專利名稱：分析殘留甲萘威的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適用于針對殘留甲萘威進(jìn)行分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，該試劑盒主要適用于快速測定批量的水樣、土壤等環(huán)境樣品和中毒樣品及蔬菜等食品樣品中的甲萘威殘留。屬于殘留農(nóng)藥檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥及其代謝物傳統(tǒng)的殘留分析方法主要是依靠氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、質(zhì)譜(MS)等物理化學(xué)分析手段，但由于農(nóng)藥使用規(guī)模不斷擴(kuò)大，農(nóng)藥殘留造成環(huán)境影響和人類健康的慢性和長期效應(yīng)日益受到人們關(guān)注和擔(dān)憂，對農(nóng)藥殘留的限制也越來越嚴(yán)格，對分析測定對象、種類、數(shù)量、范圍、指標(biāo)等諸方面都提出了新的要求和更高的標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)的理化分析方法通常繁瑣復(fù)雜，工作量大，儀器昂貴，并要有熟練的技術(shù)人員及較長的分析周期。因此人們迫切希望有一種簡單、快速、靈敏及廉價(jià)的檢測技術(shù)能在野外和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行大批量的檢測應(yīng)用。免疫分析法正具備這些優(yōu)點(diǎn)，所以盡管將免疫分析用于農(nóng)藥殘留分析的時(shí)間很短，仍然很快用于環(huán)境樣品和食品樣品中農(nóng)藥殘留的分析。
甲萘威(Carbaryl)，自1953年由美國聯(lián)合碳化物公司開發(fā)推廣后即作為一種廣譜性高效殺蟲劑，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于糧食、棉花等經(jīng)濟(jì)作物的害蟲防治。但是由于甲萘威對人畜的毒性相當(dāng)高，且有內(nèi)吸性，近年來，因甲萘威中毒的報(bào)道，仍然屢見不鮮。尤其是在作物和蔬菜上的大量使用，對人體健康造成極大的危害，這已引起人們的關(guān)注。因此，開發(fā)一種簡單快速，適用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
檢測甲萘威殘留量常規(guī)方法為高效液相色譜法等。然而該方法的靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，且該方法需要昂貴的儀器，且過程繁瑣，不適合大批量樣品的檢測與分析。免疫分析為甲萘威的殘留檢測提供了一個(gè)新的分析檢測途徑。要將免疫分析方法運(yùn)用到實(shí)際中，則需要將其制備成試劑盒。現(xiàn)有技術(shù)中如中國發(fā)明專利公開CN1431503A和CN1431501A，均公開了針對各種常見檢測比較麻煩的農(nóng)藥殘留或代謝物檢測的試劑盒，其中包括了檢測甲基對硫磷和硫磷等殘留物的試劑盒及其制備方法。而現(xiàn)有技術(shù)中沒有關(guān)于方便檢測甲萘威的技術(shù)。
本發(fā)明正是針對這一空白，經(jīng)過發(fā)明人長時(shí)間的實(shí)驗(yàn)和測試，得到了一種適用于針對甲萘威殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容要解決的問題本發(fā)明的目的是提供一種檢測甲萘威殘留的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種具有高特異性、高靈敏度，操作方法簡單快速，并能用于大批量樣品快速檢測殘留甲萘威的試劑盒。
技術(shù)方案本發(fā)明涉及一種用于甲萘威殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，它基于免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和/或試管和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑，其特征在于，在酶標(biāo)板的每個(gè)孔內(nèi)含有抗甲萘威包被抗原，盒內(nèi)試劑包含抗甲萘威抗體、甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶標(biāo)記抗甲萘威抗體。盒內(nèi)試劑還包含洗滌液、底物稀釋液、底物溶液和反應(yīng)終止液。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的96孔/40孔酶標(biāo)板/試管和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑。在所述酶標(biāo)板的每個(gè)孔內(nèi)，吸附著由包被液包被能與抗甲萘威抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的包被抗原，并用5％明膠進(jìn)行封閉，盒內(nèi)試劑包含洗滌液(稀釋液)、底物稀釋液、抗甲萘威抗體(間接ELISA)、甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶標(biāo)甲萘威抗體例如辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(適用于間接競爭ELISA法)或辣根過氧化物酶標(biāo)記抗甲萘威兔抗體(適用于直接競爭ELISA法)、底物溶液和反應(yīng)終止液。
