專利名稱：一種免疫磁性微球及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫磁性微球，及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
免疫磁性微球技術(shù)是免疫學(xué)和磁性載體技術(shù)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。是20世紀(jì)70年代興起的一類新型材料。免疫磁性微球通常由無(wú)機(jī)磁性載體和高分子外殼組成，并在其表面化學(xué)偶聯(lián)特定的免疫配基如蛋白、抗體、抗原、凝集素等。這些免疫配基可在反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)一步識(shí)別相應(yīng)的抗體、抗原、生物素等從而達(dá)到分離或檢測(cè)目的。磁性載體具有超順磁性，即在外加磁場(chǎng)中可產(chǎn)生磁性，當(dāng)外部磁場(chǎng)消失后，無(wú)剩磁。免疫磁性微球同時(shí)具有超順磁性和生物專一性的特點(diǎn)，使固液分離更加快速簡(jiǎn)便?？墒∪ルx心。過(guò)濾等繁雜的傳統(tǒng)操作。在免疫檢測(cè)?？贵w純化、細(xì)胞分離等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有誘人的應(yīng)用前景。
現(xiàn)有技術(shù)中，免疫磁性微球多是通過(guò)活化溶脹法或單體共聚法而制得的。丹麥專利DE3836475提供了一種用多步溶脹法生產(chǎn)免疫磁性微球，可得到大小均一的顆粒。但該專利的工藝復(fù)雜，設(shè)備要求高，產(chǎn)率低。并且，由于對(duì)Fe3O4顆粒的尺寸控制要求較嚴(yán)，難以保證全部Fe3O4顆粒尺寸小于30nm，因而存在少量剩磁。單體共聚法通常是采用兩種或兩種以上單體(其中一種為功能單體)，在一定條件下聚合反應(yīng)，生成表面帶功能基團(tuán)的免疫磁性微球，主要包括乳液(無(wú)皂乳液)聚合，懸浮聚合，分散聚合和種子聚合。中國(guó)專利92105584.6采用單體共聚法制備免疫磁性微球。將Fe3O4磁粉和含功能基團(tuán)試劑的聚合單體懸浮液在水分散劑中懸浮分散，最后通過(guò)懸浮液的聚合直接得到表面含功能基團(tuán)的免疫磁性微球。該法合成的免疫磁性微球性能較好，但功能單體的含量受到限制(通常小于10％)，且大部分功能基團(tuán)被包覆在微球內(nèi)部，僅有少量的功能基團(tuán)留在表面，在進(jìn)一步的結(jié)合免疫配基中會(huì)造成偶聯(lián)效率低。因此，在免疫學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用受到很大限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的免疫磁性微球存在少量剩磁、表面功能基團(tuán)含量少、且其制備工藝復(fù)雜、設(shè)備要求高、產(chǎn)率低的缺陷，從而提供一種比飽和磁化強(qiáng)度高、無(wú)剩磁、表面功能基團(tuán)豐富、免疫配基偶聯(lián)效率高、且制備工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高的免疫磁性微球，及其制備方法和用途。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種免疫磁性微球，包括一無(wú)機(jī)磁性載體，和包覆在其外的高分子外殼，其特征在于，所述的高分子為選自甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、醋酸乙烯酯中的一種或幾種單體的聚合物，且酯基上的烷氧基被氨基取代。
所述的無(wú)機(jī)磁性載體為Fe3O4。
