專利名稱：Sars抗體篩選多肽芯片的制備與檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
所屬領(lǐng)域本實用新型涉及一種SARS冠狀病毒性肺炎(非典型性肺炎，SARS)抗體多肽蛋白芯片的制備和快速篩選檢測試劑盒，是將SARS病毒蛋白抗原決定族部分的多肽片段陣列固定，制成蛋白芯片，用于檢測SARS病人血清中抗體。該檢測芯片及其試劑盒采用18個特異的SARS多肽片段，可以篩選SARS病人血清中可能出現(xiàn)的特異的IgG或IgM抗體，可用于臨床上SARS病人的快速篩查。該芯片采用酶標(biāo)顯色技術(shù)，肉眼可直接觀察結(jié)果，不需特殊儀器設(shè)備，適宜于現(xiàn)場篩選檢查。
背景技術(shù)：
歷史上傳染病的大規(guī)模爆發(fā)，它不僅奪去了數(shù)以億計的人的生命，并在短期內(nèi)給社會經(jīng)濟造成嚴(yán)重破壞。歷史上大規(guī)模爆發(fā)的傳染病，曾給人類社會帶來巨大創(chuàng)痛。公元6世紀(jì)，在東羅馬帝國爆發(fā)的瘟疫肆虐了50年之久，造成上億人死亡；1348～1351年在歐洲爆發(fā)的黑死病，三年時間奪去了6200萬人的生命，幾乎占當(dāng)時歐洲人口的1/4；1918年9月～1919年6月，在美國爆發(fā)的流感，10個月內(nèi)造成世界范圍內(nèi)4000萬人以上的死亡；1980年后出現(xiàn)的艾滋病迄今已經(jīng)奪去超過2500萬人的生命......。
2003年年初，中國內(nèi)地24個省區(qū)市先后發(fā)生非典型肺炎(SARS冠狀病毒性肺炎，Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS；嚴(yán)重急性呼吸綜合癥)疫情，共波及266個縣和市(區(qū))，累計報告非典型肺炎臨床診斷病例5327例，治愈出院4959例，死亡349例。這場突如其來的疫病災(zāi)害，嚴(yán)重威脅了人民健康和生命安全，也影響了我國經(jīng)濟發(fā)展、社會穩(wěn)定和對外交往，造成了巨大損失，據(jù)遠東經(jīng)濟評論估計，由SARS引起的直接經(jīng)濟損失超過39億美元。
因此，對爆發(fā)性SARS傳染病的控制，早期的明確診斷非常關(guān)鍵。這種早期快速、大規(guī)模的篩選技術(shù)，是預(yù)防和控制爆發(fā)性SARS冠狀病毒性肺炎的重要手段，有了這些手段，就可以及時隔離、治療確診病例，并及時排除疑似病例、減少被隔離的人數(shù)，較少經(jīng)濟損失。
SARS冠狀病毒的檢測主要有兩大類1.RT-PCR直接檢測SARS病毒通過逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)可檢查出病人各種標(biāo)本如血、便、呼吸道分泌物或組織中的SARS冠狀病毒(SARS-CoV)特有的RNA。有效的陽性PCR結(jié)果提示標(biāo)本存在SARS-CoV的基因物質(zhì)核糖核酸(RNA)。
2.滅活SARS病毒直接檢測病人血清抗體在感染過程中，出現(xiàn)不同類型的抗體(IgM和IgG)，抗體水平也發(fā)生變化。感染的早期可能測不到抗體。SARS發(fā)病1-2周后，可在血清出現(xiàn)可檢測到的抗體，疾病治愈后通常仍能測到IgG。SARS抗體的檢測主要有以下方法——酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)該試驗可測SARS病人血清IgM和IgG的混合物，并可能在發(fā)病后21天左右產(chǎn)生陽性結(jié)果。
——免疫熒光分析(IFA)這需要把SARS-CoV感染的細胞固定在顯微鏡的載玻片上；病人抗體與病毒抗原結(jié)合，然后用免疫熒光顯微鏡測由免疫熒光素標(biāo)記的抗人IgG或IgM或兩者的二抗。發(fā)病后約10天IFA產(chǎn)生典型的陽性結(jié)果。通過病人血清連續(xù)滴定，可對結(jié)果進行定量。
現(xiàn)有SARS病原體或抗體檢測技術(shù)存在以下不足1)RT-PCR檢測方法，盡管現(xiàn)存的PCR試驗有時高度敏感，但其并不能確定地排除病人SARS病毒的存在。反之，實驗室污染的標(biāo)本可導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