其中固相包被抗原的制備及盒體內(nèi)試劑組成如下將包被抗原(CBRH-OVA)用pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液(含1～2g碳酸鈉和2～4g碳酸氫鈉，雙蒸水1L，即包被液)稀釋成0.5～4μg/mL，點(diǎn)于96孔/40孔酶標(biāo)板上，100μg/孔，并用5％明膠封閉；其中包被抗原為例如N-(α-萘乙?；?-6-氨基己酸與卵清蛋白的復(fù)合物；洗滌液(稀釋液)一瓶，40～80mL/瓶，組成比例為磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉2～4g、氯化鉀0.1～0.3g、吐溫-200.5～3mL、雙蒸水500ml～1000ml，為正常使用的15～30倍濃縮液；底物稀釋液一瓶，30～50mL/瓶，配制如下檸檬酸3～6g，磷酸氫二鈉1～3g，雙蒸水，為正常使用的5～10倍濃縮液；酶底物為30％過氧化氫，10～15mL/瓶和鄰苯二胺固體粉末4～6支，10～20mg/支；抗甲萘威抗體(IgG)4瓶，100ml/瓶，工作濃度為1∶500～1000(間接ELISA法)；所述的抗甲萘威抗體(IgG)為通過甲萘威和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔后產(chǎn)生的能與甲萘威分子、甲萘威包被原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(IgG)；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗甲萘威兔抗體(直接ELISA法)或者辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(間接ELISA法)一瓶，200～400μL/瓶，為正常使用時(shí)800～1500倍濃縮液；上述辣根過氧化物酶標(biāo)抗甲萘威抗體為甲萘威抗體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物；反應(yīng)終止液一瓶，30～50mL/瓶，為2mol/L硫酸；甲萘威不同濃度系列(0.1、0.5、2、10、50、100mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液6瓶，1～4mL/瓶，甲醇定容，使用時(shí)用PBST稀釋10倍。
本發(fā)明的適用于甲萘威殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，能夠檢測水樣、土壤、中毒樣品、蔬菜等食品中甲萘威的殘留。
試劑盒測定原理首先將農(nóng)藥分子與大分子載體(如蛋白質(zhì))偶聯(lián)制得的復(fù)合物作為包被抗原吸附于固相載體上，然后加入待測農(nóng)藥和抗甲萘威抗體(間接ELISA法)或酶標(biāo)抗甲萘威抗體(直接ELISA法)。包被抗原、待測農(nóng)藥與抗甲萘威抗體(或酶標(biāo)抗甲萘威抗體)進(jìn)行競爭反應(yīng)，待測農(nóng)藥含量多，則被結(jié)合在包被抗原上的抗體少，最終酶促反應(yīng)顯色淺，反之結(jié)合在包被抗原的抗體(或酶標(biāo)抗體)多，最終酶促反應(yīng)顯色深。上述包被抗原、待測農(nóng)藥、抗甲萘威抗體或酶標(biāo)抗甲萘威抗體競爭結(jié)合反應(yīng)后，再加入底物溶液出現(xiàn)顯色反應(yīng)加以測定(間接ELISA法，加底物溶液前不需再加入酶標(biāo)2抗)。當(dāng)抗體或酶標(biāo)抗體量一定時(shí)，樣品中的待測農(nóng)藥量越多，與包被抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體就越少，發(fā)色反應(yīng)減弱，抑制率增高；反之，則發(fā)色反應(yīng)增強(qiáng)，抑制率減低，因而根據(jù)已知量農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)線和待檢樣品的抑制率，再根據(jù)抑制率與農(nóng)藥濃度之間的半對數(shù)關(guān)系作圖即得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并推算出待測農(nóng)藥的濃度。
抗甲萘威抗體的制備將人工合成的甲萘威免疫原(即甲萘威半抗原與牛血清白蛋白結(jié)合形成的偶聯(lián)物(CBRH-BSA))多次注射家兔刺激其體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生能對甲萘威農(nóng)藥分子或甲萘威包被原(甲萘威半抗原與卵清蛋白人工合成的偶聯(lián)物(CBRH-OVA))特異性識別結(jié)合的免疫球蛋白(IgG)。
