專利名稱：用于同時檢測四種致畸胎疾病的試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種用于同時檢測四種致畸胎疾病的試劑盒及其制備方法。
背景技術：
ToRCH是四種人類致病微生物英文名稱字頭的組合包括弓形蟲(TOX)、風疹病毒(RV)、巨細胞病毒(CMV)以及單純皰疹病毒(HSV)I和II型。它們是四種最可能導致畸胎的傳染病的病原體。
巨細胞病毒屬皰疹病毒群，其傳染源是患者和無癥狀的隱性感染者。若孕婦感染單純皰疹易引起流產、死胎，后期感染主要引起小兒頭畸形、智力發(fā)育障礙，亦有報道可引起先天性心臟病、臍疝、足畸形和肝脾腫大等。
單純皰疹是由單純皰疹病毒所致的傳染性疾病，根據其抗原性質的不同分為兩型即HSV I和HSV II。若孕婦感染單純皰疹，妊娠早期可引起死胎、流產、小兒頭畸形、小眼畸形、腦內鈣化等神經系統(tǒng)畸形，其癥狀與巨細胞病毒相似。
風疹病毒是傳染性最強的致畸因子，亦是致畸作用最明顯的一種病毒。風疹病毒誘發(fā)先天性畸形除白內障外，還有心臟畸形(動脈導管未閉、心房和心室間隔缺損)、耳聾、青光眼、小眼、小頭、智能發(fā)育不全和牙釉質缺損等。最近發(fā)現風疹病毒還可以引起胎兒生長遲緩，心肌損害?；硷L疹發(fā)生先天性畸形可達40％以上。
弓形蟲是專一性的細胞內寄生蟲，它破壞人體除紅細胞以外的所有有核細胞。若孕婦感染弓形蟲，還可通過胎盤感染胎兒，造成早產、死產或胎兒畸形或其它先天性疾病，尤其是造成智力低下，帶來嚴重后果。在我國，每年出生100多萬與弓形蟲感染有關的畸形兒和先天性殘疾兒。
ToRCH患者造成孕婦流產、死胎，勉強出生后有嚴重的智力障礙，生活不能自理，并伴有復雜的心血管病，需要家人的長期照顧，造成極大的精神及經濟負擔。我國每年約有1000萬個產婦，26000個ToRCH患兒出生，平均每小時就有3個。由于成人ToRCH感染的臨床癥狀不明顯，因此一般不易察覺。
世界上許多發(fā)達國家已將ToRCH列為孕期常規(guī)檢查項目，在優(yōu)生優(yōu)育方面發(fā)揮重要作用。在國內，隨著科學技術的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對優(yōu)生優(yōu)育的認識逐步提高，許多地區(qū)已將ToRCH檢測作為孕期常規(guī)檢查項目。
ToRCH在臨床診斷上通常檢測的是針對相應病原物感染后人體內產生的IgG或IgM。檢出特異性IgM說明患者為近期感染，或潛伏的病毒被激活產生復發(fā)感染；檢出特異性IgG則為繼往感染，已有一定的免疫水平。當患者復發(fā)感染時，IgM和IgG都會較快地上升到高滴度，其中IgG上升極其顯著(一般可上升4倍以上的水平)，因此臨床上若檢測出高滴度的IgG，則意味著再次感染。
目前ToRCH感染的實驗室診斷常規(guī)采用ELISA方法，另外還有PCR、金標等方法。PCR具有靈敏度極高的特點，能直接檢測病原體基因；金標法比較操作簡單，適合基層單位使用；而ELISA通常檢測病原的特異性抗體，靈敏度較高、特異性較強。但以上方法涉及的試劑較多，操作復雜，反應時間長。
生物芯片技術是九十年代中期興起的一項新興生物技術，因其可在一次反應中進行多種信息的平行分析，而受到眾多研究者的矚目，迅速在諸多生物學領域得到應用。生物芯片技術按檢測對象分類，主要分為基因芯片和蛋白芯片兩類。蛋白芯片通過固定于支持介質上的多種蛋白質構成的微陣列，直接檢測特定功能物質(標志性蛋白)。與傳統(tǒng)檢測方式相比，利用蛋白芯片技術對特殊致病微生物進行檢測具有以下優(yōu)點1)高通量，同時可進行多人份多指標的檢測，也可單獨使用；2)高敏感度和特異性；3)操作快速、簡便，適用于臨床即時檢測，只需一個半小時便能完成整個檢測反應過程；4)所需樣本量少。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于利用蛋白芯片技術，同時對巨細胞病毒(CMV)、單純皰疹病毒(HSV)、風疹病毒(RV)和弓形蟲(TOX)進行檢測，提供一種靈敏、準確、迅速的孕婦血樣檢測的試劑盒。