2)酶聯(lián)免疫吸附分析和免疫熒光分析，均需要病原體的抗原物質(zhì)，因此對SARS病毒的采集和培養(yǎng)相當(dāng)困難，只有在極少數(shù)實驗室才能完成?；谠撛?，利用病原體的檢測方法很難在現(xiàn)場使用。
為了克服現(xiàn)有檢測技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明采用SARS病毒蛋白抗原決定族部分的多肽片段作為固定相，制成蛋白芯片，集成檢測篩選SARS抗體。本發(fā)明收集來18種SARS多肽，可以同時篩選或檢測病人體液中的IgG和IgM抗體，由于采用的酶標(biāo)顯色技術(shù)，還可以實現(xiàn)快速的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本實用新型提供了一種SARS冠狀病毒(SARS)多肽蛋白芯片和檢測試劑盒。
一方面，本實用新型提供了一種SARS冠狀病毒多肽蛋白芯片，它包括(a)膜片，所述的膜片是硝酸纖維膜或尼龍膜；(b)陣列式固定在所述膜片上的SARS病毒蛋白抗原決定族部分的多肽片段。
在另一優(yōu)選例中，所述的SARS病毒蛋白是S蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述的SARS病毒蛋白是M蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所選擇的SARS病毒蛋白是N蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述的SARS病毒蛋白抗原決定族部分的多肽片段選自下組N1多肽對應(yīng)于N蛋白第21-44位，序列為PTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQ；N2多肽對應(yīng)于N蛋白第138-160位，序列為GALNTPKDHIGTRNPNNNAATVL；M1多肽對應(yīng)于M蛋白第3-22位，序列為DNGTITVEELKQLLEQWNLV；M2多肽對應(yīng)于M蛋白第145-166位，序列為RGHLRMAGHSLGRCDIKDLPKE；M3多肽對應(yīng)于M蛋白第190-210位，序列為SGFAAYNRYRIGNYKLNTDHA；S1多肽對應(yīng)于S蛋白第34-54位，序列為TSSMRGVYYPDEIFRSDTLYL；S2多肽對應(yīng)于S蛋白第94-113位，序列為KSNVVRGWVFGSTMNNKSQS；S3多肽對應(yīng)于S蛋白第197-216位，序列為YKGYQPIDVVRDLPSGFNTL；S4多肽對應(yīng)于S蛋白第273-293位，序列為TDAVDCSQNPLAELKCSVKSF；S5多肽對應(yīng)于S蛋白第297-316位，序列為KGIYQTSNFRVVPSGDVVRF；S6多肽對應(yīng)于S蛋白第332-351位，序列為TKFPSVYAWERKKISNCVAD；S7多肽對應(yīng)于S蛋白第436-455位，序列為YNYKYRYLRHGKLRPFERDI；S8多肽對應(yīng)于s蛋白第540-559位，序列為PSSKRFQPFQQFGRDVSDFT；S9多肽對應(yīng)于S蛋白第731-753位，序列為CANLLLQYGSFCTQLNRALSGIA；S10多肽對應(yīng)于S蛋白第758-780位，序列為RNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFG。
在另一優(yōu)選例中，所述的膜片是硝酸纖維素膜，并且所述的硝酸纖維素膜固定于玻片或培養(yǎng)板上；或者所述的膜片是尼龍膜，所述的尼龍膜附著在玻片上。
在另一優(yōu)選例中，所述的膜片是10mm×12mm或1.5mm×2.5mm的硝酸纖維膜。
在另一優(yōu)選例中，所述的膜片上同時固定有以下SARS病毒蛋白多肽片段N1、N2、M1、M2、M3、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10。
在另一優(yōu)選例中，在膜片上還設(shè)有陽性對照陰性對照點樣區(qū)，并且在所述的陽性對照陰性對照點樣區(qū)分別固定有人Ig質(zhì)控血清、人IgG、羊抗人IgG、BSA。