一、免疫原的選擇和制備1、選擇甲萘威半抗原與載體蛋白結(jié)合比在20～30的偶聯(lián)物作免疫原。
2、弗氏佐劑的制備石蠟油與羊毛脂3∶1混勻濕熱高壓滅菌得弗氏不完全佐劑。在弗氏不完全佐劑中按規(guī)2mg/ml加卡介苗凍干粉混勻得弗氏完全佐劑。
3、佐劑免疫原的制備將免疫原溶液慢慢解凍，用生理鹽水稀釋至3mg/ml(以載體蛋白計(jì))按免疫劑量吸入適當(dāng)容積于注射器中，且免疫原與佐劑以1∶1(V/V)混合，后以用無菌橡膠管相連的兩支5ml滅菌玻璃注射器(總體積不超過4ml)交替推動，使佐劑與免疫原溶液充分混合乳化，形成油包水乳液，直至滴入冰水中暫不擴(kuò)散為止。
二、免疫方案選用健康純白新西蘭雄兔(體重約1.5kg左右)作為免疫動物。注射前耳靜脈采血制備少時(shí)對照血清(1～2ml)，低溫貯藏備用。然后將上述已制備好的佐劑免疫原用背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射法注射，以20～25點(diǎn)左右小劑量注射入兔體內(nèi)，總共注射7次，時(shí)間間隔第一次與第二次為4個(gè)周，其后每次的時(shí)間間隔為2周。四免后7-10天，耳緣靜脈采血制備少量抗血清，以陰性血清作對照，用瓊脂雙擴(kuò)散法和間接ELISA法檢測血清效價(jià)。待瓊擴(kuò)散效價(jià)達(dá)1∶16以上，以間接ELISA法測定抗血清終點(diǎn)效價(jià)達(dá)大于10萬，中點(diǎn)效價(jià)大于2萬。頸動脈全采血(無菌)制備抗血清于-20℃凍存。
三、抗體的純化1、硫酸銨鹽法(1)50ml燒杯中，X毫升血清+Xml生理鹽水，置于電磁攪拌器上。(2)緩慢滴入2X毫升飽和硫酸銨(PH7.0)，使達(dá)到50％的飽和度?？刂茢嚢杷俣炔怀鰵馀?。滴加完畢，繼續(xù)攪拌5分鐘。(3)室溫放置30分鐘。(4)離心3000轉(zhuǎn)/分×20分鐘。(5)棄去上清液，沉淀物溶于2X毫升生理鹽水，逐滴加飽和硫酸銨Xml使達(dá)33％飽和度。(6)室溫放置30分鐘。(7)棄去上清液，將沉淀物溶于2毫升生理鹽水，裝透析袋，置4℃冰箱0.01M PH7.0 P.B緩沖液透析，換液數(shù)次，每次換液時(shí)用納氏試劑檢查NH+；至不出現(xiàn)黃色沉淀為止。
2、DEAE纖維素柱層析法(1)DEAE預(yù)處理(2)裝柱、加樣和洗脫(3)合并、濃縮、測蛋白。
3、免疫球蛋白(IgG)濃度的測定將純化后的抗體溶液用生理鹽水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測OD280，按下式計(jì)算兔IgG含量 4、抗體的純度鑒定快速染色聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠濃度為6.5％。
酶標(biāo)抗體的制備(采用改良過碘酸鈉法)具體操作如下稱5～10mgHRP溶解于1mL蒸餾水中，于上液中加入0.2～0.4mL新配的0.1mol/L NalO4溶液，室溫下避光攪拌15～30分鐘。將上述溶液裝入透析袋中，用1mmol/LpH4.4的醋酸鹽緩沖液透析，4℃過夜。加20～40μl0.2mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入1～2ml含有10～20mg純化抗體的0.01mol/L碳酸鹽緩沖液，室溫避光輕輕攪拌2～3小時(shí)。加0.1～0.2mL新配的4mg/mLNaBH4液，混勻，再置4℃2～3小時(shí)。將反應(yīng)液裝入透析袋中，用0.15mol/LpH7.4PBS透析，4℃過夜。在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃1～2小時(shí)。3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨溶液洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/LpH7.4的PBS中。將上述溶液裝入透析袋中，對0.15mol/LpH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000～12,000rpm離心30分鐘，上清液即為酶結(jié)合物，用等量甘油分裝后，分別于-4℃、-20℃保存。經(jīng)直接ELISA法(E-Ab法)測定，效價(jià)為6400。
甲萘威人工抗原(含包被原)合成與鑒定稱取N-(α-萘乙?；?-6-氨基己酸(CBRH)60mg溶于3ml無水DMF，開啟攪拌，加入80μl三正丁胺，冰浴下緩慢滴加同1ml無水DMF溶解的氯甲酸異酯40μl，加畢，4℃攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后于室溫反應(yīng)1.5小時(shí)。
稱取BSA、OVA各40ml，分別溶于4ml0.05mol/L、pH8.7的硼酸鹽緩沖液，將上述反應(yīng)液分為二等分，分別用滴管緩慢滴加到不同蛋白質(zhì)溶液中，每種蛋白質(zhì)溶液中加一份，保持反溫度15℃左右。加畢，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12小時(shí)。