本發(fā)明提供一種上述免疫磁性微球的制備方法，包括如下步驟1)使用常規(guī)的化學(xué)共沉淀法制備油酸包覆的Fe3O4磁流體在氮?dú)釴2保護(hù)下，于70～90℃，將氨水或NaHCO3溶液加入摩爾比為1∶1.5～2的氯化亞鐵和三氯化鐵的水溶液，并滴加油酸，30分鐘后用磁鐵分離，并用去離子水清洗，得到油酸包覆的Fe3O4磁流體；2)乳液-懸浮聚合制備磁性聚合物微球?qū)⒉襟E1)得到的油酸包覆的Fe3O4磁流體分散在聚合物單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑中，形成油相；其中，磁流體、聚合單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑的重量份為磁流體0.5～50聚合單體 1～98交聯(lián)劑0.2～40引發(fā)劑0.1～10所述的聚合單體選自甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯中的一種或幾種；所述的交聯(lián)劑為二乙烯苯(以下簡(jiǎn)稱DVB)或甲基丙烯酸乙二醇酯(以下簡(jiǎn)稱EGDMA)；所述的引發(fā)劑為過(guò)氧化苯甲酰(以下簡(jiǎn)稱BPO)或偶氮異丁腈(以下簡(jiǎn)稱AIBN)；將5～30重量份聚乙烯醇于80℃溶于1000重量份的去離子水中形成水相；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將上述油相和水相混合后，以300～1800rpm的轉(zhuǎn)速攪拌，先在40～60℃攪拌5～90分鐘，然后在60～90℃攪拌1～12小時(shí)；冷卻，經(jīng)磁性分離、洗滌，得到磁性聚合物微球；3)氨解反應(yīng)在微球表面引入功能基團(tuán)將步驟2)制得的磁性聚合物微球、氨解試劑和N，N-二甲基甲酰胺(以下簡(jiǎn)稱DMF)以1∶1～100∶10～500(質(zhì)量比)比例混合后，在90～120℃攪拌10～24小時(shí)，冷卻，經(jīng)磁性分離、洗滌，得到本發(fā)明的免疫磁性微球；所述的氨解試劑為水合肼、乙二胺或己二胺。
本發(fā)明提供所述的免疫磁性微球在免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的免疫磁性微球可以先在其表面偶聯(lián)特定的免疫配基，如蛋白、抗體、抗原、凝集素等，然后這些免疫配基可在反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)一步識(shí)別相應(yīng)的抗體、抗原、生物素等，從而達(dá)到分離或檢測(cè)目的。或是直接利用免疫磁性微球表面的氨基，識(shí)別能與氨基反應(yīng)的抗體、抗原、生物素等。
本發(fā)明提供一種使用上述免疫磁性微球偶聯(lián)免疫配基的方法，包括如下步驟1)免疫磁性微球的活化將本發(fā)明的表面含有伯胺基團(tuán)的免疫磁性微球浸入過(guò)量的0.2～50v％(體積比濃度)戊二醛溶液中，在30℃反應(yīng)6～12小時(shí)，經(jīng)磁性分離、洗滌，得到表面含有醛基的免疫磁性微球；2)偶聯(lián)免疫配基將步驟1)得到的含有醛基的磁性微球和免疫配基的溶液混合，在30℃的搖床中反應(yīng)2～6小時(shí)，經(jīng)磁性分離，用磷酸緩沖溶液充分洗滌，得到表面偶聯(lián)免疫培基的免疫磁性微球。
所述的免疫配基為蛋白A、蛋白G或抗體、抗原、凝集素。
與已有技術(shù)的免疫磁性微球相比，本發(fā)明提供的免疫磁性微球的優(yōu)益之處在于1)微球的粒徑在0.5至8微米之間，所以該微球具有較大的比表面積，便于偶聯(lián)較多的功能配基；磁含量高，有很強(qiáng)的磁響應(yīng)性，能實(shí)現(xiàn)常規(guī)磁場(chǎng)下的快速分離；而且該尺寸大小和細(xì)胞相當(dāng)，更符合分離細(xì)胞的要求；2)通過(guò)氨解反應(yīng)在微球表面引入氨基，不會(huì)使得功能基被包覆到內(nèi)面，因而微球表面功能基團(tuán)豐富，免疫配基偶聯(lián)效率高；3)該微球具有高度的化學(xué)穩(wěn)定性和良好的生物相容性，可用于直接從原料液(如腹水，抗血清)中純化出高純度的抗體，在免疫檢測(cè)、抗體純化、細(xì)胞分離等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景；4)該微球的制備工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)率較高。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述實(shí)施例1、制備本發(fā)明的免疫磁性微球I使用常規(guī)的化學(xué)共沉淀法制備油酸包覆的Fe3O4磁流體向盛有500ml去離子水的2升攪拌式反應(yīng)器中加入0.086mol氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)和0.173mol氯化鐵(FeCl3·6H2O)，在氮?dú)釴2保護(hù)下，升溫至90℃，傾入含0.956mol NH3·H2O水溶液，并滴加油酸約15ml，繼續(xù)恒溫30min，用磁鐵分離后，經(jīng)去離子水反復(fù)清洗，得到黑色團(tuán)塊狀的油酸包覆的Fe3O4磁流體。該磁流體總重約30g，其中含F(xiàn)e3O4約10g，在透射電鏡下觀察，F(xiàn)e3O4顆粒近于球形，具有超順磁性，平均粒徑為8nm。
