專利名稱：測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用標(biāo)記的快速延遲校正鉀通道(IKR)的封阻劑，例如[3H]-多非利特或[3H]-MK-499，以確定化合物在″e(cuò)ther-a-go-go″(ERG)鉀(K+)通道，特別是人ERG(hERG)鉀通道的親和力的測(cè)定法。這種測(cè)定法可用于鑒定對(duì)人心臟復(fù)極化具有不良效果，特別是延長(zhǎng)心電圖QT間隔，有可能導(dǎo)致扭轉(zhuǎn)峰值傾向的化合物。
近年來，一些被建議作為治療用途的化合物的開發(fā)，由于在晚期藥物開發(fā)中檢測(cè)到對(duì)人心臟復(fù)極化具有不良效果而被放棄。這些藥物的效果是在心電圖(ECG)的QT間隔方面被評(píng)估的。QT間隔是ECG的一部分，代表了從心室去極化開始到心室復(fù)極化結(jié)束的時(shí)間。因?yàn)镼T間隔可以受到心率的影響，隨心率下降而變長(zhǎng)，并隨心率升高而縮短，所以QT經(jīng)常針對(duì)心率進(jìn)行校正，產(chǎn)生QTc間隔。在罕見的情況下，一些藥物分子的給藥導(dǎo)致人ECG QT間隔的延長(zhǎng)。這些患者的ECGs與患有公知為長(zhǎng)QT綜合癥的遺傳病癥的個(gè)體的心電圖類似。在這些情況下，藥物誘導(dǎo)的心室纖維性顫動(dòng)可最終導(dǎo)致突然死亡(Morganroth Jet al.(1993)Am J Cardiol.72，26B-31B；De Ponti F.et al.，(2000)Eur J.Clin.Pharmacol.56，1-18)。許多藥物分子，包括E-403 1、西沙必利和特非那定，已知都可以延長(zhǎng)人心電圖的QT間隔(Fuliki A，et al.(1994)，Cardiovascular Pharmacol.23374-378；Van Haarst AD et al.，(1998)Clin Pharmacol.Ther.64542-546；Honig P.K.et al.(1993)J.A.M.A.269；1513-1518)。
帶有未被發(fā)現(xiàn)的潛在心臟毒副作用的新藥的上市可能具有危險(xiǎn)的后果，并可能引發(fā)患者致命的心臟節(jié)律失調(diào)。由具有藥理學(xué)重要性的化合物誘導(dǎo)的QT延長(zhǎng)的晚期檢測(cè)能夠阻止藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)項(xiàng)目，并因而對(duì)項(xiàng)目的結(jié)果產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。所以，人們期望能夠在藥物開發(fā)的早期階段測(cè)試化合物潛在的心臟毒副作用。
根據(jù)本發(fā)明，提供了包含或由以下步驟組成的一種測(cè)定方法a)在存在或不存在不同量的測(cè)試化合物或者測(cè)試化合物混合物的情況下，在測(cè)定緩沖液中溫育表達(dá)ERG的細(xì)胞、或者來自于ERG表達(dá)細(xì)胞的膜、或者來自于ERG表達(dá)組織的膜和標(biāo)記的IKR封阻劑；b)測(cè)定特異性結(jié)合的標(biāo)記的IKR封阻劑；c)計(jì)算測(cè)試化合物或者測(cè)試化合物混合物對(duì)標(biāo)記的IKR封阻劑結(jié)合的抑制。
這種測(cè)定可用作為鑒定具有延長(zhǎng)人QT間隔傾向的化合物的臨床使用前的預(yù)測(cè)性指標(biāo)。這種測(cè)定法是一種測(cè)量測(cè)試化合物或者化合物混合物自ERG K+通道(ether-a-go-go K+通道，本文稱之為ERG)置換標(biāo)記的IKR封阻劑能力的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定。這種測(cè)定法可以在高通量的測(cè)試系統(tǒng)中進(jìn)行。連同結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)，使用標(biāo)記的IKR封阻劑的配體結(jié)合測(cè)定法可被用來幫助設(shè)計(jì)對(duì)ERG，特別是人ERG(hERG)沒有或者具有降低的親和力的新藥。