將反應(yīng)液置透析袋中，于4℃下對0.01mol/L、pH7.4PB透析，每6小時(shí)換一次緩沖液，直至透析液中測不出N-(α-萘乙酰基)-6-氨基己酸(CBRH)的紫外吸收為止。精確計(jì)量透析袋內(nèi)偶聯(lián)物溶液的體積。
將所得偶聯(lián)物溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使其OD293約為0.4～0.8。配制N-(α-萘乙?；?-6-氨基己酸(CBRH)溶液使其濃度為20μg/ml左右。另配制相應(yīng)載體蛋白溶液使其濃度為0.5mg/ml。分別對N-(α-萘乙酰基)-6-氨基己酸(CBRH)溶液、載體蛋白溶液和偶聯(lián)物溶液進(jìn)行紫外線吸收光譜掃描，掃描波長范圍240～320nm，根據(jù)掃描圖譜定性確定半抗原是否與載體蛋白發(fā)生了偶聯(lián)。然后根據(jù)OD292，分別計(jì)算各自的摩爾吸光數(shù)ε292。按下式計(jì)算N-(α-萘乙?；?-6-氨基己酸(CBRH)與載體蛋白的結(jié)合比。
甲萘威半抗原的合成稱取0.015mol α-萘乙酸加入100ml三口瓶中，用30ml苯溶解，室溫下加入0.015molSOCl2攪拌反應(yīng)半小時(shí)，再升溫回流攪拌反應(yīng)4小時(shí)(反應(yīng)生成的HCl用NaOH水溶液吸收)，將反應(yīng)液冷卻至室溫，攪拌下滴加0.02mol 6-氨基己酸鈉溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，靜置分層，取水相，苯層用pH＝10的碳酸鈉緩沖液，合并水相，冰浴下用5mol/LHCl調(diào)至pH＝12左右，有白色沉淀產(chǎn)生，濾取沉淀，濾液用乙醚取，合并乙醚提取液，用20mlpH＝2～3的HCl洗滌一次，乙醚層用Na2SO4干燥，過濾，蒸除乙醚，合并沉淀，用CH3COOC2H5重結(jié)晶，得N-(α-萘乙?；?-6-氨基己酸(CBRH)2.2克，m.p90～92℃。
H′-NMRδ(ppm)(內(nèi)標(biāo)TMS、溶劑CDCl3)0.9～1.6(m，6H，-CH2-CH2-CH2-)，2.0～2.3(t，2H，-CH2-COO)，2.9～3.2(q，2H，-NH-CH2-)，4.0(s，2H，CH2-CO-)，5.8(s，1H，NH)，7.2～8.0(m，7H，Ar-H)，10.7(s，1H，COOH)。
包被酶標(biāo)板的制備包被抗原(CBRH-OVA)用pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液(含1～2g碳酸鈉和2～4g碳酸氫鈉，雙蒸水1L)稀釋成0.5～4μg/mL，在酶標(biāo)板的每孔加100μL，4℃下包被過夜或37℃包被2h，傾去包被液，用PBST洗滌3次，拍干，然后在每孔中加入150μL5％明膠，放入37℃溫箱中0.4～1小時(shí)后用PBST洗滌3次，拍干后干燥保存。
檢測樣品的前處理水樣過濾后即可取樣進(jìn)行ELISA分析。
土樣取10g土壤用20～40mL丙酮提取三次，合并提取液，濃縮，然后用PBST稀釋定容至10mL，進(jìn)行ELISA分析。
蔬菜樣品取蔬菜樣品用粉碎機(jī)絞碎后稱取10g，20～40mL丙酮提取三次，合并提取液，濃縮，用PBST定容至10mL，取樣進(jìn)行ELISA分析。
血液取人體血液，加抗凝素后直接用ELISA法進(jìn)行分析。
洗胃液(2％碳酸氫鈉溶液)取10mL洗胃液，用稀HCI調(diào)pH值到中性后即可用ELISA法進(jìn)行分析。
嘔吐物取樣品研碎，離心取上清用ELISA法進(jìn)行分析。
試劑盒操作過程1)直接競爭ELISA法取出一塊包被有甲萘威包被抗原酶標(biāo)板，恢復(fù)到室溫后備用；加入50μL標(biāo)樣或處理好的樣品到各自孔中，標(biāo)樣和樣品做2～4個(gè)重復(fù)；加入50μL稀釋的酶標(biāo)抗體，37℃孵育1～2小時(shí)；倒出孔中的液體，將微板倒置在吸水紙上拍打，以保證完全除去孔中的液體，用200μL稀釋好的PBST洗2～6次，拍干；然后每孔加入100μL底物液，輕微振勻，并在37℃暗處孵育15～25分鐘進(jìn)行顯色反應(yīng)；加入50μL反應(yīng)終止液，混合好后，測定OD450nm值或者OD490nm值。
2)間接競爭ELISA法取出一塊包被有甲萘威包被抗原酶標(biāo)板，恢復(fù)到室溫后備用；加入50μL標(biāo)樣或處理好的樣品到各自孔中，標(biāo)樣和樣品做2～4個(gè)重復(fù)；加入50μL稀釋的抗體，37℃孵育1～2小時(shí)倒出孔中的液體，將微孔板倒置在吸水紙上拍打，以保證完全除去孔中的液體，用200μL稀釋好的PBST洗2～6次；加入100μL稀釋好酶標(biāo)二抗，37℃孵育1～2小時(shí)；倒出孔中的液體，將微孔板倒置在吸水紙上拍打，以保證完全除去孔中的液體，用200μL稀釋好的PBST洗2～6次；然后每孔加入100μL底物液與顯色物質(zhì)的混和液，輕微振勻，并在37℃暗處孵育15～25分鐘進(jìn)行顯色反應(yīng)；加入50μL反應(yīng)終止液，混合好后，測定OD450nm值或者OD490nm值。
