專利名稱：檢測(cè)生物樣品中的輔酶a分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)生物樣品中的輔酶A分子(在下文中記載為“CoA”)的方法。
背景技術(shù)：
CoA分子是保持生命功能必不可少的一類化合物，其涉及生物合成途徑、脂肪酸的降解和轉(zhuǎn)化、激素合成和調(diào)控、TCA循環(huán)等。用于精確測(cè)量生物樣品中的CoA分子的濃度的方法一直是研究的目標(biāo)，其重點(diǎn)在于這種濃度作為CoA分子在脂質(zhì)代謝中的功能分析研究的標(biāo)志的作用。
CoA分子之一，丙二酰CoA，是涉及線粒體和脂質(zhì)合成中的脂肪酸氧化步驟中的脂質(zhì)代謝機(jī)制的組成成分，因此在調(diào)控脂質(zhì)代謝方面扮演了重要的角色；其在調(diào)控心臟和骨骼肌肉的脂質(zhì)能量代謝和腦內(nèi)下丘腦中的神經(jīng)肽Y表達(dá)，以及在調(diào)控飲食攝入和能量消耗方面獲得了較多關(guān)注。
在過去，已提出了用于測(cè)定CoA分子的各種方法，包括酶學(xué)方法和HPLC。酶學(xué)測(cè)定方法的例子包括Guynn等人(Guynn，R.W.，Methods Enzymol.，1975，35，312)的方法和McGrry等人(McGarry，J.D.，J.Biol.Chem.，1978，253，22，8291)的方法。例如，當(dāng)測(cè)定的對(duì)象為丙二酰CoA時(shí)，則測(cè)定放射性標(biāo)記的乙酰CoA或其類似物的丙二酰CoA依賴性吸收。但是，由于其測(cè)定目標(biāo)為一特定的CoA，且在測(cè)量過程中由于其他CoA分子的共同存在，從而在某些情況下導(dǎo)致了不精確的測(cè)量值，因而必須進(jìn)行校正，并且該過程也十分復(fù)雜，因此該方法具有應(yīng)用局限性。
已經(jīng)出版了大量的有關(guān)采用UV-HPLC測(cè)定CoA分子的報(bào)道(參見，例如，Hosokawa，Y.，Anal.Biochem.，1978，91，1，370，Demoz，A.，J.Chromatogr.，BBiomed.Appl.，1995，667，1，148)。肌肉、心臟和肝臟生物樣品中的CoA濃度通過該方法來測(cè)量。但是，由于UV-HPLC具有較低的靈敏度，其對(duì)于高度污染的樣品，比如那些來源于器官的樣品具有較差的再現(xiàn)性，并且腦部濃度特別難于測(cè)定，因此需要一種能提供更高靈敏度和再現(xiàn)性的方法。
LC-MS作為一種用于獲得更高靈敏度的可選擇的方法(參見Buchholz，A.，Anal.Biochem.，2001，295，129)被開發(fā)出來。該方法通過三維離子阱質(zhì)譜來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中的乙酰CoA濃度的測(cè)定。雖然采用該方法可成功地對(duì)作為檢測(cè)對(duì)象的特定CoA進(jìn)行檢測(cè)和峰值分離，但由于該方法為一種絕對(duì)校正曲線方法并且不采用內(nèi)標(biāo)物，因此其精確度和再現(xiàn)性仍然不足。還有，所述的測(cè)定對(duì)象為具有低極性且容易通過HPLC分離的乙酰CoA。其另外的測(cè)量?jī)?yōu)勢(shì)在于細(xì)胞樣品含有較少量的能干擾測(cè)量的污染物中，且樣品中乙酰CoA的濃度很高。但是，對(duì)于在通過HPLC分離相對(duì)較難的高極性形式的情況下，和在樣品例如具有很高量的可干擾測(cè)量的污染物的動(dòng)物器官的情況下，和在樣品中存在較低濃度的情況下(例如動(dòng)物器官中的丙二酰CoA)測(cè)定CoA分子來說，該方法不能充分地得到應(yīng)用。