另一方面，本實用新型還提供了一種SARS抗體檢測試劑盒，其特征在于，它含有本實用新型上述的SARS冠狀病毒多肽蛋白芯片和操作說明書。
本實用新型的芯片采用陣列固定SARS病毒蛋白抗原決定族部分的多肽片段，用來篩選SARS病人血清中IgG或IgM抗體，該SARS病毒多肽芯片制備與檢測包括以下過程A)候選SARS病毒蛋白抗原的選擇，并應(yīng)用特定軟件對SARS病毒蛋白進行抗原決定族的預(yù)測分析、合成多肽抗原片段；B)多肽抗原陣列設(shè)計和固定，將SARS多肽陣列于玻片或硝酸纖維膜表面；C)將芯片與被檢血清孵育，讓IgG或IgM與特異性的SARS多肽結(jié)合，再用熒光或酶標(biāo)記的兔、羊、馬等抗人IgG或IgM抗體與之反應(yīng)，若被檢血清中有相應(yīng)的Ig存在，便在相應(yīng)的SARS多肽位點出現(xiàn)被檢信號。
在一優(yōu)選例中，將18種SARS病毒蛋白多肽制成一種蛋白芯片，可以同時測定SARS病人血清中18種特異抗體，可用于臨床上SARS病人的快速篩查。
在另一優(yōu)選例中，芯片采用酶標(biāo)顯色技術(shù)，肉眼可直接觀察結(jié)果。
本發(fā)明根據(jù)抗原抗體特異識別的原理，采用計算機預(yù)測抗原決定族的方法，提取SARS病毒表面蛋白的抗原決定族部分，合成多個相應(yīng)的多肽片段。并將SARS病毒表面可能具有抗原決定族的多肽片段以陣列方式，以機器噴點或手工點樣的方式排列在約10mm×12mm或1.5mm×2.5mm的硝酸纖維膜上，硝酸纖維膜片則固定在玻片、12孔培養(yǎng)板或6孔細胞培養(yǎng)板的孔底面，經(jīng)固定處理后，加入被檢的SARS病人的血清，經(jīng)酶標(biāo)顯色，肉眼觀察結(jié)果。
本發(fā)明采用了人工合成的抗原多肽，避免使用具有傳染性的病毒作為檢測抗原，可以在獲得病毒基因序列后立即進行分析預(yù)測，合成抗原決定族多肽片段，可以在短時間內(nèi)建立病毒的篩選方法。
以下根據(jù)附圖和實施例詳細說明本發(fā)明的具體實施方法。


圖1.SARS病毒結(jié)構(gòu)圖2.SARS蛋白抗原決定族分析結(jié)果圖3.SARS多肽芯片構(gòu)造圖4.SARS多肽芯片檢測結(jié)果的示意圖圖5.SARS多肽篩選蛋白芯片試劑盒一個實例的示意圖圖例1 蛋白預(yù)測的Coil結(jié)構(gòu) 9 固定在芯片上的人IgG、IgM2 N-糖蛋白結(jié)構(gòu)10 質(zhì)控位點(人Ig質(zhì)控血清)3 預(yù)測的抗原決定族結(jié)構(gòu)11 質(zhì)控位點(人IgG)4 與二抗連接的標(biāo)記物 12 質(zhì)控位點(羊抗人IgG)5 羊抗人第二抗體 13 S7陽性6 被檢測的SARS抗體14 S2陽性(IgG，IgM)
7 固定在芯片上的多肽片段15 S6陽性8 芯片基片 16 S10陽性具體實施方法1.SARS病毒蛋白多肽片段的選擇1)S蛋白S蛋白(Spike蛋白)是膜蛋白(圖1)，其構(gòu)成病毒的包膜子粒，是病毒感染宿主細胞的主要成分。冠狀病毒要感染細胞，首先要將其遺傳物質(zhì)RNA導(dǎo)入到宿主細胞中，這一過程主要是通過S蛋白來完成的。一個冠狀病毒顆粒在膜上一般包括200個左右S蛋白分子，這些S蛋白的突起是其與受體相互作用和膜融合的關(guān)鍵部位。利用PSORT(蛋白質(zhì)亞細胞定位預(yù)測軟件，http//psort.cbi.pku.edu.ch/)分析發(fā)現(xiàn)，此蛋白含有信號肽，位于13-14之間；含有跨膜區(qū)，位于1202-1218之間；膜拓撲結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白屬于第一類膜蛋白(N端在外)；在亞細胞定位上此蛋白有67％的可能性是屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體蛋白，有22％的可能性為胞外蛋白。