以所獲得的標(biāo)樣和樣品吸光值的平均值計(jì)算各孔的吸光值的抑制率 ODmax為不加藥時(shí)的吸光值，ODx為農(nóng)藥X時(shí)的吸光值，ODmin為空白對照孔的吸光值。
計(jì)算的標(biāo)樣值繪成一個(gè)對應(yīng)甲萘威濃度(mg/L)的半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，直接競爭ELISA法的校正曲線在0.01～10mg/L范圍內(nèi)為線性；間接競爭ELISA法的校正曲線在0.005～10mg/L范圍內(nèi)為線性，對應(yīng)樣品濃度可從校正曲線讀出，也可根據(jù)標(biāo)樣的濃度與抑制率求出線性方程，然后求出對應(yīng)樣品的濃度。
有益效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能用于水樣、土壤、中毒樣品、蔬菜等食品中甲萘威殘留的檢測，樣品的前處理過程簡單，能同時(shí)檢測批量的樣品，樣品檢測成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的檢測方法。試劑盒采用強(qiáng)特異性、高效價(jià)的抗體，提高檢測的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度。試劑盒的保存期超過12個(gè)月。本發(fā)明簡單快速，適用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析方法，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


圖1是直接競爭ELISA法甲萘威標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2是間接競爭ELISA法甲萘威標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(五)
具體實(shí)施例方式
在下面實(shí)施例中更詳細(xì)地描述本發(fā)明，并非對本發(fā)明的限制，其中比例和百分比在沒有特別說明的情況下均為重量/重量比。
實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒產(chǎn)品包括盒體、盒體內(nèi)的96孔/40孔酶標(biāo)板和檢測試劑。
試劑盒中采用N-(α-萘乙?；?-6-氨基己酸與卵清蛋白的復(fù)合物作為包被抗原(CBRH-OVA)，將其用pH為9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖溶液(含1g碳酸鈉和4g碳酸氫鈉，雙蒸水1L)稀釋成4μg/mL，點(diǎn)于96孔/40孔酶標(biāo)板上，100μg/孔，并用5％明膠封閉。
盒內(nèi)試劑包含洗滌液(稀釋液)、底物稀釋液、抗甲萘威抗體(間接ELISA)、甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(適用于間接競爭ELISA法)、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗甲萘威兔抗體(適用于直接競爭ELISA法)、底物溶液和反應(yīng)終止液。配制方法如下洗滌液(稀釋液)40mL，組成比例為磷酸二氫鉀0.1g、磷酸氫二鈉4g、氯化鉀0.1g、吐溫-20 3mL、雙蒸水1000ml，為正常使用的15～30倍濃縮液；底物稀釋液50mL，配制如下檸檬酸3g，磷酸氫二鈉1g，雙蒸水，為正常使用的5～10倍濃縮液；酶底物為30％過氧化氫，15mL和鄰苯二胺固體粉末40mg；甲萘威和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔后產(chǎn)生的能與甲萘威分子、甲萘威包被原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(IgG)，抗甲萘威抗體(IgG)400ml，工作濃度為1∶1000(間接ELISA法)；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗甲萘威兔抗體(直接ELISA法)或者辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(間接ELISA法)200μL，為正常使用時(shí)800～1500倍濃縮液；上述辣根過氧化物酶標(biāo)抗甲萘威抗體為甲萘威抗體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物；反應(yīng)終止液為2mol/L的硫酸30mL；甲萘威不同濃度系列(0.1、0.5、2、10、50、100mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液6瓶，1～4mL/瓶，甲醇定容，使用時(shí)用PBST稀釋10倍。
實(shí)施例2本發(fā)明試劑盒產(chǎn)品包括盒體、盒體內(nèi)的96孔/40孔酶標(biāo)板和檢測試劑。