本發(fā)明通過提供一種具有相當(dāng)好靈敏度和再現(xiàn)性的用于生物樣品中CoA分子濃度測(cè)定的方法來解決上述問題。
本發(fā)明的公開作為對(duì)上述主題深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了如下方法。特別地，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定生物樣品中輔酶A分子濃度的方法，所述方法的特征在于包括采用強(qiáng)酸性溶液從生物樣品中提取的步驟、固相提取的步驟、加入內(nèi)標(biāo)物的步驟、和通過LC-MS檢測(cè)的步驟。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于測(cè)定輔酶A分子的前述的方法，其特征在于所述的從生物樣品中提取輔酶A分子的步驟為一個(gè)其中在一種高氯酸溶液中震蕩經(jīng)過冷凍粉碎的生物樣品且通過離心分離上清液的步驟。
所述的固相提取步驟的特征在于，它是這樣的一個(gè)步驟其中通過把用強(qiáng)酸溶液提取輔酶A而獲得的上清液中和，并且隨后加樣于采用含有十八甲硅烷基團(tuán)或辛基甲硅烷基團(tuán)的硅膠填充的反相柱上，采用水溶液洗滌，再用有機(jī)溶劑洗脫。特別地，所述上清是在采用乙腈和1M醋酸銨來再生所述反相柱后加樣的，并且洗脫是采用乙腈和醋酸銨的混合物來進(jìn)行的。
本發(fā)明仍進(jìn)一步提供了用于測(cè)定輔酶A分子的前述的方法，其特征在于所述輔酶A分子為一種脂肪酸輔酶A的酯，并且所述內(nèi)標(biāo)物為所述輔酶A分子的結(jié)構(gòu)類似物。
本發(fā)明仍然進(jìn)一步提供了一種用于測(cè)定輔酶A分于的前述方法，其特征在于所述脂肪酸輔酶A的酯為一種在主碳鏈中含有2-8個(gè)碳原子的的短鏈脂肪酸的輔酶A的酯，所述的結(jié)構(gòu)類似物具有與輔酶A分子相比不多于3個(gè)碳原子的差異，且至少3個(gè)主鏈上的氫原子被氘原子所替代，或被13C所替代；且更特別的在于，所述輔酶A分子為丙二酰CoA，且結(jié)構(gòu)類似物為乙酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d4、丙酰CoA-d3、丙酰CoA-d5或丙二酰CoA-13C3。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為采用來源于Wistar大鼠的肌肉樣品檢測(cè)的色譜圖。
圖2為采用來源于Wistar大鼠的肝臟樣品檢測(cè)的色譜圖。
圖3為采用來源于Wistar大鼠的腦部樣品檢測(cè)的色譜圖。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及一種檢測(cè)CoA分子的方法，其包括采用強(qiáng)酸性溶液從生物樣品中提取，隨后如果需要的話，進(jìn)行濃縮，添加內(nèi)標(biāo)物，制備HPLC加樣樣品，通過HPLC分離CoA分子和內(nèi)標(biāo)物，采用質(zhì)譜儀檢測(cè)CoA分子和內(nèi)標(biāo)物，和通過測(cè)得的待檢測(cè)的CoA和內(nèi)標(biāo)物的面積比率進(jìn)行定量分析。
采用強(qiáng)酸性溶液從生物樣品中提取CoA分子的步驟可在含有CoA分子的任何生物樣品上進(jìn)行，并且如特定實(shí)施例中所提到的，可以是人和動(dòng)物器官，人、動(dòng)物和植物的組織或細(xì)胞，微生物，及其類似物。測(cè)定器官，如肌肉、肝臟和大腦中的CoA分子是特別有用的。