本發(fā)明公開的用于同時檢測ToRCH指標的試劑盒由蛋白芯片、反應液、洗滌液組成。蛋白芯片由固相載體和固定在該載體上的與ToRCH相關蛋白組成。其中所述的固相載體選自經硅烷化處理的載玻片或有機聚合物材料等；所述的ToRCH相關蛋白包括CMV特異性抗原，HSV I、II型特異性抗原、RV特異性抗原和TOX特異性抗原；各抗原點樣體積為1-100nl，點樣濃度為1×10-6-100mg/ml。
為提高檢測的準確度和可靠性，本發(fā)明蛋白芯片中還設計了陰性對照和一系列已知濃度的內參照IgG，IgM。其中陰性對照為兔肌球蛋白(myosin)、肌動蛋白或膠原蛋白等。
本發(fā)明試劑盒中的反應液為熒光試劑標記的抗人IgG、抗人IgM或熒光試劑標記的抗人IgG和抗人IgM的混合物。該熒光試劑可以為Fluorescein，Rhodamine，Coumarin，CY Dyes和Alexa Dyes，其中優(yōu)選CY Dyes和Alexa Dyes，與其他熒光試劑相比，上述兩種試劑具有更好的光穩(wěn)定性，高水溶性和高熒光效率。
本發(fā)明試劑盒中洗滌液至少含有一種下述濃度的溶液0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8、0.1-1.0％Tween20。
本發(fā)明所述固相載體為經過硅烷化處理的載玻片，特別是經過氨丙基三甲氧基硅烷試劑處理的玻片；有機聚合物材料是指聚苯乙烯等。
本發(fā)明所述的硅烷化處理的載玻片通過下述方法制得1)載玻片用鉻酸洗液浸泡過夜，蒸餾水洗，浸入10--30％氨水中過夜，蒸餾水洗；2)玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷(Aldrich)的50--95％乙醇溶液中，用冰醋酸調節(jié)pH至3-5，室溫處理，乙醇超聲清洗，水超聲清洗，140--180℃烘干2-24小時；
3)用2-8％戊二醛處理成醛基化；4)使用前0.01-5％SDS和清水各洗兩次，空氣干燥后0.01--5％NaBH4溶液還原5--30min，0.01-5％SDS洗一次，水洗一次，空氣干燥后用待用。
本發(fā)明所要解決的另一技術問題是提供上述檢測試劑盒的制備方法。
一、蛋白芯片的制備方法1)用稀釋液將蛋白芯片上所要點制的蛋白質稀釋到一定濃度；用芯片自動點樣系統(tǒng)將這些蛋白質點制在固相基質上，點樣密度在10-200點/cm2；HSV II型特異性抗原，RV特異性抗原，TOX特異性抗原的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20；CMV特異性抗原稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01-30％蔗糖；HSV I型特異性抗原和標準IgG的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01--20％聚烯吡酮(PVP)；標準IgM的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.1-1.0％Tween20，0.01-0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)；2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理，以避免固相載體上未固定蛋白的區(qū)域隨機吸附其它蛋白質，影響反應結果。干燥0.5-24小時；其中所述的封閉液配方為70-95％CBS，5-15％小牛血清，1-9％蔗糖；或1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN3的PBS。
為確保產品的質量，蛋白芯片的制備過程應嚴格控制環(huán)境溫度和環(huán)境濕度。溫度應控制在18-28℃，濕度控制在35-70％。
二、反應液的制備Alexa Dyes標記的抗IgG抗體和Alexa Dyes標記的抗IgM抗體外購，反應液中熒光標記的IgM抗體和熒光標記的IgG抗體的比例為(0-1)∶0.5。
三、洗滌液的制備至少含有一種下述濃度的溶液0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8、0.1-1.0％Tween20。