試劑盒中采用N-(α-萘乙酰基)-6-氨基己酸與卵清蛋白的復(fù)合物作為包被抗原(CBRH-OVA)，將其用pH為9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖溶液(含2g碳酸鈉和2g碳酸氫鈉，雙蒸水1L)稀釋成0.5μg/mL，點(diǎn)于96孔/40孔酶標(biāo)板上，100μg/孔，并用5％明膠封閉。
盒內(nèi)試劑包含洗滌液(稀釋液)、底物稀釋液、抗甲萘威抗體(間接ELISA)、甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(適用于間接競爭ELISA法)、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗甲萘威兔抗體(適用于直接競爭ELISA法)、底物溶液和反應(yīng)終止液。配制方法如下洗滌液(稀釋液)80mL，組成比例為磷酸二氫鉀0.3g、磷酸氫二鈉2g、氯化鉀0.3g、吐溫-20 0.5mL、雙蒸水500ml，為正常使用的15～30倍濃縮液；底物稀釋液30mL，配制如下檸檬酸6g，磷酸氫二鈉1g，雙蒸水，為正常使用的5～10倍濃縮液；酶底物為30％過氧化氫，10mL和鄰苯二胺固體粉末120mg；甲萘威和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔后產(chǎn)生的能與甲萘威分子、甲萘威包被原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(IgG)，抗甲萘威抗體(IgG)400ml，工作濃度為1∶500(間接ELISA法)；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗甲萘威兔抗體(直接ELISA法)或者辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(間接ELISA法)400μL，為正常使用時(shí)800～1500倍濃縮液；上述辣根過氧化物酶標(biāo)抗甲萘威抗體為甲萘威抗體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物；反應(yīng)終止液為2mol/L的硫酸50mL；甲萘威不同濃度系列(0.1、0.5、2、10、50、100mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液6瓶，1～4mL/瓶，甲醇定容，使用時(shí)用PBST稀釋10倍。
實(shí)施例3本發(fā)明試劑盒產(chǎn)品包括盒體、盒體內(nèi)的96孔/40孔酶標(biāo)板和檢測試劑。
試劑盒中采用N-(α-萘乙?；?-6-氨基己酸與卵清蛋白的復(fù)合物作為包被抗原(CBRH-OVA)，將其用pH為9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖溶液(含2g碳酸鈉和2g碳酸氫鈉，雙蒸水1L)稀釋成0.5μg/mL，點(diǎn)于96孔/40孔酶標(biāo)板上，100μg/孔，并用5％明膠封閉。
盒內(nèi)試劑包含洗滌液(稀釋液)、底物稀釋液、抗甲萘威抗體(間接ELISA)、甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(適用于間接競爭ELISA法)、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗甲萘威兔抗體(適用于直接競爭ELISA法)、底物溶液和反應(yīng)終止液。配制方法如下洗滌液(稀釋液)60mL，組成比例為磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鈉3g、氯化鉀0.2g、吐溫-20 1.5mL、雙蒸水750ml，為正常使用的15～30倍濃縮液；底物稀釋液45mL，配制如下檸檬酸4g，磷酸氫二鈉2g，雙蒸水，為正常使用的5～10倍濃縮液；酶底物為30％過氧化氫，12mL和鄰苯二胺固體粉末90mg；甲萘威和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔后產(chǎn)生的能與甲萘威分子、甲萘威包被原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(IgG)，抗甲萘威抗體(IgG)400ml，工作濃度為1∶750(間接ELISA法)；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗甲萘威兔抗體(直接ELISA法)或者辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(間接ELISA法)300μL，為正常使用時(shí)800～1500倍濃縮液；上述辣根過氧化物酶標(biāo)抗甲萘威抗體為甲萘威抗體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物；反應(yīng)終止液為2mol/L的硫酸40mL；甲萘威不同濃度系列(0.1、0.5、2、10、50、100mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液6瓶，1～4mL/瓶，甲醇定容，使用時(shí)用PBST稀釋10倍。
