比，觸珠蛋白在LNS血清樣品中總體上輕度增加或沒有變化，但在HNS病人中受到明顯抑制(表2)。在有些情形中(30％)，蛋白質(zhì)減少到不可檢測的水平。相反在圖2的1區(qū)用圓圈突出顯示的蛋白簇則從對照樣品中不可檢測的表達(dá)水平逐漸增加到LNS中的部分可見，然后增加到HNS中的完全顯現(xiàn)。
圖3顯示了發(fā)生在載脂蛋白A-I(apoA-I)區(qū)(圖1B 3區(qū))的另一個明顯的變化。正常血清具有三個主要的apoA-I蛋白點(diǎn)(從左到右為同種型2、1和0)[15]，緊接著在這些主要點(diǎn)的下方有一到三個非常弱的切割片段點(diǎn)。在慢性HBV感染的血清樣品中，apoA-I譜的全部模式被改變。同種型2大大上調(diào)，同種型0明顯下調(diào)，而同種型1保持不變(表2)。除了這三個主要的點(diǎn)外，弱的片段點(diǎn)顯著增強(qiáng)，而且在低分子量區(qū)域出現(xiàn)了許多新的點(diǎn)(圖3)。經(jīng)鑒定這些新的點(diǎn)具有apoA-I的一級結(jié)構(gòu)序列，且它們可能屬于apoA-I的切割片段或其他同種型。也值得注意的是主要apoA-I蛋白點(diǎn)的強(qiáng)度在LNS和HNS樣品中全部都下降，而且apoA-I的切割片段或其他同種型在LNS中的強(qiáng)度值比在HNS樣品中的對應(yīng)值高(表2)。
在分子量更低的4區(qū)中還觀察到另一種apoA-I片段(圖3)。這個點(diǎn)出現(xiàn)在LNS和HNS樣品兩者中，但正常血清樣品中卻沒有。類似地在兩種HBV感染樣品的相同4區(qū)中都鑒定出一個apoA-IV的點(diǎn)，而在對照中卻沒有檢測到。正常樣品的4區(qū)中唯一可檢測的點(diǎn)經(jīng)鑒定是甲狀腺素運(yùn)載蛋白。在HBV攜帶者的血清中甲狀腺素運(yùn)載蛋白同種型的表達(dá)水平明顯降低。
圖4顯示了圖1B的5和6區(qū)中的蛋白質(zhì)變化。5區(qū)中的三個點(diǎn)和6區(qū)中的兩個點(diǎn)在LNS和HNS樣品中都顯著增強(qiáng)(表2)。經(jīng)鑒定這些點(diǎn)具有與α1-抗胰蛋白酶相同的一級序列。這種蛋白質(zhì)通常在代表2D凝膠中范圍為pI5.0-5.2，MW 55kDa(http//www.expasy.ch/ch2d/)的各種表型的一組點(diǎn)中出現(xiàn)(圖1B)。在對照和HBV血清樣品之間沒有發(fā)現(xiàn)正常α1-抗胰蛋白酶水平的明顯變化。然而在低分子量區(qū)域(MW 38-39kDa)，α1-抗胰蛋白酶的水平在HBV樣品中大大增強(qiáng)(表2)。HNS 6區(qū)中蛋白質(zhì)增加的表達(dá)水平比LNS樣品中的多2倍。
7區(qū)中的點(diǎn)被鑒定為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(topo-II)(圖5)。在正常血清中只檢測到這種蛋白質(zhì)的一個點(diǎn)，而在HBV樣品中發(fā)展為一組的五個點(diǎn)。結(jié)果，在HBV血清中蛋白水平總計升高了約20倍(表2)?？紤]到完整topo-II□分子量為180kDa這一事實(shí)，認(rèn)為7區(qū)中的這些點(diǎn)可能是低分子量的片段。
A.討論觸珠蛋白、apoA-I和α1-抗胰蛋白酶屬于肝臟分泌的最豐富的血清糖蛋白。因此肝臟損傷導(dǎo)致這些蛋白發(fā)生變化是合理的，反過來就可以用這些蛋白質(zhì)作為監(jiān)控肝臟疾病的生物標(biāo)記。最近已經(jīng)努力將這些蛋白質(zhì)和其他的基礎(chǔ)血清標(biāo)記結(jié)合作為診斷HCV疾病的指標(biāo)，從而減少在慢性HCV感染病人中進(jìn)行的肝臟活組織檢查的數(shù)目[16，17]。所有的這些研究幾乎都基于正常和患病樣品中標(biāo)記蛋白量的比較。目前的這份報告通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析在全局范圍內(nèi)研究了這些生物標(biāo)記的變化(其表達(dá)水平及模式)，因此能夠?yàn)镠BV感染提供更加具體的評估。
