專利名稱：有機(jī)磷農(nóng)藥的識(shí)別元件及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有機(jī)磷農(nóng)藥識(shí)別元件及其制作方法。
背景技術(shù)：
近年來，酶?jìng)鞲衅饔捎诰哂锌焖?、靈敏、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)而在環(huán)境污染物的監(jiān)測(cè)方面受到越來越多的關(guān)注。酶?jìng)鞲衅髦饕勺R(shí)別元件和換能器組成。后者一般為pH電極，其制作技術(shù)比較成熟；而前者為固定化的敏感生物酶，在制備技術(shù)上尚無(wú)理想的方法。如果敏感生物酶不能牢固地結(jié)合在載體上而組成靈敏、穩(wěn)定的識(shí)別元件，則由其構(gòu)成的酶?jìng)鞲衅骶筒荒苓B續(xù)自動(dòng)檢測(cè)環(huán)境中的目標(biāo)污染物。
目前，常見的乙酰膽堿酯酶固定方法是采用戊二醛交聯(lián)法將酶固定在作為載體的纖維素薄膜上。但是，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，利用這種技術(shù)所形成的固定化酶由于是被固定在纖維素膜上，難以達(dá)到穩(wěn)定、牢固和均勻，通常適于一次性使用，且操作不便，重復(fù)性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)的不足，提供一種有機(jī)磷農(nóng)藥的識(shí)別元件及其制作方法。
本發(fā)明是一個(gè)兩端為細(xì)管的管狀體內(nèi)注有半固體狀態(tài)的固定化乙酰膽堿酯酶的結(jié)構(gòu)體。
本發(fā)明的制備方法的關(guān)鍵工藝是利用凝膠制成固定化乙酰膽堿酯酶。這是一種半固體化的穩(wěn)定性高的有機(jī)磷農(nóng)藥敏感材料，只要將其注入上述管狀體中，就可得到本發(fā)明的識(shí)別元件。
制備方法為首先將凝膠進(jìn)行預(yù)處理，以除去凝膠中所含的添加劑，再盡可能除去其中的液體，保留粉狀凝膠；再偶聯(lián)普魯卡因胺配體，即在其中加入配體——普魯卡因胺和偶聯(lián)劑——乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)溶液，在20℃左右振蕩10h以上，以上述偶聯(lián)劑將多余的配體洗掉，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗，以除去剩余的偶聯(lián)劑(EDAC)，得到經(jīng)過預(yù)處理和偶聯(lián)的凝膠；而后，進(jìn)行乙酰膽堿脂酶的固定，即將一定活力的純化的乙酰膽堿酯酶加入其中，在4℃下振蕩5h以上，靜置后棄去上部溶液，再用至少10mL的0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)反復(fù)多次洗滌下部的凝膠酶，每次洗滌后都棄去上部溶液。然后用上述磷酸鹽緩沖溶液定容到一定體積，即制成以凝膠為載體的半固體狀態(tài)的固定化乙酰膽堿酯酶，最后，向一個(gè)兩端有細(xì)管、底部平放一個(gè)篩絹圓片的管柱內(nèi)，準(zhǔn)確加入上述制得的活力為1-5U的固定化乙酰膽堿酯酶即制成。
以本方法固定的半固體狀態(tài)的生物酶能方便注入管狀體內(nèi)而制成靈敏度高、均勻穩(wěn)定的識(shí)別元件，其線性好，工作壽命長(zhǎng)，是檢測(cè)水體中特別是海水中的微量有機(jī)磷農(nóng)藥的必備器件。


圖1為識(shí)別元件的基本結(jié)構(gòu)示意圖其中，1、管狀體2、固定化酶3、阻酶層4、細(xì)管具體實(shí)施方式
如圖1，本發(fā)明是一個(gè)兩端為細(xì)管4的管狀體1內(nèi)注有半固體狀態(tài)的固定化乙酰膽堿酯酶2的結(jié)構(gòu)體。其中作為敏感材料的固定化酶2是以凝膠為載體的乙酰膽堿酯酶，呈半固體狀態(tài)。此乙酰膽堿酯酶適于采用魚類、蒼蠅、電鰻、昆蟲等動(dòng)物體內(nèi)提取純化的乙酰膽堿酯酶。其加入量(以酶活力表示)可視待測(cè)水樣中有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度高低而不同。進(jìn)一步考慮到防止酶的流失，還可以在管狀體1下部設(shè)置一種防止固定化酶2流失的阻酶層3。阻酶層3宜選用300-400目的篩絹或玻璃纖維。管狀體1兩端的細(xì)管4的作用只是便于外接軟管。如果不需外接，自然應(yīng)當(dāng)省去或只保留其中一端的細(xì)管。