作為待檢測(cè)的CoA分子，可提到具有?；膸€基基團(tuán)的?；鵆oA分子，具有氧化性鍵合的巰基基團(tuán)的氧化的CoA分子，和具有?；牟返腘-酰基CoA分子。雖然在此處提到的一些CoA分子沒有在生物樣品中發(fā)現(xiàn)，但是其可用于研究的目的，如用于功能性分析，因此對(duì)于藥物開發(fā)中的療效評(píng)價(jià)十分重要。
作為酰基CoA分子的特定實(shí)施例，可提到乙酰乙酰基CoA、丙二酰CoA、琥珀酰CoA、3-羥基-3-甲基戊二酰CoA、戊二酰CoA、CoA、乙酰CoA、苯甲酰CoA、苯乙酰CoA、異丁酰CoA、異戊酰CoA、丁酰CoA、β-甲基巴豆酰CoA、甲基巴豆酰CoA、3-羥基丙酰CoA、巴豆酰CoA、已酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙酰CoA、丙烯酰CoA、花生四烯酰CoA、癸酰CoA、反油酰CoA、油酰CoA、棕櫚油酰CoA、棕櫚酰CoA、亞麻酰CoA、月桂酰CoA、肉豆蔻腦酰CoA、神經(jīng)酰CoA、硬脂酰CoA、辛酰CoA、肉豆蔻酰CoA、花生四烯酰CoA、十七酰CoA、十九酰CoA、二十六酰CoA、十五酰CoA、β-羥丁酰CoA、庚酰CoA、戊酰CoA、2-丁烯酰CoA和硬脂酰CoA。
作為N-?；鵆oA分子的特定實(shí)施例，可提到N-丁酰CoA、N-癸酰CoA和N-已酰CoA。
作為具有氧化性鍵合的巰基基團(tuán)的氧化的CoA分子的特定實(shí)施例，可提到氧化的CoA和CoA谷胱甘肽二硫化物。
在這些中，優(yōu)選乙酰CoA、CoA、琥珀酰CoA、乙酰乙酰基CoA、3-羥基-3-甲基戊二酰CoA、丙酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙二酰CoA、3-羥基丙酰CoA、丙烯酰CoA、油酰CoA、硬脂酰CoA、亞麻酰CoA、花生四烯酰CoA、棕櫚酰CoA、硬脂酰CoA、異丁酰CoA、氧化的CoA和CoA谷胱甘肽二硫化物、具有短鏈的(≤C8)脂肪酸CoA酯和硫代酸酯、例如乙酰CoA、CoA、琥珀酰CoA、乙酰乙?；鵆oA、3-羥基-3-甲基戊二酰CoA、丙酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙二酰CoA、異丁酰CoA和特別適合檢測(cè)的CoA谷胱甘肽二硫化物。
用于從生物樣品中提取CoA分子的強(qiáng)酸性溶液通常為一種能使生物樣品蛋白變性并且能提取待檢測(cè)的化合物的溶液，并且作為優(yōu)選實(shí)施例，可提及三氯乙酸溶液和高氯酸溶液。對(duì)于所采用的特定提取方法沒有特別的限定，其可根據(jù)待檢測(cè)的樣品和檢測(cè)對(duì)象來合適地選擇。例如，在利用液氮冷凍生物組織，如肌肉或大腦，并將其粉碎后，可加入一種強(qiáng)酸性溶液至其預(yù)定的濃度，并充分混合攪拌和離心分離，并且隨后將所述的上清液用作生物樣品提取物。
要添加的內(nèi)標(biāo)物的優(yōu)選實(shí)例包括前述的CoA分子或其等價(jià)物?；趦?nèi)標(biāo)方法的本性，待檢測(cè)的CoA和內(nèi)標(biāo)物優(yōu)選地具有一定的關(guān)系，例如其物理和化學(xué)特性類似，并且二者在方法過程中均顯示出相同的行為，但可以在檢測(cè)中分開，不相互干擾。為了滿足這種關(guān)系，優(yōu)選地選擇符合如下所述的內(nèi)標(biāo)物的選擇標(biāo)準(zhǔn)的CoA類似物或CoA等價(jià)物。
CoA類似物與待檢測(cè)的CoA相比具有不多于3個(gè)碳原子的差異，并且當(dāng)待檢測(cè)的CoA的主碳鏈具有官能團(tuán)例如乙醇、胺、羧酸或其類似物時(shí)，其內(nèi)標(biāo)物也優(yōu)選地具有相同的官能團(tuán)。CoA同位素待檢測(cè)的CoA的?；鶊F(tuán)主鏈上至少有3個(gè)氫原子被氘原子所取代，或被13C所取代，并且其優(yōu)選地符合CoA類似物的前述標(biāo)準(zhǔn)。