乳液-懸浮聚合制備磁性聚合物微球?qū)?0.0g上述油酸包覆的Fe3O4磁流體均勻分散在95g丙烯酸甲酯、5g二乙烯苯(DVB)和5g過(guò)氧化苯甲酰(BPO)中，形成油相；在一個(gè)裝有冷凝器和垂直擋流板的2升圓柱形攪拌式反應(yīng)器中，加入1000ml去離子水，25克聚乙烯醇(PVA-1788)，于80℃恒溫?cái)嚢枋筆VA完全溶解，形成水相；將上述油相和水相混合后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以1000rpm的攪拌速度，在50℃攪拌30分鐘，然后在60℃繼續(xù)攪拌1小時(shí)，最后升溫到80℃反應(yīng)2小時(shí)；冷卻，經(jīng)磁性分離，用熱水洗滌，得到磁性聚合物微球；該磁性聚合物微球具有較高的磁響應(yīng)性，比飽和磁化強(qiáng)度達(dá)到14emug-1，無(wú)剩磁，粒徑分布在1～8μm。
氨解反應(yīng)在微球表面引入功能基團(tuán)將上述磁性聚丙烯酸甲酯(PMA)微球3g、乙二胺50g和溶劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)50g混合后，加入裝有溫度計(jì)、機(jī)械攪拌器和回流冷凝管的250ml三口圓底燒瓶中，在90℃攪拌20小時(shí)，聚丙烯酸甲酯酯基上的甲氧基被-HNCH2CH2NH2取代；冷卻后，磁性分離，用去離子水洗滌，得到本發(fā)明的免疫磁性微球I，其表面含有伯胺基團(tuán)。
實(shí)施例2、制備本發(fā)明的免疫磁性微球II使用常規(guī)的化學(xué)共沉淀法制備油酸包覆的Fe3O4磁流體向盛有700ml去離子水的2升攪拌式反應(yīng)器中加入0.17mol氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)和0.34mol氯化鐵(FeCl3·6H2O)，在氮?dú)釴2保護(hù)下，升溫至70℃，傾入56ml25％的NaHCO3水溶液，并滴加油酸約20ml，繼續(xù)恒溫直至上層液澄清，用磁鐵分離后，經(jīng)去離子水反復(fù)清洗，得到黑色團(tuán)塊狀的油酸包覆的Fe3O4磁流體。該磁流體總重約60g，其中含F(xiàn)e3O4約20g，在透射電鏡下觀察，F(xiàn)e3O4顆粒近于球形，具有超順磁性，平均粒徑為12nm。
乳液-懸浮聚合制備磁性聚合物微球?qū)?0.0g上述油酸包覆的Fe3O4磁流體均勻分散在98g甲基丙烯酸甲酯、40g二乙烯苯(DVB)和10g過(guò)氧化苯甲酰(BPO)中，形成油相；在一個(gè)裝有冷凝器和垂直擋流板的2升圓柱形攪拌式反應(yīng)器中，加入1000ml去離子水，30克聚乙烯醇(PVA-1788)和0.1克亞甲基藍(lán)(阻聚劑)，于80℃恒溫?cái)嚢枋筆VA完全溶解，形成水相；將上述油相和水相混合后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以300rpm的攪拌速度，在40℃攪拌90分鐘，然后在90℃繼續(xù)攪拌12小時(shí)；冷卻，經(jīng)磁性分離，用熱水洗滌，得到磁性聚合物微球；該磁性聚合物微球具有較高的磁響應(yīng)性，比飽和磁化強(qiáng)度達(dá)到17emug-1，無(wú)剩磁，粒徑分布在1～8μm。
氨解反應(yīng)在微球表面引入功能基團(tuán)將上述磁性聚甲基丙烯酸甲酯微球2g、己二胺2g和溶劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)20g混合后，加入裝有溫度計(jì)、機(jī)械攪拌器和回流冷凝管的250ml三口圓底燒瓶中，在110℃攪拌24小時(shí)，聚甲基丙烯酸甲酯酯基上的甲氧基被-HN(CH2)6NH2取代；冷卻后，磁性分離，用去離子水洗滌，得到本發(fā)明的免疫磁性微球II，其表面含有伯胺基團(tuán)。