已經(jīng)用觸珠蛋白來研究包括HBV感染的各種肝臟疾病的血清很長時間了。但卻報道出相反的結(jié)果。早期的研究表明在慢性[18，19]和急性[20]病毒性肝炎中觸珠蛋白水平降低，而其他的報道則聲稱觸珠蛋白水平在急性肝炎中發(fā)生變化[21]，而在慢性肝炎中沒有觀察到明顯的變化[22]。另外一項(xiàng)最近的研究揭示觸珠蛋白在所有的急性病毒性肝炎和慢性HBV感染中都增加，在其他慢性肝炎病人中則下降[23]。產(chǎn)生這些不一致結(jié)果的原因可能是因?yàn)槭褂玫臏y量方法、樣品來源和疾病所處的分期不同。我們在這里對低(LNS)和高(HNS)炎癥期的HBV血清進(jìn)行了具體評估。我們的結(jié)果顯示，在LNS血清中，觸珠蛋白α2和β鏈輕度增加，而在HNS樣品中顯著下降(表2)。這暗示與慢性HBV感染的低ALT和高HBV-DNA免疫耐受期相對應(yīng)的不伴有炎癥的HBV感染可能不會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷[6]。而炎癥晚期會使肝功能嚴(yán)重?fù)p傷，從而導(dǎo)致受損肝臟分泌的觸珠蛋白α和β鏈都明顯下降。
許多研究已經(jīng)表明apoA-I的水平與慢性肝臟疾病中肝細(xì)胞功能的變化相關(guān)[24-27]。蛋白水平低意味著肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重。已經(jīng)確信在翻譯后水平控制apoA-I[28]，且肝臟損傷減少了apoA-I從其他同種型的轉(zhuǎn)化[29]。我們的結(jié)果表明，在慢性HBV感染中，2D凝膠中的apoA-I不僅水平發(fā)生了變化，而且整個模式也發(fā)生了變化(圖3)。特別是三種主要的apoA-I同種型的表達(dá)水平各自獨(dú)立地發(fā)生了變化。這是在HBV感染中第一次觀察到這種現(xiàn)象。這種不均一的變化反映出不同同種型apoA-I具有不同的翻譯后控制，這可能和同種型的具體特征或功能相關(guān)。對這些特殊蛋白質(zhì)同種型中潛在的特殊修飾進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定能夠?yàn)镠BV感染提供有用的診斷信息。出現(xiàn)新的apoA-I點(diǎn)的簇也似乎是HBV感染特有的，因?yàn)樵谄渌装Y，例如飲酒過度、肝硬化和其他肝臟損傷中沒有揭示類似的觀察結(jié)果[30](未公布的結(jié)果)。這些新的點(diǎn)可能包含用普通的比濁計測定檢測不到的apoA-I的不同同種型。這表明在慢性肝炎中觀察到的apoA-I水平下降只與apoA-I三種主要同種型的變化相對應(yīng)。因此開發(fā)對apoA-I同種型特異性的單克隆抗體用于HBV感染的血清學(xué)測定是可能的。這種可能性仍在研究中。
apoA-IV是由人腸合成的糖蛋白，在多基因簇中與apoA-I密切相關(guān)[31，32]。已經(jīng)暗示apoA-IV對病變和動脈粥樣硬化具有保護(hù)功能[33-35]，以及具有調(diào)節(jié)胃功能的生理作用[36，37]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在炎癥[38]、急性肝炎[39]和肝硬化[40]的情況下apoA-IV水平被抑制。目前在HBV血清的低分子量區(qū)出現(xiàn)的apoA-IV點(diǎn)可能是完整蛋白的片段(～45kDa)。這暗示觀察到的apoA-IV下降是由炎癥過程中發(fā)生的蛋白質(zhì)切割所導(dǎo)致的，而這是評估HBV感染的又一個指示標(biāo)記。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)公知的負(fù)急性期蛋白—甲狀腺素運(yùn)載蛋白在多種急性肝臟疾病中濃度顯著下降[23，41，42]。在當(dāng)前這篇報道中我們證實(shí)至少一種甲狀腺素運(yùn)載蛋白同種型在LNS和HNS血清樣品中都表現(xiàn)出一半的表達(dá)水平(表2)，這表明甚至在嚴(yán)重炎癥出現(xiàn)以前病毒感染導(dǎo)致的肝功能障礙就已經(jīng)發(fā)生。