由于一些CoA分子實(shí)質(zhì)上是生物來源的，所采用的內(nèi)標(biāo)物優(yōu)選地為人工合成的，例如上述的氘或13C形式，或N-?；鵆oA或其類似物。例如，為了檢測(cè)鼠肝臟中的丙二酰CoA，乙酰CoA不能被用作內(nèi)標(biāo)物，因?yàn)閮?nèi)源的乙酰CoA濃度高，從而乙酰CoA-d3、乙酰乙?；鵆oA-d5、甲基丙二酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d4、丙酰CoA-d3、丙酰CoA-d5、異丁酰CoA-d7或甲基丙二酰CoA-13C3為優(yōu)選的。
內(nèi)標(biāo)物的添加既可以被添加于通過用強(qiáng)酸性溶液從生物樣品中CoA提取獲得的上清液中，也可最初添加于強(qiáng)酸性溶液中。如果所述內(nèi)標(biāo)物在處理過程中的行為特別不同，則其可在通過HPLC制備樣品的過程中添加，或其僅作為一校正角色用于質(zhì)譜儀的電離作用中。
由于提取的上清液將是一種強(qiáng)酸性溶液，其可在加樣于HPLC中之前，通過中和作用、溶劑交換或其類似方法，將pH值調(diào)節(jié)至中性范圍內(nèi)。將HPLC的注射樣品調(diào)節(jié)至pH3-10。從靈敏度、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性的角度來說，該測(cè)定最優(yōu)選地在中性pH范圍3-8下進(jìn)行。在pH2的酸性端值和其以下值時(shí)，會(huì)由于CoA的磷酸基團(tuán)的存在而發(fā)生色譜峰的拖尾現(xiàn)象，或者對(duì)柱的吸附現(xiàn)象將十分明顯。在pH10的堿性端值或其以上值時(shí)，CoA的分解現(xiàn)象將十分明顯。用于調(diào)節(jié)pH值的的試劑可以是具有緩沖效果的pH調(diào)節(jié)劑，例如乙酸銨或磷酸鉀。
為了使用具有低CoA濃度的生物樣品，例如大腦或其類似物，進(jìn)行檢測(cè)或?yàn)榱诉M(jìn)行高靈敏度的分析，需要對(duì)樣品進(jìn)行濃縮。作為濃縮的優(yōu)選方法，可提及冷凍干燥、減壓下濃縮、液-液萃取、固相提取、在線濃縮及其類似的方法，其中固相提取法為優(yōu)選的。
采用商業(yè)化購(gòu)得的反相柱、正相柱或離子交換柱可實(shí)現(xiàn)固相提取，不過由于反相柱具有良好的再現(xiàn)性，因此最適合用于CoA分子的檢測(cè)。由于CoAs的高極性，正相系統(tǒng)不太適合；當(dāng)對(duì)于離子交換系統(tǒng)，采用強(qiáng)酸溶液進(jìn)行提取時(shí)，鹽濃度將過高從而在載體上的保留將十分困難。
固相提取過程首先涉及采用有機(jī)溶劑、水溶劑或其類似物來再生固相柱，以及將通過采用強(qiáng)酸溶液提取CoA而獲得的上清液中和，并將其加樣至固相柱用于將CoA吸附至固相柱，并隨后采用水性溶劑沖洗柱子，并隨后洗脫所吸附的CoA。
再生采用有機(jī)溶劑和高濃度的鹽溶液來進(jìn)行。當(dāng)采用反相柱時(shí)，采用乙腈和1M乙酸銨來進(jìn)行再生。特別地，將100％的乙腈注射加樣至固相柱中，并且隨后為了避免鹽沉淀，采用50％的乙腈水溶液來降低柱中的乙腈濃度，隨后，加入1M乙酸銨水溶液用于再生柱子。
在約50mM的較低乙酸銨濃度下，不可能在反相柱中完全保留CoA，從而損害了產(chǎn)量。