2)M蛋白M蛋白是冠狀病毒外膜最主要的成分(圖1)，盡管不同病毒的M蛋白在序列上變化很大，但在蛋白整體的化學(xué)性質(zhì)上則存在很大的保守性。其一般特征是3個疏水域以及伴隨交叉出現(xiàn)的親水域。C端(M蛋白的一半左右)大部分為兩性的氨基酸殘基，但其末端為親水氨基酸。利用PSORT分析此蛋白含有3個跨膜區(qū)，位于21-37，50-66，79-95之間；膜拓撲結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白屬于第3類膜蛋白，即整合膜蛋白，且C端位于病毒內(nèi)部；在亞細胞定位上此蛋白有89％的可能性是屬于分泌途徑蛋白。
3)N蛋白N蛋白是冠狀病毒中另一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白(圖1)。在冠狀病毒顆粒中，N蛋白處于病毒顆粒的核心部分，以與基因組RNA結(jié)合的形式存在。N蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)區(qū)第二大的編碼蛋白，長度為423個氨基酸。
2.SARS病毒蛋白多肽免疫原性分析SARS病毒表面具有多個主要多肽折疊部分，其中部分多肽可能為構(gòu)成病毒殼蛋白的主要抗原多肽，可誘生中和抗體。因此可以應(yīng)用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件進行分析，預(yù)測蛋白質(zhì)的抗原決定族部分(圖2)。
應(yīng)用分析軟件對上述SARS蛋白序列進行分析，找出可能暴露在病毒細胞外的病毒蛋白部分，并應(yīng)用抗原決定族分析設(shè)計相應(yīng)抗原決定族多肽片段。
例如對S蛋白的抗原決定族的預(yù)測(圖2)，圖2選取了S蛋白的前300氨基酸進行分析。圖中Pred表示二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，H是helix，E是sheet，C是螺旋結(jié)構(gòu)或者環(huán)狀結(jié)構(gòu)1；Conf示二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的可信度，數(shù)字9表示最大，數(shù)字0表示最小。Loca表示殘基位于表面還是內(nèi)部的預(yù)測結(jié)果，h表示內(nèi)藏，e表示外露。AA表示氨基酸殘基，帶虛線框3是預(yù)測的抗原決定簇，帶實線框2的是N-glycosylation位點。所以，在螺旋結(jié)構(gòu)，帶虛線框，和帶實線框比較密集的地方，可能就是潛在的抗原決定簇部分，截取抗原決定族部分的共11-20個氨基殘基的多肽片段，進行合成。
多肽合成SARS多肽的合成主要是根據(jù)Fmoc固相肽合成技術(shù)，儀器可選用EcosynD-3000 DNA合成儀(Eppendorf Biotronik Maintal)或Expedite 8909核酸合成系統(tǒng)(Applied Biosystem)，使用這些儀器合成，操作非常簡單，只要在將試劑加到機器之前將溶劑加到氨基酸單體和激活體即可。在商用系統(tǒng)中，這些試劑均包裝成試劑盒，按照操作說明操作即可。本發(fā)明所使用的多肽均為商業(yè)服務(wù)公司合成。
SARS多肽點樣構(gòu)建蛋白芯片多肽芯片的制作采用標(biāo)準(zhǔn)玻片或6孔、12孔細胞培養(yǎng)板等為支撐物，玻片表面有醛基修飾，或粘貼硝酸纖維膜，在玻片的一段可以留有標(biāo)簽的位置，標(biāo)簽上有生產(chǎn)公司名稱，芯片名稱以及目前通用的條形碼記錄。多肽和陽性對照陰性對照點樣區(qū)域位于膜的中央，其大小視探計數(shù)量和探針之間的間距而定。本案采取中密度點樣技術(shù)，其點樣區(qū)域在2×2.5cm左右，點直徑2mm左右，點間距3mm左右。為減少點樣的誤差，一般每個探針重復(fù)2～4次，這種格式的固定有利于開發(fā)相應(yīng)的分析軟件和程序。
應(yīng)用三維點樣機器人點樣法，是將預(yù)先制備好的SARS多肽溶液，通過由陣列點樣機(arrayer)，準(zhǔn)確、快速地將不同SARS多肽樣品定量點樣于經(jīng)過硝酸纖維膜粘貼的玻片或培養(yǎng)板上，再經(jīng)封閉、漂洗、干燥等過程制成SARS多肽蛋白芯片。點樣的方式分兩種，其一為接觸式點樣，即點樣針直接與固相支持物表面接觸，將SARS多肽樣品留在固相支持物上；其二為非接觸式點樣，即噴點，它是以壓電原理將蛋白質(zhì)樣品通過毛細管直接噴至固相支持物表面。點樣機器人有一套計算機控制三維移動裝置、多個打印/噴印頭、一個減震底座，上面可放內(nèi)盛蛋白探針的多孔板(384孔)和多個芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。