實(shí)施例3、制備本發(fā)明的免疫磁性微球III使用常規(guī)的化學(xué)共沉淀法制備油酸包覆的Fe3O4磁流體向盛有600ml去離子水的2升攪拌式反應(yīng)器中加入0.20mol氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)和0.40mol氯化鐵(FeCl3·6H2O)，在氮?dú)釴2保護(hù)下，升溫至80℃，傾入65ml含氨水溶液，并滴加油酸約35ml，繼續(xù)恒溫直至上層液澄清，用磁鐵分離后，經(jīng)去離子水反復(fù)清洗，得到黑色團(tuán)塊狀的油酸包覆的Fe3O4磁流體。該磁流體總重約75g，其中含F(xiàn)e3O4約24g，在透射電鏡下觀察，F(xiàn)e3O4顆粒近于球形，具有超順磁性，平均粒徑為18nm。
乳液-懸浮聚合制備磁性聚合物微球?qū)?.5g上述油酸包覆的Fe3O4磁流體均勻分散在1g甲基丙烯酸羥乙酯、0.2g甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和0.1g偶氮異丁腈(AIBN)中，形成油相；在一個(gè)裝有冷凝器和垂直擋流板的2升圓柱形攪拌式反應(yīng)器中，加入1000ml去離子水，5克聚乙烯醇(PVA-1788)，于80℃恒溫?cái)嚢枋筆VA完全溶解，形成水相；將上述油相和水相混合后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以1800rpm的攪拌速度，在60℃攪拌5分鐘，然后在80℃繼續(xù)攪拌6小時(shí)；冷卻，經(jīng)磁性分離，用熱水洗滌，得到磁性聚合物微球；該磁性聚合物微球具有較高的磁響應(yīng)性，比飽和磁化強(qiáng)度達(dá)到14emug-1，無(wú)剩磁，粒徑分布在1～8μm。
氨解反應(yīng)在微球表面引入功能基團(tuán)將上述磁性聚甲基丙烯酸乙二醇酯微球2g、水合肼200g和溶劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)1000g混合后，加入裝有溫度計(jì)、機(jī)械攪拌器和回流冷凝管的250ml三口圓底燒瓶中，在120℃攪拌10小時(shí)，聚甲基丙烯酸乙二醇酯酯基上的乙二醇酯氧基被-HNNH2·H2O取代；冷卻后，磁性分離，用去離子水洗滌，得到本發(fā)明的免疫磁性微球III，其表面含有伯胺基團(tuán)。
實(shí)施例4、使用本發(fā)明的免疫磁性微球I偶聯(lián)免疫配基免疫磁性微球的活化將1.0g實(shí)施例1得到的表面含有伯胺基團(tuán)的免疫磁性微球I浸入50ml的5v％(體積比濃度)戊二醛溶液中，于30℃在搖床中振蕩反應(yīng)6小時(shí)，振蕩速率為200rpm，經(jīng)磁性分離，用去離子水充分洗滌，得到表面含有醛基的免疫磁性微球；偶聯(lián)免疫配基將此含有醛基的免疫磁性載體微球5mg于1.5ml的離心管中，加入1ml的濃度為1mg/ml的蛋白A溶液，于30℃的搖床中振蕩反應(yīng)3小時(shí)，偶聯(lián)蛋白A結(jié)束后，用濃度為10mg/ml的牛血清白蛋白BSA封堵0.5小時(shí)，經(jīng)磁性分離，用磷酸緩沖溶液充分洗滌，得到表面偶聯(lián)蛋白A的免疫磁性微球。
實(shí)施例5、使用本發(fā)明的免疫磁性微球II偶聯(lián)免疫配基免疫磁性微球的活化將3.0g實(shí)施例2得到的表面含有伯胺基團(tuán)的免疫磁性微球II浸入30ml的50v％(體積比濃度)戊二醛溶液中，于30℃在搖床中振蕩反應(yīng)12小時(shí)，振蕩速率為200rpm，經(jīng)磁性分離，用去離子水充分洗滌，得到表面含有醛基的免疫磁性微球；偶聯(lián)免疫配基將此含有醛基的免疫磁性微球100mg于50ml的錐型瓶中，加入20ml的濃度為5mg/ml的蛋白G溶液，于30℃的搖床中振蕩反應(yīng)2小時(shí)，偶聯(lián)蛋白G結(jié)束后，用濃度為10mg/ml的牛血清白蛋白BSA封堵0.5小時(shí)，經(jīng)磁性分離，用磷酸緩沖溶液充分洗滌，得到表面偶聯(lián)蛋白G的免疫磁性微球。
實(shí)施例6、使用本發(fā)明的免疫磁性微球III偶聯(lián)免疫配基免疫磁性微球的活化將3.0g實(shí)施例3得到的表面含有伯胺基團(tuán)的免疫磁性微球III浸入1000ml的0.2v％(體積比濃度)戊二醛溶液中，于30℃在搖床中振蕩反應(yīng)10小時(shí)，振蕩速率為200rpm，經(jīng)磁性分離，用去離子水充分洗滌，得到表面含有醛基的免疫磁性微球；偶聯(lián)免疫配基將此含有醛基的免疫磁性微球100mg于50ml的錐型瓶中，加入20ml的濃度為5mg/ml的小鼠IgG2a抗體溶液，于30℃的搖床中振蕩反應(yīng)6小時(shí)，偶聯(lián)IgG2a抗體結(jié)束后，用濃度為10mg/ml的牛血清白蛋白BSA封堵0.5小時(shí)，經(jīng)磁性分離，用磷酸緩沖溶液充分洗滌，得到表面偶聯(lián)IgG2a抗體的免疫磁性微球。