本發(fā)明使用方便。只需根據(jù)所測(cè)樣品的有機(jī)磷農(nóng)藥濃度，準(zhǔn)確吸取含固定化酶的溶液加入玻璃短管或塑料管內(nèi)即可，所制成的識(shí)別元件對(duì)水體中微量的甲基對(duì)硫磷和馬拉硫磷有靈敏的線性響應(yīng)；而且其工作壽命長(zhǎng)，在傳感器中可以連續(xù)使用的時(shí)間為傳統(tǒng)戊二醛交聯(lián)法的三倍以上；對(duì)溫度的適應(yīng)性強(qiáng)，在16-30℃之間，該固定化酶的活力沒有顯著變化；保質(zhì)期長(zhǎng)。在4℃保存，活性至少2個(gè)月沒有明顯下降。
作為實(shí)施例，以測(cè)定海水中微量有機(jī)磷農(nóng)藥的識(shí)別元件制備為例。其步驟如下(1)凝膠預(yù)處理將1g的CH Sepharose 4B凝膠的凍干粉與10mL濃度1mM的鹽酸(HCl)混合，保持30min使凝膠膨脹；用至少10mL濃度為1mM的HCl溶液分?jǐn)?shù)次洗滌溶脹凝膠，以除去溶脹凝膠中所含的添加劑。再用吸水紙盡可能除去液體，保留粉狀凝膠；(2)偶聯(lián)普魯卡因胺配體向上述粉狀凝膠中加入8.2mg普魯卡因胺和1.5mL濃度0.01M的偶聯(lián)劑——乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)溶液，在20℃下振蕩24h；用10mL濃度為0.01M的偶聯(lián)劑(EDAC)溶液將多余的配體洗掉；再用20mL 0.1M的磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)沖洗，以除去剩余的偶聯(lián)劑(EDAC)溶液。
(3)乙酰膽堿酯酶(AChE)的固定將待固定的乙酰膽堿酯酶(AChE)溶液用比色法預(yù)先測(cè)定酶活力。吸取5個(gè)活力單位(U)的AChE溶液，加入上述經(jīng)過預(yù)處理和偶聯(lián)的凝膠中，在4℃下振蕩6h；靜置15min，棄去上部溶液，用0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)10mL反復(fù)多次洗滌下部的凝膠酶，每次洗滌后都棄去上部溶液。然后，用上述磷酸鹽緩沖溶液定容到5.00mL，即制成以CH Sepharose 4B凝膠為載體的半固體狀態(tài)的固定化酶。
(4)管柱裝酶取一個(gè)兩端有細(xì)管的管柱，在其底部平整放入一個(gè)直徑與管柱內(nèi)徑匹配的300目的篩絹圓片，從上部細(xì)管向管柱內(nèi)準(zhǔn)確加入活力為1U的固定化乙酰膽堿酯酶。
此識(shí)別元件可以與pH電極組合為酶?jìng)鞲衅?，用于指示水體特別是海水中有機(jī)磷農(nóng)藥的污染程度。
權(quán)利要求
1.一種有機(jī)磷農(nóng)藥識(shí)別元件，其特征在于它是一個(gè)兩端為細(xì)管(4)的管狀體(1)內(nèi)注有半固體狀態(tài)的固定化乙酰膽堿酯酶(2)的結(jié)構(gòu)體。
2.如權(quán)利要求1所述的有機(jī)磷農(nóng)藥識(shí)別元件，其特征是在管狀體(1)下部設(shè)置一種防止固定化酶(2)流失的阻酶層(3)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的有機(jī)磷農(nóng)藥識(shí)別元件，其特征是作為敏感材料的固定化酶(2)是以凝膠為載體的呈半固體狀態(tài)的乙酰膽堿酯酶，。
4.如權(quán)利要求2所述的有機(jī)磷農(nóng)藥識(shí)別元件，其特征是阻酶層(3)宜選用300-400目的篩絹或玻璃纖維。