□1-抗胰蛋白酶作為一種強(qiáng)效的細(xì)胞凋亡和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活抑制劑之一能夠抑制多種即將死亡的細(xì)胞釋放的蛋白酶， 因此在應(yīng)激過程例如炎癥中能夠保護(hù)正常組織[43]。在急性和慢性肝炎中都觀察到的α1-抗胰蛋白酶水平增高[19]可能是肝臟的自我保護(hù)反應(yīng)。另一方面，已經(jīng)顯示α1-抗胰蛋白酶活性的缺失與肝臟疾病密切相關(guān)[44，45]。這種α1-抗胰蛋白酶缺失可以遺傳自一些表型變體中的突變基因[46-48]。在當(dāng)前這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)α1-抗胰蛋白酶在低分子量區(qū)域(～40kDa)增加?？紤]到α1-抗胰蛋白酶是分子量為52kDa的394個氨基酸的單鏈蛋白質(zhì)，我們相信較低MW的蛋白質(zhì)可能是片段，而不是其他的表型。令人感興趣的是，這些大的片段分散在兩個不同的pI區(qū)，以完全不同的模式存在，而且在LNS和HNS病例中表現(xiàn)出不同的增高程度，這表明這些大的片段是不同切割途徑的產(chǎn)物。對這些肽的進(jìn)一步鑒定可能揭示潛在的有利于理解HBV感染和診斷HBV感染的信息。而且在其他的肝臟炎癥中沒有觀察到這種特殊現(xiàn)象，表明這種變化可能是HBV感染特有的。
DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II是一種使一條DNA雙鏈體通過第二條DNA雙鏈體中的一個瞬間缺口而催化拓?fù)浠蚪M變化的ATP依賴性酶[49]。這種酶具有兩種分別編碼的同種型，topoII□和topoII□。兩種形式都是幾種廣泛使用的可中斷酶促DNA斷裂-再結(jié)合，從而導(dǎo)致DNA復(fù)制過程終止，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的抗癌劑的分子靶[50]。topoIIα的超表達(dá)暗示其與包括HCC[51]，肺癌[52，53]和卵巢癌[54]的幾種攻擊性腫瘤具有潛在的聯(lián)系。在人卵巢癌[54]和K562細(xì)胞[55]中也發(fā)現(xiàn)topoII□的mRNA水平升高。當(dāng)前在HBV血清中發(fā)現(xiàn)的topoII片段的大大增高可以反映與HBV感染相關(guān)的topoII□表達(dá)的明顯增高。雖然這種改變是否代表HBV誘導(dǎo)的惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最初征兆還需要更加詳細(xì)的研究，但它表明DNA代謝過程與HBV感染有關(guān)。
HBV疾病是一種復(fù)雜的狀況。已經(jīng)鑒定了多種血清生物標(biāo)記，且基于它們量的變化在臨床診斷中已經(jīng)使用這些標(biāo)記。然而在診斷和處理慢性HBV感染時不同的血清學(xué)檢測具有不同的限制[4]。這項(xiàng)研究表明2D-PAGE電泳能夠產(chǎn)生全面的血清學(xué)譜，其中HBV蛋白生物標(biāo)記的變化模式不僅表現(xiàn)在量上，而且表現(xiàn)在其性質(zhì)(或特異性)上。特別是我們已經(jīng)觀察到這些生物標(biāo)記的不同同種型發(fā)生的多種變化，這尤其能夠提供信息，且對于評估HBV感染特別有用。蛋白質(zhì)組學(xué)分析為HBV診斷的常規(guī)測量和臨床研究環(huán)境進(jìn)展提供了一種特異和合適的選擇。將這些基本的血清標(biāo)記和它們特別的同種型變化結(jié)合的全局性檢測對HBV治療是有益的，因此能夠充分減少在慢性HBV感染病人中進(jìn)行的肝臟活組織檢查的數(shù)目。
V.參考文獻(xiàn)在這里引入下列在說明書中以數(shù)字形式提及的參考文獻(xiàn)作為本發(fā)明的背景參考技術(shù)，并用于提供技術(shù)狀態(tài)。Maynard.J.E.，Kane，M.A.，Alter，M.J.，inZuckerman.A.J.(Ed)Control ofhepatitis B by immunizationGlobal perspective.1988.pp.967-969.Chen，C.J.，Wang，L.Y.，Yu，M.W.，J.Gastroenterol.Hepatol. 2000，15(suppl)E3-E6.Feitelson，M.A.，Bull，Inst，Pasteur，1998，96，227-236.Chan，H.L.Y.，Hospital，Med.2002，63，16-19.Lai，C.L.，Wu，P.C.，Hong Kong Med.J.1997，3，289-296.Lau，G.K.K.，Clin.Liver Dis，2001，5，361-379.Borman，S.，Chem.Engineering News 2000，78，31-37.Hunt，D.F.，J.Proteome Res.2002，1，15-19.Jungblut，P.R.