用于再生的有機(jī)溶劑可以是乙腈或其他通常采用的溶劑，比如甲醇或2-丙醇。作為使用的鹽溶液，可以提及乙酸銨或甲酸銨、碳酸銨、磷酸鈉、磷酸鉀或其類似物。濃度優(yōu)選地為200mM至2M。
用于沖洗的水溶液優(yōu)選地為水，不過其也可以含有鹽例如乙酸銨或磷酸鈉。為了進(jìn)一步增強(qiáng)沖洗的效果，也可以以不洗脫CoA的量將有機(jī)溶劑例如乙腈或甲醇加入其中。水在CoA沖洗溶劑中的比例至少為50％，并且不含有機(jī)溶劑的水溶液特別優(yōu)選地用于短鏈脂肪酸CoA酯的檢測(cè)，因?yàn)槠錁O性較高。
其次，洗脫溶劑用于洗脫保留在柱中的檢測(cè)對(duì)象CoA。采用的洗脫溶劑可以是通常用于固相提取的有機(jī)溶劑的混合物，例如甲醇、乙腈、2-丙醇、丙酮或四氫呋喃，與水或如上文所述的作為沖洗溶液使用的水溶液混合，并且混合比例(0-100％)可基于CoA檢測(cè)對(duì)象和內(nèi)標(biāo)物的洗脫動(dòng)力學(xué)以及污染物的洗脫動(dòng)力學(xué)來適當(dāng)?shù)卮_定。
在短鏈脂肪酸CoA酯例如丙二酰CoA的情況下，可采用適當(dāng)?shù)?0％有機(jī)溶劑的溶液來進(jìn)行洗脫，不過考慮到隨后的溶劑的蒸去，其濃度優(yōu)選為20-75％。當(dāng)接近100％時(shí)，污染物的洗脫變?yōu)橐粋€(gè)顯著的因素。將洗脫物的溶劑蒸去并且用重新溶解溶液將殘留物重新溶解。如果沒有內(nèi)標(biāo)物被加入到通過強(qiáng)酸溶液獲得的提取物中時(shí)，則在該時(shí)間點(diǎn)處加入一預(yù)先設(shè)定量的內(nèi)標(biāo)物。
為了進(jìn)行CoA和內(nèi)標(biāo)物的HPLC分離，可采用商業(yè)化購(gòu)得的用于常規(guī)反相色譜的液相色譜分離柱，不過鍵合了十八烷基硅烷基團(tuán)(C18)的二氧化硅基質(zhì)填充物是優(yōu)選的。也可以采用鍵合了辛基硅烷基團(tuán)的二氧化硅基質(zhì)填充物(C8)或基于酰胺，特別是氨基甲?；瘜W(xué)鍵類型的硅膠。
柱的尺寸可以是用于分析的任何可商業(yè)化購(gòu)得的尺寸，并且測(cè)定可采用一內(nèi)徑為1mm至10mm，長(zhǎng)度為50mm至250mm的柱進(jìn)行。不過，對(duì)于該尺寸范圍沒有限定，并且如果檢測(cè)對(duì)象物質(zhì)被適當(dāng)?shù)乇Ａ舨⑶夷茱@示清晰的峰就基本上足夠了。采用的流動(dòng)相可以是常規(guī)用于反相HPLC的任何溶劑，并且其優(yōu)選地含有揮發(fā)物或可升華鹽例如乙酸銨。
作為通過質(zhì)譜儀用于檢測(cè)CoA和內(nèi)標(biāo)物的合適的質(zhì)譜儀的特定例子，可提及四極質(zhì)譜儀、扇形質(zhì)譜儀、三節(jié)四極質(zhì)譜儀、離子阱質(zhì)譜儀、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、四極飛行時(shí)間混合質(zhì)譜儀及其類似物。其中，四極質(zhì)譜儀和三節(jié)四極質(zhì)譜儀是優(yōu)選的，并且最優(yōu)選三節(jié)四極質(zhì)譜儀。檢測(cè)條件包括設(shè)定化合物的質(zhì)量單位和檢測(cè)通過分析柱分離的峰。
為了從檢測(cè)的CoA測(cè)定對(duì)象與內(nèi)標(biāo)物的面積比例進(jìn)行定量分析，在上述檢測(cè)條件下對(duì)為校正曲線制備的樣品進(jìn)行測(cè)定，并且峰面積比例和CoA測(cè)定對(duì)象和內(nèi)標(biāo)物的濃度被用于創(chuàng)建校正曲線。通過最小平方法從一級(jí)回歸線中創(chuàng)建出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且經(jīng)其實(shí)的樣品測(cè)量而獲得的內(nèi)標(biāo)物和CoA檢測(cè)對(duì)象的峰面積比例被用于反向回歸，來計(jì)算CoA測(cè)定對(duì)象的濃度。