標(biāo)準(zhǔn)化的SARS多肽溶液，一般用50mM PBS(pH7.0)調(diào)節(jié)到1mg/ml的濃度。稀釋后將SARS多肽(3-10μl)加到微孔板內(nèi)，啟動點樣機器人進行點樣。高密度點樣機(如Cartesian Technology公司的MicroSys 5100小型臺式芯片工作站；PixSys 5500 PA Workstation)可以制造每平方厘米2500探針的芯片；而中密度點樣機(噴印機)可以在每平方厘米上排列25-400個探針。為了防止點樣的誤差，一般SARS多肽需點樣2-4次。
可以采用S&S公司的CAST Slides(Cat.No.10484181)將SuperCharge正電荷尼龍膜附著在玻片上，這種特殊的玻片綜合了尼龍膜的高親和力和玻片剛性的優(yōu)點，而FAST Slides(Cat.No.10484182)則是在玻片表面包被一種硝酸纖維膜材料，能與蛋白質(zhì)以非共價但是不可逆的方式結(jié)合。由于表面包被層的多孔性和厚度使單位面積的蛋白質(zhì)結(jié)合能力比常規(guī)化學(xué)表面處理玻片要高得多，使得檢測更加靈敏。
如果缺乏點樣機器人，也可采用手工方法進行點樣，一般用微量移液器取0.3-0.5μl SARS多肽溶液點于硝酸纖維膜的指定部位。
芯片檢測原理圖3表示SARS多肽芯片的檢測原理。在本發(fā)明的檢測方法中，檢測位點是將SARS多肽物質(zhì)7按一定排列順序排列在芯片表面，與病人血清孵育時，抗SARS病毒的抗體6與芯片表面上的相應(yīng)的多肽7特異性結(jié)合，由于抗SARS抗體是人源性的，可以利用FITC或酶標(biāo)記4的羊抗人抗體5進行檢測，出現(xiàn)陽性信號?？刂莆稽c是將人IgG或IgM 9直接固定在芯片的表面，或者利用羊抗人抗體9固定在芯片表面，當(dāng)被檢測血清中有相應(yīng)的IgG或IgM6存在時，就會在相應(yīng)的控制位點出現(xiàn)陽性信號，從而可以排除因操作不當(dāng)而出現(xiàn)的假陰性的結(jié)果。
芯片與SARS病人血清的孵育熒光標(biāo)記掃描方法A.取20-30μl對照和各種稀釋度(1∶10至1∶100)病人血清，加到SARS多肽陣列區(qū)。
B.在濕盒內(nèi)室溫下放置60分鐘。
C.從濕盒取出，用裝有PBS緩沖液的洗瓶小心輕輕沖洗。
D.加入1滴(20-30μl)FITC標(biāo)記羊抗人抗體在濕盒內(nèi)室溫下孵育20-60分鐘。
E.從濕盒取出，用裝有PBS緩沖液的洗瓶小心輕輕沖洗。
F.在熒光顯微鏡下觀察記錄結(jié)果。
酶標(biāo)HRP顯色方法A.向每個反應(yīng)孔內(nèi)加入0.9ml稀釋液將膜片浸濕，室溫孵育5分鐘；B.每孔加入50-100μl被檢血清標(biāo)本，置于搖床上(60轉(zhuǎn)/min)，室溫孵育1小時；C.用1ml移液器吸干血清標(biāo)本稀釋液；D.每孔加入3-5ml稀釋后的洗滌液，在搖床輕微振蕩中洗滌，洗滌3次，每次2分鐘；E.吸干洗滌液，在每孔中加入1ml稀釋(取1ml稀釋液加5μl酶結(jié)合物)后的酶結(jié)合物，置于搖床上在輕微振蕩中室溫孵育30分鐘；
F.同步驟D洗滌；G.每孔加1ml底物液I和100μl底物液II，混合；H.根據(jù)膜片上方格位置1、2、3點以及背景顯色情況進行反應(yīng)，一般需要5-30分鐘；I.反應(yīng)完成后，用移液器吸干底物液，加2ml洗液洗滌膜條；J.最后每孔中加入0.5ml終止液，混勻后，室溫孵育5分鐘，并用蒸餾水洗滌膜條，吸干后，肉眼觀察結(jié)果，或采用一般掃描儀將圖像掃入電腦進行分析。
質(zhì)量控制A.為了保證實驗可重復(fù)性、敏感性和準(zhǔn)確性，每天的檢驗要應(yīng)用陽性和陰性照。
B.陰性對照結(jié)果應(yīng)顯示為弱于+熒光或顯色深度。否則，對照、抗原、標(biāo)記抗體或操作其中誤。
C.陽性對照結(jié)果應(yīng)顯示為3+-4+熒光或顯色深度。否則，對照、抗原、標(biāo)記抗體或操作其中有誤。