，Zimny-Arndt，U.，Stulik，J.，Koupilova，K.，Pleibner，K-P.，Otto，A.et al.Electrophoresis 1999；202100-2110.Hanash SM，Madoz-Gurpide J，Misek DE.Identification of novel targets forcancer therapy using expression proteomics.Leukemia 2002；16478-485.Srinivas PR，Srivastava S，Hanash S，Wright JrGL.Clin Chem 2001； 1901-1911.Lau G，Nanji A.Hou J，F(xiàn)ong D，Au W.Yuan S et al.Viral Hepat 2002；9(4)280-287.knodell R，Ishak K，Black W，Chen T，Craig R，Kaplowitz N et al.Hepatology1981 431-435.Urdea M，Horn S，F(xiàn)ultz T，Anderson M，Runnings J，Hamren S et al.NucleicAcids Res Symp Ser 1991 197-200.Contiero E，F(xiàn)errari R，Vaselli GM，F(xiàn)olin M.Electrophoresis，1997；18(1)122-126.Imbert-Bismut F，Ratziu V，Pleroni L，Charlotte F，Benhamou Y，Poynard T.Lancet 2001；3571069-1075。Poynard T.Imbert-Bismut F，Ratziu V，Chevret S，Jardel C，Moussalli J et al.JViral Hepat 2002；9(2)128-133.Hiramatsu S，Kojima J，Okada TT，lnai S，Ohmori K.Acfa Hepato-Gastroenterologica 1976；23(3)177-182.Meliconi R，Parracino O，F(xiàn)acchini A，Morselli-Labate AM，Bortolotti F，Tremolada F et al.Liver 1988；8(2)65-74.Borsotti M.De Philippis C，Leoncini F，Mazzotta F，Paci F，Piazza E et al.QuadSclavo Diag Clin Lab 1980；16(4)385-401.Pateva R，Koichev K，Vurbanov G，Rusinov E，Danev l.Vutreshni Bolesti 1982；21(2)65-69.Henke J，Kellner S，Kasulke D.Blut 1978；36(2)109-110.Volchkova EV，Pak SG，Malov VA，Umbetova KT.Ter Arkh 2000；72(11)18-21.Nayak SS，Ramani A，Kamath SS，Kundaje GN，Aroor AR.Biochem Med MetabBiol 1988；40(3)299-304.Matsuura T，Koga S，Ibayashi H.Gastroenterol Jpn 1988；23(4)394-400.Geiss HC，Ritter MM，Richter WO，Schwandt P，Zachoval R.Hepatology 1996；24(6)1334-1337.SelimoGlu MA，AydoGdu S，YaGci RV.Pediatr Int 2002；44(4)400-403.Panduro A，Lin-Lee YC，Chan L，Shafritz DA.Biochemistry 1990； 8430-8435.Isobe H，Sakai H，Satoh M，Sakamoto S，Koga S，Nawata H.Clin Chem Acta1990；189(3)303-311.Gravel P，Walzer C，Aubry C，Balant LP，Yersin B，Hochstrasser DF et al.Siochem Biophye Res Comm 1996；22078-85.Tso P，Liu M，Kalogeris TJ，Thomson AB.Annu Rev Nutr 2001； 231-254.Vergnes