實(shí)施例現(xiàn)在將進(jìn)一步解釋用于肌肉、肝臟和大腦的丙二酰CoA的檢測(cè)的本發(fā)明的CoA測(cè)定方法的實(shí)施例。
1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備采用精確天平準(zhǔn)確地稱量幾毫克的丙二酰CoA的鋰鹽，并隨后采用6％的高氯酸溶解至10mM的濃度，從而制備標(biāo)準(zhǔn)貯存液。采用6％的高氯酸逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯存液從而制備10μM、5μM、1μM、500nM、100nM、50nM和10nM的用于校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液。類似地，采用6％的高氯酸逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯存液，從而制備50μM、5μM和500nM的用于證實(shí)再現(xiàn)性(QC)的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備(IS)采用精確天平準(zhǔn)確地稱量幾毫克的乙酰CoA-d3，并隨后采用6％的高氯酸溶解至10mM的濃度，從而制備標(biāo)準(zhǔn)貯存液。采用6％的高氯酸稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯存液來制備5μM的用于校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用CoA和乙酸酐-d6作為起始物，根據(jù)Simon的方法(Simon，E.J.，J.A.C.S.，1953，75，2520)合成乙酰CoA-d3。
3.用于檢測(cè)的樣品溶液的制備1)生物樣品提取物的制備當(dāng)從Wistar大鼠中提取肌肉、肝臟或腦組織后，立即在液氮中冷凍和粉碎，隨后加入6％的高氯酸至5ml/g濕重。將混合物充分?jǐn)嚢?。?000rpm下離心，其上清液作為生物樣品提取物使用。
2)樣品預(yù)處理對(duì)于肌肉和肝臟中的檢測(cè)向300μL的1M乙酸銨溶液(未調(diào)節(jié)pH)中加入200μL的校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液、生物樣品提取物，或者為了QC，來源于多個(gè)個(gè)體的混合生物樣品提取溶液、20μL的IS溶液和僅用于QC的20μL的QC標(biāo)準(zhǔn)溶液(用于QC)，來制備固相提取樣品。
對(duì)于大腦的檢測(cè)向450μL的1M乙酸銨溶液中加入400μL的校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液、生物樣品提取物，或者為了QC，加入來源于多個(gè)個(gè)體的混合生物樣品提取溶液、20μL的IS溶液和僅用于QC的，20μL的QC標(biāo)準(zhǔn)溶液(用于QC)，來制備固相提取樣品。
在采用1mL乙腈、1mL的50％乙腈水溶液和1mL的1M的乙酸銨(未調(diào)節(jié)pH)溶液來再生100mg/1mL的作為固相提取柱的BondElute C18(Varian的產(chǎn)品)后，加樣固相提取物樣品。隨后采用1mL水沖洗，隨后把采用1mL的乙腈/50mM乙酸銨溶液＝2/8的混合物洗脫的溶液(未調(diào)節(jié)pH)冷凍干燥，并將溶劑蒸發(fā)除去。同時(shí)，向殘留物中加入200μL水用于溶解而形成檢測(cè)樣品的溶液，并且將其中的20μL用于LC/MS/MS系統(tǒng)中。