5.一種有機(jī)磷農(nóng)藥識(shí)別元件的制作方法，首先將凝膠進(jìn)行預(yù)處理，以除去凝膠中所含的添加劑，再盡可能除去其中的液體，保留粉狀凝膠；再偶聯(lián)普魯卡因胺配體，即在其中加入配體——普魯卡因胺和偶聯(lián)劑——乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶液，在20℃左右振蕩10h以上，以上述偶聯(lián)劑將多余的配體洗掉，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖溶液沖洗，以除去剩余的偶聯(lián)劑，得到經(jīng)過預(yù)處理和偶聯(lián)的凝膠；而后，進(jìn)行乙酰膽堿脂酶的固定，即將一定活力的純化的乙酰膽堿酯酶加入其中，在4℃下振蕩5h以上，靜置后棄去上部溶液，再用至少10mL的0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)反復(fù)多次洗滌下部的凝膠酶，每次洗滌后都棄去上部溶液。然后用上述磷酸鹽緩沖溶液定容到一定體積，即制成以凝膠為載體的半固體狀態(tài)的固定化乙酰膽堿酯酶，最后，向一個(gè)兩端有細(xì)管、底部平放一個(gè)篩絹圓片的管柱內(nèi)，準(zhǔn)確加入上述制得的活力為1-5U的固定化乙酰膽堿酯酶即制成。
6.有機(jī)磷農(nóng)藥識(shí)別元件的制作步驟如下(1)凝膠預(yù)處理將1g的CH Sepharose 4B凝膠的凍干粉與10mL濃度1mM的鹽酸混合，保持30min使凝膠膨脹；用至少10mL濃度為1mM的HCl溶液分?jǐn)?shù)次洗滌溶脹凝膠，以除去溶脹凝膠中所含的添加劑。再用吸水紙盡可能除去液體，保留粉狀凝膠；(2)偶聯(lián)普魯卡因胺配體向上述粉狀凝膠中加入8.2mg普魯卡因胺和1.5mL濃度0.01M的偶聯(lián)劑——乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽溶液，在20℃下振蕩24h；用10mL濃度為0.01M的偶聯(lián)劑(EDAC)溶液將多余的配體洗掉；再用20mL 0.1M的磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)沖洗，以除去剩余的偶聯(lián)劑(EDAC)溶液。(3)乙酰膽堿酯酶的固定將待固定的乙酰膽堿酯酶溶液用比色法預(yù)先測(cè)定酶活力。吸取5個(gè)活力單位的AChE溶液，加入上述經(jīng)過預(yù)處理和偶聯(lián)的凝膠中，在4℃下振蕩6h；靜置15min，棄去上部溶液，用0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0)10mL反復(fù)多次洗滌下部的凝膠酶，每次洗滌后都棄去上部溶液。然后，用上述磷酸鹽緩沖溶液定容到5.00mL，即制成以CH Sepharose 4B凝膠為載體的半固體狀態(tài)的固定化酶。(4)管柱裝酶取一個(gè)兩端有細(xì)管的管柱，在其底部平整放入一個(gè)直徑與管柱內(nèi)徑匹配的300目的篩絹圓片，從上部細(xì)管向管柱內(nèi)準(zhǔn)確加入活力為1U的固定化乙酰膽堿酯酶。
全文摘要
有機(jī)磷農(nóng)藥識(shí)別元件及其制作方法，本發(fā)明是一個(gè)兩端為細(xì)管的管狀體內(nèi)注有半固體狀態(tài)的固定化乙酰膽堿酯酶的結(jié)構(gòu)體。還可以在管狀體下部設(shè)置一種防止固定化酶流失的阻酶層。上述固定化酶是以凝膠為載體的乙酰膽堿酯酶，呈半固體狀態(tài)。其制備方法首先將凝膠預(yù)處理；然后偶聯(lián)普魯卡因胺配體；再將乙酰膽堿酯酶進(jìn)行固定；最后，向一個(gè)兩端有細(xì)管、底部平放一個(gè)篩絹圓片的管柱內(nèi)，準(zhǔn)確加入上述制得的活力為1~5U的固定化乙酰膽堿酯酶即制成。以本方法固定的半固體狀態(tài)的生物酶能方便注入管狀體內(nèi)而制成靈敏度高、均勻穩(wěn)定的識(shí)別元件、線性好、工作壽命長(zhǎng)，是檢測(cè)水體中特別是海水中的微量有機(jī)磷農(nóng)藥的必備器件。
文檔編號(hào)G01N27/327GK1514238SQ03139140
公開日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月18日
發(fā)明者孟范平, 唐學(xué)璽, 朱小山, 何東海, 馬冬, 楊正先 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)