本發(fā)明公開的同時檢測巨細胞病毒、單純皰疹病毒、風疹病毒和弓形蟲所感染的試劑盒具體使用方法包括1)將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍；2)血樣用洗滌液按1∶50稀釋，吸取200μl加入芯片上；3)25--37℃振蕩反應20--60分鐘，棄去液體；4)加滿稀釋后的洗滌液，溫育振蕩2--10分鐘，棄去洗滌液。共洗滌3次；5)加200μl反應液于芯片上；6)用掃描儀采集數據，并進行數據分析。
本發(fā)明同時檢測四種致畸胎疾病的試劑盒，由于采用了經特殊處理的固相載體和陰性對照，使對四種致畸胎疾病的檢測更為準確和靈敏。
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。


圖1 蛋白芯片點樣示意2 弓形蟲病人血樣檢測結果3 風疹病毒病人血樣檢測結果4 IgM標準曲線圖5 IgG標準曲線
具體實施例方式實施例1硅烷化玻片的制備(1)載玻片用鉻酸洗液浸泡過夜，蒸餾水洗，浸入25％氨水中過夜，Milli-Q水洗。
(2)玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷(Aldrich)的95％乙醇溶液中，用冰醋酸調節(jié)pH至4.5，室溫處理，95％乙醇超聲清洗，水超聲清洗，160℃烘干4hrs。
(3)用5％戊二醛處理成醛基化。
使用前0.2％SDS和清水各洗兩次，空氣干燥后1％NaBH4溶液還原10min，0.2％SDS洗一次，水洗一次，空氣干燥后用待用。
實施例2用于檢測ToRCH相關指標蛋白芯片的制備嚴格控制生產過程溫度25±1℃，濕度控制在55±3％。
(1)用稀釋液將蛋白芯片上所要點制的蛋白質稀釋到一定濃度；用芯片自動點樣系統(tǒng)將這些蛋白質點制在固相基質上，點樣密度在20點/cm2。點樣體積為20nl/點，點樣濃度為20mg/l。
(2)點陣排布如下(點樣示意圖見圖1)

HSV II型特異性抗原，RV特異性抗原，TOX特異性抗原，兔肌球蛋白的稀釋液的配方為0.15％KCl，1.4％Na2HPO4，0.2％KH2PO4，6％NaCl，pH為7.5，0.2％Tween20。
CMV特異性抗原稀釋液的配方為0.15％KCl，1.4％Na2HPO4，0.2％KH2PO4，6％NaCl，pH為7.5，0.2％Tween20，10％蔗糖。
HSV I型特異性抗原和標準IgG的稀釋液的配方為0.15％KCl，1.4％Na2HPO4，0.2％KH2PO4，6％NaCl，pH為7.5，0.2％Tween20，0.1-1.0％Tween20，10％聚烯吡酮(PVP)。
標準IgM的稀釋液的配方為0.15％KCl，1.4％Na2HPO4，0.2％KH2PO4，6％NaCl，pH為7.5，0.2％Tween20，0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)。
(3)用封閉液將蛋白芯片封閉處理30分鐘，干燥過夜。
其中所述的封閉液配方為6％BSA，4％蔗糖，0.3％NaN3的PBS。
實施例3ToRCH相關指標檢測試劑盒的制備方法1、蛋白芯片的制備同實施例22、濃縮洗滌液的制備按以下配方配制洗滌液0.3％KCl，1.2％Na2HPO4，0.8％KH2PO4，11％NaCl，0.6％Tween20，調pH值為7.4。
3、反應液的制備Alexa Dyes標記的抗IgG抗體和Alexa Dyes標記的抗IgM抗體外購。反應液中熒光標記的抗IgM抗體和熒光標記的抗IgG抗體的比例為1∶1。
實施例4ToRCH相關指標檢測試劑盒的使用方法用ToRCH相關指標檢測試劑盒對弓形蟲病人血樣、風疹病毒病人血樣進行檢測(1)濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍。
(2)血樣用洗滌液按1∶50稀釋，吸取200μl加入芯片上。
(3)37℃振蕩反應30分鐘，棄去液體。
(4)加滿稀釋后的洗滌液，溫育振蕩5分鐘，棄去洗滌液。共洗滌3次。
(5)加200μl反應液于芯片上。
(6)用掃描儀采集數據，并進行數據分析IgM標準曲線如圖4所示，IgG標準曲線如圖5所示。檢測結果如圖2、圖3所示。
權利要求