所用的測(cè)定緩沖液對(duì)于優(yōu)化IKR封阻劑或測(cè)試化合物對(duì)ERG的結(jié)合尤為重要。已發(fā)現(xiàn)在使用以Tris為基礎(chǔ)的含有鉀離子(K+)的緩沖液時(shí)(室溫下pH7.2到7.6，優(yōu)選pH7.4)可達(dá)到最佳的測(cè)定性能。測(cè)定緩沖液中的鉀離子可以，例如作為氯化鉀(KCl)提供。測(cè)定緩沖液中的鉀離子濃度決定了該測(cè)定的預(yù)測(cè)值。在含有7.5到12.5mM KCl、優(yōu)選8.5到11.5mM KCl、最優(yōu)選10mM KCl的測(cè)定緩沖液中進(jìn)行的測(cè)定尤其可用來提供預(yù)測(cè)QT延長(zhǎng)發(fā)作的IC20值。
本發(fā)明的測(cè)定緩沖液優(yōu)選包含或由Tris·Cl和KCl組成。可選地，測(cè)定緩沖液中可以包括MgCl2。
測(cè)定緩沖液中的Tris·Cl濃度優(yōu)選為30mM到l00mM Tris·Cl，更優(yōu)選30mM到70mM Tris·Cl，但是更優(yōu)選40mM到60mM Tris·Cl，進(jìn)一步優(yōu)選45mM到55mM Tris·Cl，最優(yōu)選50mM Tris·Cl。
測(cè)定緩沖液中的KCl濃度優(yōu)選為5到20mM KCl，更優(yōu)選6到15mMKCl，但是更優(yōu)選7.5到12.5mM KCl，進(jìn)一步優(yōu)選8.5到11.5mM KCl，最優(yōu)選10mM KCl。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)定緩沖液包含或由30mM到100mMTris·Cl和5到20mM KCl組成，優(yōu)選30mM到70mM Tris·Cl或30mM到100mM Tris·Cl和6到15mM KCl，但是更優(yōu)選40mM到60mM Tris·Cl和7.5到12.5mM KCl，進(jìn)一步優(yōu)選45mM到55mM Tris·Cl和8.5到11.5mM KCl。
特別優(yōu)選測(cè)定緩沖液包含或由50mM Tris·Cl和10mM KCl組成。
如果測(cè)定緩沖液中包括MgCl2，MgCl2的濃度優(yōu)選為0.6mM到2.0mMMgCl2，更優(yōu)選0.6mM到1.6mM MgCl2，但是更優(yōu)選0.8mM到1.4mM MgCl2，進(jìn)一步優(yōu)選0.9mM到1.3mM MgCl2，但是更進(jìn)一步優(yōu)選1.0mM到1.2mMMgCl2，最優(yōu)選1.0mM到1.2mM MgCl2。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)定緩沖液包含或由30mM到100mMTris·Cl、5到20mM KCl和0.6mM到2.0mM MgCl2組成；優(yōu)選30mM到100mM Tris·Cl或30mM到70mM Tris·Cl、6到15mM KCl和0.6mM到1.6mM MgCl2；但是更優(yōu)選40mM到60mM Tris·Cl、7.5到12.5mM KCl和0.8mM到1.4mM MgCl2；進(jìn)一步優(yōu)選45mM到55mM Tris·Cl、8.5到11.5mM KCl以及0.9mM到1.3mM MgCl2或1.0mM到1.2mM MgCl2。
測(cè)定緩沖液可以包含或由50mM Tris·Cl、10mM KCl和1.0mM MgCl2；或者50mM Tris·Cl、10mM KCl和1.2mM MgCl2組成。
優(yōu)選測(cè)定緩沖液室溫下的pH在7.2和7.6之間；特別優(yōu)選測(cè)定緩沖液室溫下的pH為7.4。
ERG基因(cDNA)可以是脊椎動(dòng)物或無脊椎動(dòng)物來源的；對(duì)于脊椎動(dòng)物，ERG基因可以是哺乳動(dòng)物來源的(如人、類人猿、牛、豬、犬、兔、豚鼠、大鼠或小鼠)，或者無脊椎動(dòng)物來源例如昆蟲來源(如果蠅)?？梢岳貌溉閯?dòng)物ERG的原核同源生物。優(yōu)選ERG基因?yàn)椴溉閯?dòng)物ERG，特別是人ERG(hERG)或犬ERG(cERG)。
ERG基因可以表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中，如HEK-293(人胚胎腎)細(xì)胞，CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞；CHL(中國(guó)倉(cāng)鼠肺)細(xì)胞，COS(猴)細(xì)胞；或者表達(dá)于昆蟲細(xì)胞系如SF9中。桿狀病毒載體系統(tǒng)可用于在適配的昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)ERG。替代地，ERG可以表達(dá)于酵母或細(xì)菌細(xì)胞中。優(yōu)選ERG基因是hERG或cERG，并在HEK-293、CHO或CHL細(xì)胞中表達(dá)。