D.除了用陽性和陰性對照，還要做一個PBS對照(空白對照)，確保標(biāo)記抗體未受血清等污染。
7.結(jié)果解讀1)熒光掃描，結(jié)果報告。
采用激光掃描儀掃描，根據(jù)所標(biāo)記的熒光物質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL掃描。激光掃描技術(shù)，是目前最敏感也是最復(fù)雜的檢測技術(shù)，需要昂貴的掃描儀(例如ScanArray 5000)，這些掃描儀具有很高的分辨率，可用于高密度蛋白芯片的檢測。
2)顯色肉眼觀察，直接判斷結(jié)果。如圖4，應(yīng)用該多肽芯片對SARS進行檢測后，我們發(fā)現(xiàn)在SARS多肽芯片上，控制位點人IgG質(zhì)控血清10、人IgG 11、羊抗人IgG 12以及相應(yīng)的S713、S214、S615、S1016等位點出現(xiàn)陽性。
實施例SARS抗體篩選多肽芯片的檢測試劑盒SARS多肽芯片抗體篩選試劑盒(圖5)是將SARS蛋白抗原經(jīng)計算機分析篩選出可能具有抗原性的多肽片段，經(jīng)人工合成以后，包被于硝酸纖維素膜上并經(jīng)封閉處理，與待檢測血清中的抗SARS蛋白抗體反應(yīng)后，加入酶標(biāo)記的抗人IgG，再加入底物顯色。陽性者在相應(yīng)位置出現(xiàn)藍色點(加入終止液后為棕色條帶)。
試劑盒組成1.包被NC膜的6孔板 2.稀釋緩沖液(即用型)3.洗滌緩沖液(10×)4.酶結(jié)合物(200×)5.底物液I(即用型) 6.底物液II(即用型)7.終止液2N H2SO4(即用型)8.操作說明書試劑保存4℃冷藏。至少6孔板、酶結(jié)合物和底物液I、II需要冷藏。
操作注意事項A.在膜條溫育過程中，注意不要使反應(yīng)膜片干燥。
B.不要用手直接接觸抗原膜條。
C.在多孔平行操作時，完成血清孵育后，去除反應(yīng)液時應(yīng)注意避免交叉污染。
操作前準(zhǔn)備A.準(zhǔn)備一個500ml試劑瓶，將洗滌緩沖液按1∶10稀釋；B.搖床一臺，最好是上下擺動型搖床。
操作步驟A.向每個反應(yīng)孔內(nèi)加入0.9ml稀釋液將膜片浸濕，室溫孵育5分鐘；B.每孔加入50-100μl被檢血清標(biāo)本，置于搖床上(60轉(zhuǎn)/min)，室溫孵育1小時；C.用1ml移液器吸干血清標(biāo)本稀釋液；D.每孔加入3-5ml稀釋后的洗滌液，在搖床輕微振蕩中洗滌，洗滌3次，每次2分鐘；E.吸干洗滌液，在每孔中加入1ml稀釋(取1ml稀釋液加5μl酶結(jié)合物)后的酶結(jié)合物，置于搖床上在輕微振蕩中室溫孵育30分鐘；
F.同步驟4洗滌；G.每孔加1ml底物液I和100μl底物液II，混合；H.根據(jù)膜片上方格位置1、2、3點以及背景顯色情況進行反應(yīng)，一般需要5-30分鐘；I.反應(yīng)完成后，用移液器吸干底物液，加2ml洗液洗滌膜條；J.最后每孔中加入0.5ml終止液，混勻后，室溫孵育5分鐘，并用蒸餾水洗滌膜條，吸干后，觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷膜片上方格所代表的SARS多肽抗原位置(注意6孔板的方向，圓端在右邊)。

每個方格相應(yīng)的抗原


其中15種SARS多肽片段氨基酸序列

對照結(jié)果解讀意義


多肽位點陽性結(jié)果解讀相應(yīng)多肽位點出現(xiàn)陽性結(jié)果，表明該多肽具有免疫原性，病人血清中有相應(yīng)的IgG抗體存在。
權(quán)利要求1.一種SARS冠狀病毒多肽蛋白芯片，其特征在于，它包括(a)膜片，所述的膜片是硝酸纖維膜或尼龍膜；(b)陣列式固定在所述膜片上的SARS病毒蛋白抗原決定族部分的多肽片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的SARS病毒蛋白是S蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的SARS病毒蛋白是M蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所選擇的SARS病毒蛋白是N蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