權(quán)利要求
1.一種免疫磁性微球，包括一無(wú)機(jī)磁性載體，和包覆在其外的高分子外殼，其特征在于，所述的高分子為選自甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、醋酸乙烯酯中的一種或幾種單體的聚合物，且酯基上的烷氧基被氨基取代。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫磁性微球，其特征在于，所述的無(wú)機(jī)磁性載體為Fe3O4。
3.一種權(quán)利要求1所述的免疫磁性微球的制備方法，包括如下步驟1)使用常規(guī)的化學(xué)共沉淀法制備油酸包覆的Fe3O4磁流體；2)乳液—懸浮聚合制備磁性聚合物微球?qū)⒉襟E1)得到的油酸包覆的Fe3O4磁流體分散在聚合物單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑中，形成油相；其中，磁流體、聚合單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑的重量份為磁流體 0.5～50聚合單體1～98交聯(lián)劑 0.2～40引發(fā)劑 0.1～10所述的聚合單體選自甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯中的一種或幾種；將5～30重量份聚乙烯醇于80℃溶于1000重量份的去離子水中形成水相；在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將上述油相和水相混合后，以300～1800rpm的轉(zhuǎn)速攪拌，先在40～60℃攪拌5～90分鐘，然后在60～90℃攪拌1～12小時(shí)；冷卻，經(jīng)磁性分離、洗滌，得到磁性聚合物微球；3)氨解反應(yīng)在微球表面引入功能基團(tuán)將步驟2)制得的磁性聚合物微球、氨解試劑和N，N-二甲基甲酰胺以1∶1～100∶10～500的質(zhì)量比例混合后，在90～120℃攪拌10～24小時(shí)，冷卻，經(jīng)磁性分離、洗滌，得到本發(fā)明的免疫磁性微球。
4.如權(quán)利要求3所述的免疫磁性微球的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中的交聯(lián)劑為二乙烯苯或甲基丙烯酸乙二醇酯。
5.如權(quán)利要求3所述的免疫磁性微球的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中的引發(fā)劑為過(guò)氧化苯甲酰或偶氮異丁腈。
6.如權(quán)利要求3所述的免疫磁性微球的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中的氨解試劑為水合肼、乙二胺或己二胺。
7.一種權(quán)利要求1所述的免疫磁性微球在免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
8.一種使用權(quán)利要求1所述的免疫磁性微球偶聯(lián)免疫配基的方法，包括如下步驟1)免疫磁性微球的活化將權(quán)利要求1所述的免疫磁性微球浸入過(guò)量的0.2～50v％戊二醛溶液中，在30℃反應(yīng)6～12小時(shí)，經(jīng)磁性分離、洗滌，得到表面含有醛基的免疫磁性微球；2)偶聯(lián)免疫配基將步驟1)得到的含有醛基的免疫磁性微球和免疫配基的溶液混合，在30℃的搖床中反應(yīng)2～6小時(shí)，經(jīng)磁性分離，用磷酸緩沖溶液充分洗滌，得到表面偶聯(lián)免疫配基的免疫磁性微球。
9.如權(quán)利要求8所述的免疫磁性微球偶聯(lián)免疫配基的方法，其特征在于，所述的免疫配基為蛋白A、蛋白G或抗體、抗原、凝集素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫磁性微球，其為將化學(xué)共沉淀法制備的油酸包覆的Fe
文檔編號(hào)G01N33/544GK1667413SQ20041000656
公開日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2004年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月9日
發(fā)明者劉先橋, 官月平, 馬志亞, 劉會(huì)洲, 楊宇, 吳小兵 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所