實(shí)施例4本發(fā)明試劑盒產(chǎn)品包括盒體、盒體內(nèi)的96孔/40孔酶標(biāo)板和檢測試劑。
試劑盒中采用N-(α-萘乙?；?-6-氨基己酸與卵清蛋白的復(fù)合物作為包被抗原(CBRH-OVA)，將其用pH為9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖溶液(含2g碳酸鈉和2g碳酸氫鈉，雙蒸水1L)稀釋成0.5μg/mL，點(diǎn)于96孔/40孔酶標(biāo)板上，100μg/孔，并用5％明膠封閉。
盒內(nèi)試劑包含洗滌液(稀釋液)、底物稀釋液、抗甲萘威抗體(間接ELISA)、甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(適用于間接競爭ELISA法)、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗甲萘威兔抗體(適用于直接競爭ELISA法)、底物溶液和反應(yīng)終止液。配制方法如下
洗滌液(稀釋液)70mL，組成比例為磷酸二氫鉀0.1g、磷酸氫二鈉4g、氯化鉀0.15g、吐溫-20 5.5mL、雙蒸水1000ml，為正常使用的15～30倍濃縮液；底物稀釋液45mL，配制如下檸檬酸3g，磷酸氫二鈉2.5g，雙蒸水，為正常使用的5～10倍濃縮液；酶底物為30％過氧化氫，14mL和鄰苯二胺固體粉末120mg；甲萘威和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔后產(chǎn)生的能與甲萘威分子、甲萘威包被原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(IgG)，抗甲萘威抗體(IgG)400ml，工作濃度為1∶700(間接ELISA法)；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗甲萘威兔抗體(直接ELISA法)或者辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(間接ELISA法)200μL，為正常使用時(shí)800～1500倍濃縮液；上述辣根過氧化物酶標(biāo)抗甲萘威抗體為甲萘威抗體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物；反應(yīng)終止液為2mol/L的硫酸350mL；甲萘威不同濃度系列(0.1、0.5、2、10、50、100mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液6瓶，1～4mL/瓶，甲醇定容，使用時(shí)用PBST稀釋10倍。
對本發(fā)明產(chǎn)品進(jìn)行如下測試1、保存期試驗(yàn)將試驗(yàn)劑盒放置于4℃和-20℃保存，分別取0，20，40，60，120，180，240，300和360d的試劑盒，以最佳抗體抗原工作濃度為測定濃度，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測以測定其檢測效果。保存期測定結(jié)果如下表表1.直接競爭ELISA法試劑盒保存期試驗(yàn)結(jié)果

表2.間接競爭ELISA法試劑盒保存期試驗(yàn)結(jié)果

以上結(jié)果可以看出，試劑盒在4℃下至少可保存12個(gè)月以上。
2、試劑盒靈敏度測定將甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成系列濃度，用直接ELISA法分析分別得到以下曲線(圖1)，由圖可得，直接ELISA法為y＝44.92+16.44x，甲萘威在0.01mg/L.～10mg/L范圍內(nèi)，Logit(B/B0)與甲萘威深度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r2＝0.9431，檢出限為0.01mg/L。用間接ELISA法分析分別得到以下曲線(圖2)，由圖可得，間接ELISA法為y＝63.34+9.82x，甲萘威在0.005mg/L～10mg/L范圍內(nèi)，Logit(B/B0)與甲萘威濃度的對數(shù)值呈著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r2＝0.9845，檢出限為0.005mg/L。
3、準(zhǔn)確度試驗(yàn)精密度試驗(yàn)取三個(gè)濃度的甲萘威標(biāo)樣，添加到樣品中，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)，進(jìn)行測定。試劑盒回收率的結(jié)果如下，水為96.8％～106.8％，蔬菜為110.8％～117.5％。水樣的變異系數(shù)均低于5.5％，蔬菜的變異系數(shù)均低于11.5％。
4、試劑盒特異性試驗(yàn)選擇甲萘威的類似物如克百威、滅多威、α-萘酚，反應(yīng)步驟同試劑盒操作，得到各種農(nóng)藥抑制中濃度。再用下式計(jì)算農(nóng)藥對甲萘威的交叉反應(yīng)性。交叉反應(yīng)率愈小，反應(yīng)的特異性愈強(qiáng)。交叉反應(yīng)率愈大，交叉反應(yīng)率可按下式計(jì)算，