L，Taniguchi T，Omori K，Zakin MM，Ochoa A.Bioch Biophys Acta1997； 299-310.Kalopissis AD，Chambaz J.Int J Tissue React 2000； 67-78.Ostos MA，Conconi M，Vergnes L，Baroukh N，Ribalta J，Girona J et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001； 1023-1028.Duverger N，Tremp G，Caillaud JM，Emmanuel F，Castro G，F(xiàn)ruar JC et al.Science 1996； 966-968.Kalogers TJ，Rodriguez MD，Tso P.J Nutr 1997； 537S-543S.Vergnes L，Baroukh N，Lehy T，Moizo L，Bado A，Baralle M et al.FEBS Lett1999； 178-181.Quilliot D，Waiter E，Guerci B，F(xiàn)ruchart JC，Duriez P，Drouin P et al.Metabolism 2001； 1019-1024.Mlyata Y，Koga S，lbayashi H.Gastroenterol Jpn 1986； 479-485.Seishima M，Usul T，Naganawa S，Nishmura M，Moriwaki H，Muto Y et al.JGastroenterol Hepatol 1996； 746-751.Yasmin MY，Aziz B，Nazim M，Madhavan RK.Malays J Pathol 1993 147-150.Citarella F，F(xiàn)elici A，Brouwer M，Wagstaff J，F(xiàn)antoni A，Hack CE.Blood 1997 1501-1507.Van Molle W，Denecker G，Rodnguez I，Brouckaert P，Vandenabeele P，LibertC.J Immunol 1999； 5235-5241.Durr R，Caselmann WH.Arch Surg 2000；385(3)154-161.Theal RM，Scott K.Am Family Physician 1996； 2111-2119.Ortiz-Pallardo ME，Zhou H，F(xiàn)ischer HP，Neuhaus T，Sachinidis A，Vetter H et al.J Mol Med 2000； 212-216.Novoradovskaya N，Lee J，Yu ZX，F(xiàn)errans VJ，Brantly M.J Clin lnvest 1998； 2693-2701.Tung BY，Kowdley KV.Gastrenterologist 1996； 245-261.Wang JC.Annu Rev Biochem 1996； 635-692.Caron PR，Wang JC.InAndoh T，Ikeda H，Oguro M.(Eds)Molecular Biology ofDNA Topoisomerass.Boca Raton，F(xiàn)LCRC Press，1993243-263.Watanuki A，Ohwada S，F(xiàn)ukusato T，Makita F，Yamada T，Kikuchi A et al.Anticancer Res 2002； 1113-1119.Dingemans AC，van Ark-Otte J，Span S，Scagliotti GV，van der Valk P，PostmusPE et al.Lung Cancer 2001； 117-128.Dingemans AC，Witlox MA，Stallaert RA，van.der Valk P，Postmus PE.Giaccone G.Clin Cancer Res 1999； 2048-2058.Withoff S，van der Zee AG，de Jong S，Hollema H，Smit EF，Mulder NH et al.BrJ Cancer 1999； 748-753.Zhou R，Wang Y.Gruber A，Larsson R，Castanos-Velez E，Lillemark E.MedOncol 1999； 191-198.