的SARS病毒蛋白抗原決定族部分的多肽片段選自下組N1多肽對應(yīng)于N蛋白第21-44位，序列為PTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQ；N2多肽對應(yīng)于N蛋白第138-160位，序列為GALNTPKDHIGTRNPNNNAATVL；M1多肽對應(yīng)于M蛋白第3-22位，序列為DNGTITVEELKQLLEQWNLV；M2多肽對應(yīng)于M蛋白第145-166位，序列為RGHLRMAGHSLGRCDIKDLPKE；M3多肽對應(yīng)于M蛋白第190-210位，序列為SGFAAYNRYRIGNYKLNTDHA；S1多肽對應(yīng)于S蛋白第34-54位，序列為TSSMRGVYYPDEIFRSDTLYL；S2多肽對應(yīng)于S蛋白第94-113位，序列為KSNVVRGWVFGSTMNNKSQS；S3多肽對應(yīng)于S蛋白第197-216位，序列為YKGYQPIDVVRDLPSGFNTL；S4多肽對應(yīng)于S蛋白第273-293位，序列為TDAVDCSQNPLAELKCSVKSF；S5多肽對應(yīng)于S蛋白第297-316位，序列為KGIYQTSNFRVVPSGDVVRF；S6多肽對應(yīng)于S蛋白第332-351位，序列為TKFPSVYAWERKKISNCVAD；S7多肽對應(yīng)于S蛋白第436-455位，序列為YNYKYRYLRHGKLRPFERDI；S8多肽對應(yīng)于S蛋白第540-559位，序列為PSSKRFQPFQQFGRDVSDFT；S9多肽對應(yīng)于S蛋白第731-753位，序列為CANLLLQYGSFCTQLNRALSGIA；S10多肽對應(yīng)于S蛋白第758-780位，序列為RNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFG。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的膜片是硝酸纖維素膜，并且所述的硝酸纖維素膜固定于玻片或培養(yǎng)板上；或者所述的膜片是尼龍膜，所述的尼龍膜附著在玻片上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的膜片是10mm×12mm或1.5mm×2.5mm的硝酸纖維膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的芯片，其特征在于，所述的膜片上同時固定有以下SARS病毒蛋白多肽片段N1、N2、M1、M2、M3、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10。
9.如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，在膜片上還設(shè)有陽性對照陰性對照點樣區(qū)，并且在所述的陽性對照陰性對照點樣區(qū)分別固定有人Ig質(zhì)控血清、人IgG、羊抗人IgG、BSA。
10.一種SARS抗體檢測試劑盒，其特征在于，它含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的SARS冠狀病毒多肽蛋白芯片和操作說明書。
專利摘要本實用新型涉及一種SARS冠狀病毒(SARS)多肽蛋白芯片和快速檢測試劑盒，其中采用蛋白芯片技術(shù)陣列固定SARS病毒蛋白抗原決定族部分的多肽片段，直接檢測SARS病人血清中特異性的抗SARS病毒的IgG或IgM抗體。該檢測芯片可以同時測定和篩選SARS病人血清中18種特異的IgG或IgM抗體，可用于臨床上SARS病人的快速篩查。該芯片采用酶標(biāo)顯色技術(shù)，肉眼可直接觀察結(jié)果，不需特殊儀器設(shè)備，適宜于現(xiàn)場篩選檢查。
文檔編號G01N33/543GK2735340SQ200320122840
公開日2005年10月19日 申請日期2003年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月25日
發(fā)明者繆金明, 張慶華, 肖華勝, 孫兵, 吳船, 楊宏鈞 申請人:上海生物芯片有限公司