4.檢測(cè)儀器和條件1)檢測(cè)儀器下述儀器和設(shè)備被作為L(zhǎng)C/MS/MS系統(tǒng)使用。
HPLC系統(tǒng)Agilent 1100(Agilent)自動(dòng)進(jìn)樣器Shimadzu SIL-HTc(Shimadzu)質(zhì)量分析器API 3000(Applied Biosystems)2)HPLC條件HPLC分析條件為AQUA C18作為分析柱，AQUA C18保護(hù)柱作為保護(hù)柱，柱溫度為25℃，10mM的乙酸銨(未調(diào)節(jié)pH)水溶液(溶液A)和甲醇(溶液B)作為流動(dòng)相，在如表1所示的梯度條件下，其流速為1ml/分鐘。
表1HPLC的梯度條件

3)MS條件通過電離方法來進(jìn)行質(zhì)量分析(渦輪離子噴霧，正離子方式)，用于檢測(cè)乙二酰CoA離子(Q1854(m/z)，Q3347(m/z))和乙酰CoA-d3離子(Q1813(m/z)，Q3306(m/z))。
4)數(shù)值計(jì)算基于通過MRM獲得的保留時(shí)間(丙二酰CoAm/z 854→347，ISm/z 831→306)和監(jiān)測(cè)離子的質(zhì)量數(shù)來進(jìn)行峰值確定，同時(shí)通過基于丙二酰CoA和IS的峰面積比例的內(nèi)標(biāo)法來進(jìn)行定量分析。用于QC樣品和生物樣品提取物的校正曲線公式和數(shù)值按如下方式來確定。
校正曲線公式采用丙二酰CoA峰面積比例(y)和濃度(x)間的關(guān)系，并參考IS，通過最小平方法(加權(quán)1/x)來確定。
y＝ax+bx濃度，y峰面積比例QC樣品和生物樣品提取物的濃度根據(jù)校正曲線方法通過下述公式來確定。
x＝(y-b)/ax測(cè)量的濃度5.結(jié)果1)線性根據(jù)上述分析方法檢測(cè)校正曲線樣品，并且創(chuàng)建校正曲線(表2)。采用1/x的加權(quán)，線性是令人滿意的，其相關(guān)系數(shù)(r)為0.9998，相對(duì)誤差(RE)為-7.5至+6.8％。
表2校正曲線數(shù)據(jù)

2)再現(xiàn)性作為用于證實(shí)再現(xiàn)性(QC)的樣品，采用空白樣品(Q0)和含有500nM、5μM和50μM的QC標(biāo)準(zhǔn)溶液(Q1、Q2、Q3，每一濃度N＝3)來檢測(cè)丙二酰CoA的濃度。QC1至QC3表示獲得的數(shù)值減去Q0，并且如表3至5所示，全部值都令人滿意，對(duì)于肌肉濃度，純度(％CV)為1.7-9.1％，精度(％RE)為-4.3至5.7％；對(duì)于肝臟濃度，純度(％CV)為3.0-8.2％，精度(％RE)為-5.6至9.1％；對(duì)于腦部濃度，純度(％CV)為2.0-7.5％，精度(％RE)為-3.6至6.9％。
3)生物樣品中的丙二酰CoA濃度的檢測(cè)檢測(cè)了6只Wistar大鼠的肌肉、肝臟和腦部的丙二酰CoA的濃度。圖1和圖3中顯示了色譜圖，同時(shí)測(cè)量結(jié)果示于表6和表8中。
表6Wistar大鼠肌肉中的丙二酰CoA的濃度

表7Wistar大鼠肝臟中的丙二酰CoA的濃度

表8Wistar大鼠大腦中的丙二酰CoA的濃度

發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，生物樣品中的CoA分子可通過LC-MS以一種精確和可再現(xiàn)的方式被定量地檢測(cè)。