表1.所用的HBV感染血清樣品概括。NIS指壞死性炎癥分?jǐn)?shù)
表2.HBV感染血清樣品中蛋白質(zhì)變化總結(jié)(N/D不可檢測的)
權(quán)利要求
1.一種檢測肝臟炎癥病人中存在乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法；包括(a)從病人獲取血清樣品；(b)分離存在于病人血清樣品中的蛋白質(zhì)以確定樣品中生物標(biāo)記的存在；和(c)將存在于步驟(b)中的蛋白質(zhì)和存在于正常病人對照血清樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，以確定從HBV感染病人獲得的血清樣品是否包含可指示HbV感染的發(fā)生變化的血清蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述HBV感染病人的血清樣品包含表達(dá)發(fā)生變化的載脂蛋白A.I(apoA-I)、載脂蛋白A-I片段、觸珠蛋白β鏈、觸珠蛋白切割的β鏈、觸珠蛋白2鏈、載脂蛋白A-IV(apoA-IV)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶片段/同種型或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(topo-II)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述HBV感染病人的血清樣品包含載脂蛋白A-I或其片段。
4.在肝臟炎癥病人中診斷HBV感染的血清生物標(biāo)記，其中所述血清生物標(biāo)記包含一種或多種下列已純化的蛋白載脂蛋白A-I(apoA-I)、載脂蛋白A-I片段、觸珠蛋白β鏈、觸珠蛋白切割的β鏈、觸珠蛋白2鏈、載脂蛋白A-IV(apoA-IV)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶片段/同種型或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(topo-II)。
5.在肝臟炎癥病人中診斷HBV感染的血清生物標(biāo)記，其包含有載脂蛋白A-I或其片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測乙型肝炎病毒(HBV)感染并伴有肝臟炎癥病人中發(fā)生變化的血清蛋白存在的方法，包括從病人獲取血清樣品；將樣品進(jìn)行蛋白凝膠電泳以分離其中包含的蛋白質(zhì)；用硝酸銀溶液對分離在電泳凝膠上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色；將染色蛋白質(zhì)的圖象掃描到圖象分析掃描儀中以獲取凝膠圖象；將凝膠圖象和由正常病人的血清和HBV感染并伴有肝臟炎癥病人的血清制備的對照樣品的電泳凝膠進(jìn)行對比，以確定病人的血清樣品是否包含特異性血清蛋白質(zhì)。本發(fā)明也提供了診斷HBV感染和肝臟炎癥病人的血清蛋白質(zhì)生物標(biāo)記。
文檔編號G01N33/68GK1777682SQ200480011071
公開日2006年5月24日 申請日期2004年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月25日
發(fā)明者何慶瑜, 邱政夫, 廖家杰, 周園 申請人:香港大學(xué)