本試驗(yàn)測定結(jié)果見表3。從表3可以知道，間接ELISA法抑制率達(dá)50％時(shí)，甲萘威所需濃度為30ug/L，其它幾種有機(jī)磷類農(nóng)藥所需濃度為120～1000ug/L。說明該試劑盒的特異性好，可保證對樣品中甲萘威殘留測定結(jié)果的可靠性。
表3.試劑盒特異性試驗(yàn)

權(quán)利要求
1.一種適用于甲萘威殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，它包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和/或試管和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑，其特征在于，在酶標(biāo)板的每個(gè)孔內(nèi)含有抗甲萘威包被抗原，盒內(nèi)試劑包含抗甲萘威抗體、甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶標(biāo)記抗甲萘威抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中，盒內(nèi)試劑還包含洗滌液、底物稀釋液、底物溶液和反應(yīng)終止液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，所述的包被抗原由包被液包被，并用明膠進(jìn)行封閉；其中，所述的包被抗原為N-(α-萘乙?；?-6-氨基己酸與卵清蛋白的復(fù)合物；所述作為包被液的碳酸鹽緩沖溶液組成比例為1～2g碳酸鈉和2～4g碳酸氫鈉，雙蒸水1L，PH＝9.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的試劑盒，其中，所述抗甲萘威抗體為通過甲萘威和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔后產(chǎn)生的能與甲萘威分子、甲萘威包被原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(IgG)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的試劑盒，其中，所述酶標(biāo)抗甲萘威抗體為甲萘威抗體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中，所述的酶標(biāo)抗甲萘威抗體是辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記抗甲萘威兔抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一所述的試劑盒，其中，所說的洗滌液組成比例為磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉2～4g、氯化鉀0.1～0.3g、吐溫-20 0.5～3mL、雙蒸水500ml～1000ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的試劑盒，其中，所說的底物稀釋液組成比例為檸檬酸3～6g，磷酸氫二鈉1～3g，雙蒸水500ml～1000ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一所述的試劑盒，其中，所說的底物溶液為30％過氧化氫10～15mL和鄰苯二胺固體粉末40～120mg。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9之一所述試劑盒，其中，所說的反應(yīng)終止液為2mol/L硫酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于甲萘威殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，它包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板/試管及設(shè)在盒體內(nèi)的試劑。在酶標(biāo)板的每孔內(nèi)，由包被液包被能與抗甲萘威抗體特異性合反應(yīng)的包被抗原，并用明膠進(jìn)行封閉，盒內(nèi)試劑包含洗滌液、底物稀釋液、甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液、抗甲萘威抗體、酶標(biāo)抗甲萘威抗體、底物、顯色物質(zhì)和反應(yīng)終止液。本發(fā)明能用于水、土壤、蔬菜等食品中及中毒樣品中甲萘威殘留的快速檢測，樣品的前處理過程簡單，能同時(shí)檢測批量的樣品，樣品檢測成本低于傳統(tǒng)的檢測方法。
文檔編號G01N33/53GK1523356SQ0315678
公開日2004年8月25日 申請日期2003年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月12日
發(fā)明者張友軍, 孫家隆, 王升吉, 尚佑芬, 趙玖華, 楊崇良, 祁凱, 徐寶云, 吳青君, 路興波, 孫紅煒 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所