專利名稱：一種快速檢測甲狀腺干擾物的方法－非洲爪蟾尾吸收試驗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲狀腺干擾物和體外培養(yǎng)方法，具體說是檢測甲狀腺干擾物的方法。
近年來發(fā)現(xiàn)環(huán)境中一些污染物能夠影響甲狀腺的結(jié)構(gòu)和功能，干擾甲狀腺系統(tǒng)的正常作用，從而導(dǎo)致生物體生長發(fā)育及行為的異常，這類污染物即所說的甲狀腺干擾物。大量野外研究表明一些野生動物，象鳥類、魚類甲狀腺結(jié)構(gòu)和功能的異常與環(huán)境中的甲狀腺干擾物有關(guān)。實驗室研究證明許多污染物，如多氯聯(lián)苯(PCBs)、多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)、DDE、馬拉硫磷、乙草胺等有甲狀腺干擾活性。從理論上講，這些甲狀腺干擾物可通過以下環(huán)節(jié)引發(fā)干擾作用1.引起甲狀腺結(jié)構(gòu)的變化；2.干擾TH的分泌；3.影響TH的代謝和轉(zhuǎn)運；4.干擾TH與TR的結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄激活。目前的研究多集中在由前三種途徑介導(dǎo)的甲狀腺干擾上。已有的幾種檢測甲狀腺干擾物的方法，如甲狀腺結(jié)構(gòu)的觀察、TH水平的測定等，都是針對前三種途徑介導(dǎo)的甲狀腺干擾作用設(shè)計的，而無法檢測出通過第4種途徑實現(xiàn)干擾作用的物質(zhì)。另外美國內(nèi)分泌干擾物篩查和確證顧問委員會(EDSTAC)建議的一種蛙14天變態(tài)試驗，也是通過對變態(tài)的影響來評價甲狀腺干擾作用的。這種方法對那些通過第4種途徑實現(xiàn)干擾作用的物質(zhì)可能也是不敏感的。而最近有研究表明一些甲狀腺干擾物正是通過干擾TH與TR的結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄激活途徑實現(xiàn)干擾作用。所以，建立一種針對這類甲狀腺干擾物的檢測方法是目前急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種體外檢測甲狀腺干擾物的方法，本方法專門針對通過干擾TH與TR的結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄激活途徑實現(xiàn)干擾甲狀腺作用的干擾物。本方法用非洲爪蟾蝌蚪的尾作材料，用甲狀腺素體外誘導(dǎo)其吸收，同時暴露測試物，并保持測試物的濃度，每天記錄尾的長度，最后分析測試物暴露組尾吸收的情況與對照組的不同，以對測試物的甲狀腺干擾作用進(jìn)行評價。本方法的優(yōu)勢表現(xiàn)為1.試驗材料易得。非洲爪蟾終生生活在水中，在實驗室容易飼養(yǎng)；終年可以孵卵繁殖，而且每次產(chǎn)卵很多；2.尾可在體外培養(yǎng)，并能在T3的誘導(dǎo)下吸收，表現(xiàn)為長度縮短；3.本方法的可操作性強，終點指標(biāo)尾的吸收率數(shù)據(jù)容易獲取。4.本方法專門針對通過干擾TH與TR的結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄激活途徑實現(xiàn)干擾甲狀腺作用的干擾物，特異性強。
具體實施例方式
性成熟的雌蛙、雄蛙隔離喂養(yǎng)，室溫保持在22±2℃。每周喂兩次豬肝換一次水。飼養(yǎng)用水為活性炭除氯的自來水。晚上雌蛙腹腔注射700IU HCG，雄蛙注射300 IUHCG，放入孵化缸。次日凌晨抱對產(chǎn)卵，產(chǎn)卵完畢移出親蛙，靜置孵化。室溫保持在22±2℃，明暗光周期12小時12小時。第5天后開始喂蝦卵，每天喂2次，每4天換一次水。選擇處于53-55階段的蝌蚪，要求大小整齊。在干凈的除氯水中游泳兩小時，然后轉(zhuǎn)移至含0.1％磺胺的除氯水中，2小時后滅菌的蒸餾水沖洗，用手術(shù)刀齊身將尾切下置含1640培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。1640培養(yǎng)液含1mM谷胺酰胺，1nM-1μM甲狀腺素，2％碳酸氫鈉，100μg/L鏈霉素，50μg/L青霉素，2μg/L兩性霉素，PH值7.2，滲透壓調(diào)整到兩棲動物的滲透壓。每孔含5ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)2條尾，每個測試物濃度需12條尾。當(dāng)下測得的尾長為原始尾長。然后將培養(yǎng)板放二氧化碳培養(yǎng)箱中23℃，5％CO2培養(yǎng)。每2天換一次培養(yǎng)液，每天測一次尾長。終點測試指標(biāo)為每天尾長度占原始尾長的百分比，即尾的吸收率。最后用one-way ANOVA統(tǒng)計方法做差異顯著性分析(P＜0.05)。如果通過統(tǒng)計分析顯示，同一時間測試物組的尾吸收率明顯高于或低于對照組，則表明測試物促進(jìn)或抑制了尾的吸收，通過干擾TH與TR的結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄激活途徑干擾了甲狀腺作用。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測甲狀腺干擾物的方法—非洲爪蟾尾吸收試驗。
2.權(quán)利要求1所指的方法所使用的材料為非洲爪蟾蝌蚪。
3.權(quán)利要求1所指的方法其終點測試指標(biāo)為尾的吸收率。
4.權(quán)利要求1所指的方法其體外誘導(dǎo)尾吸收所用的甲狀腺素濃度為1nM-1μM。
5.權(quán)利要求1所指的方法用于檢測甲狀腺干擾物及甲狀腺干擾機(jī)制的研究。
全文摘要
本發(fā)明提供一種快速檢測甲狀腺干擾物的方法它以53－55階段的非洲爪蟾蝌蚪的尾作試驗材料，用甲狀腺激素誘導(dǎo)其吸收縮短，同時予以測試物暴露處理，通過比較測試物暴露組的尾的縮短情況與對照組的不同，評價測試物的甲狀腺干擾活性。此方法的優(yōu)點是能夠快速評價測試物的甲狀腺系統(tǒng)干擾活性，并且專門針對通過干擾TH與TR的結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄激活途徑實現(xiàn)干擾甲狀腺作用的干擾物，具有一定的敏感性。
文檔編號G01N33/50GK1661369SQ20041000459
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月24日
發(fā)明者秦占芬, 周景明, 徐曉白 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心