表3使用肌肉樣品進(jìn)行的可再現(xiàn)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

表4使用肝臟樣品進(jìn)行的可再現(xiàn)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

表5使用大腦樣品進(jìn)行的可再現(xiàn)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)生物樣品中輔酶A分子的濃度的方法，所述方法的特征在于包括采用強(qiáng)酸性溶液從生物樣品中提取的步驟、固相提取的步驟、添加內(nèi)標(biāo)物的步驟和通過LC-MS檢測(cè)的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)輔酶A分子的方法，其特征在于所述的從生物樣品中提取輔酶A分子的步驟為一個(gè)其中在高氯酸溶液中攪拌經(jīng)過冷凍粉碎的生物樣品并通過離心分離上清液的步驟。
3.如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)輔酶A分子的方法，其特征在于所述的固相提取的步驟為是這樣的一個(gè)步驟其中把用強(qiáng)酸性溶液提取輔酶A而獲得的上清液中和，并且隨后加樣于填充了含有十八甲硅烷基團(tuán)或辛基甲硅烷基團(tuán)的硅膠的反相柱上，并采用水性溶劑沖洗，再采用有機(jī)溶劑洗脫。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)輔酶A分子的方法，其特征在于在采用乙腈和1M乙酸銨溶液再生反相柱后加樣上清液。
5.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)輔酶A分子的方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為乙腈和乙酸銨的混合物。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)輔酶A分子的方法，其特征在于所述的輔酶A分子為脂肪酸輔酶A酯，并且所述內(nèi)標(biāo)物為該輔酶A分子的結(jié)構(gòu)類似物。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)輔酶A分子的方法，其特征在于所述的脂肪酸輔酶A酯為一種在主碳鏈中具有2-8個(gè)碳原子的的短鏈脂肪酸的輔酶A的酯，并且其結(jié)構(gòu)類似物具有與輔酶A分子相比不超過3個(gè)碳原子的差異，并且其主鏈上至少有3個(gè)氫原子被氘原子所取代，或其主碳鏈上至少有3個(gè)碳原子被13C所取代。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測(cè)輔酶A分子的方法，其特征在于所述的輔酶A分子為丙二酰CoA，并且所述的結(jié)構(gòu)類似物為乙酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d3、甲基丙二酰CoA-d4、丙酰CoA-d3、丙酰CoA-d5或丙二酰CoA-13C3。
全文摘要
目的是提供一種檢測(cè)生物樣品中的輔酶A(CoA)的高靈敏度和高再現(xiàn)性的方法，其特征在于包括采用強(qiáng)酸性溶液提取生物樣品的步驟、固相提取的步驟、添加內(nèi)標(biāo)物的步驟以及采用LC－MS檢測(cè)的步驟。
文檔編號(hào)G01N30/06GK1643375SQ03806790
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月25日
發(fā)明者酒井滿, 杉本圭則 申請(qǐng)人:帝人株式會(huì)社