1.一種同時檢測四種致畸胎疾病的試劑盒，該試劑盒包括蛋白芯片、反應液和洗滌液，其中蛋白芯片由固相載體和固定在該載體上的與ToRCH相關蛋白組成，其特征在于其中的蛋白芯片的固相載體選自經硅烷化處理的載玻片或有機聚合物材料；所述的與ToRCH相關蛋白包括CMV特異性抗原，HSVI、II型特異性抗原、RV特異性抗原和TOX特異性抗原，各抗原點樣體積為1-100nl，點樣濃度為1×10-6-100mg/ml；在蛋白芯片上還點有陰性對照和一系列已知濃度的內參照IgG，IgM，陰性對照為兔肌球蛋白、肌動蛋白或膠原蛋白。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于其中所述的洗滌液至少含有一種下述濃度的溶液0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8、0.1-1.0％Tween20。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于其中所述的反應液為熒光試劑標記的抗人IgG、抗人IgM或熒光試劑標記的抗人IgG和抗人IgM的混合物。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于其中所述的反應液為比例為(0-1)∶0.5的熒光標記IgM抗體和熒光標記IgG抗體。
5.根據權利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于該試劑盒的蛋白芯片制備包括下述步驟(1)硅烷化處理的載玻片制備1)載玻片用鉻酸洗液浸泡過夜，蒸餾水洗，浸入10-30％氨水中過夜，蒸餾水洗；2)玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的50-95％乙醇溶液中，用冰醋酸調節(jié)pH至3-5，室溫處理，乙醇超聲清洗，水超聲清洗，140-180℃烘干2-24小時；3)用2-8％戊二醛處理成醛基化；4)使用前0.01-5％SDS和清水各洗兩次，空氣干燥后0.01-5％NaBH4溶液還原5-30min，0.01-5％SDS洗一次，水洗一次，空氣干燥后用待用；(2)蛋白芯片的制備方法1)用稀釋液將蛋白芯片上所要點制的蛋白質稀釋到一定濃度；用芯片自動點樣系統(tǒng)將這些蛋白質點制在步驟(1)制得的硅烷化處理的載玻片，點樣密度在10-200點/cm2；HSVII型特異性抗原，RV特異性抗原，TOX特異性抗原的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20；CMV特異性抗原稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01-30％蔗糖；HSVI型特異性抗原和標準IgG的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01-20％聚烯吡酮；標準IgM的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.1-1.0％Tween20，0.01-0.5％十二烷基硫酸鈉；2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理，以避免固相載體上未固定蛋白的區(qū)域隨機吸附其它蛋白質，影響反應結果，干燥0.5-24小時；其中所述的封閉液配方為70-95％CBS，5-15％小牛血清，1-9％蔗糖；或1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN3的PBS。3)制備時控制環(huán)境溫度在18-28℃，濕度控制在35-70％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于同時檢測四種致畸胎疾病的試劑盒及其制備方法。該試劑盒包括蛋白芯片、反應液和洗滌液，其中蛋白芯片由固相載體和固定在該載體上的與ToRCH相關蛋白組成，其特征在于其中的蛋白芯片的固相載體選自經硅烷化處理的載玻片或有機聚合物材料；所述的與ToRCH相關蛋白包括CMV特異性抗原，HSVI、II型特異性抗原、RV特異性抗原和TOX特異性抗原，各抗原點樣體積為1－100nl，點樣濃度為1＊10
文檔編號G01N33/53GK1595158SQ0315098
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月12日 優(yōu)先權日2003年9月12日
發(fā)明者李潤生 申請人:上海前沿生物技術有限公司