測(cè)定可利用表達(dá)ERG的全細(xì)胞，或者來自ERG表達(dá)細(xì)胞的膜制備物，或者來自ERG表達(dá)組織的膜制備物進(jìn)行。
多非利特是IKR封阻劑(延遲校正鉀離子電流中快速組份的選擇性抑制劑)，它以濃度依賴性的方式延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)間和有效不應(yīng)期。臨床研究已證明多非利特可以有效地治療具有房性心率失常以及室性心率失常的患者。多非利特具有如下的結(jié)構(gòu)式I。
結(jié)構(gòu)式I
多非利特被要求保護(hù)，并且它的制備描述在歐洲專利EP 0245997中。
MK-499(Merck)是起IKR封阻劑作用的甲基磺胺類抗心率失常藥物。MK-499具有下面所示的結(jié)構(gòu)式II。
結(jié)構(gòu)式II 測(cè)定中所用的IKR封阻劑用可檢測(cè)的標(biāo)記，例如放射性標(biāo)記或者熒光標(biāo)簽標(biāo)記。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)定中所用的標(biāo)記的IKR封阻劑是標(biāo)記的多非利特，優(yōu)選放射性標(biāo)記的多非利特，更優(yōu)選氚化的多非利特([3H]-多非利特)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定中所用的標(biāo)記的IKR封阻劑是標(biāo)記的MK-499，優(yōu)選放射性標(biāo)記的MK-499，更優(yōu)選氚化的MK-499([3H]-MK-499)。
優(yōu)選的測(cè)定形式包括過濾結(jié)合技術(shù)，其中結(jié)合和未結(jié)合的標(biāo)記的IKR封阻劑如標(biāo)記的多非利特或標(biāo)記的MK-499；優(yōu)選放射性標(biāo)記的多非利特或放射性標(biāo)記的MK-499；最優(yōu)選[3H]-多非利特或[3H]-MK-499是通過過濾分離的。測(cè)定可以使用閃爍親近測(cè)定法(SPA)技術(shù)，利用放射性標(biāo)記的IKR封阻劑例如放射性標(biāo)記的多非利特或放射性標(biāo)記的MK-499，優(yōu)選[3H]-多非利特或[3H]-MK-499進(jìn)行。
在過濾結(jié)合技術(shù)中，ERG表達(dá)細(xì)胞或來自ERG表達(dá)細(xì)胞的膜或者來自ERG表達(dá)組織的膜在緩沖液中與標(biāo)記的IKR封阻劑例如[3H]-多非利特或[3H]-MK-499，在存在(測(cè)試)或者不存在(對(duì)照)測(cè)試化合物或者測(cè)試化合物混合物的條件下溫育。溫育優(yōu)選在室溫下進(jìn)行60到120分鐘，優(yōu)選90分鐘。非特異性結(jié)合在存在未標(biāo)記的IKR封阻劑，例如，10μM多非利特或10μMMK-499的條件下測(cè)定。結(jié)合的標(biāo)記IKR封阻劑通過過濾墊或者在多孔過濾板上經(jīng)過濾與未結(jié)合的IKR封阻劑分離。洗滌過濾墊或板以除去未結(jié)合的標(biāo)記IKR封阻劑，而結(jié)合的標(biāo)記IKR封阻劑，如對(duì)于氚化的IKR封阻劑例如[3H]-多非利特或[3H]-MK-499，利用適當(dāng)?shù)姆派湫杂?jì)數(shù)器通過閃爍光譜定量。
在閃爍親近測(cè)定法TM(SPA)系統(tǒng)(Amersham Biosciences)中，利用珠子結(jié)合ERG表達(dá)細(xì)胞或來自ERG表達(dá)細(xì)胞的膜或來自ERG表達(dá)組織的膜。許多類型的珠子適合用于根據(jù)本發(fā)明的SPA測(cè)定，這些珠子包括PVT麥胚凝集素、三氧化二釔聚賴氨酸珠子、或者硅酸釔珠子(YSi)(Amersham Biosciences)例如YSi聚賴氨酸或者YSi麥胚凝集素。用于本發(fā)明的SPA測(cè)定的最佳珠子類型取決于所用的細(xì)胞或細(xì)胞膜；可以評(píng)價(jià)珠子對(duì)細(xì)胞或珠子對(duì)膜的結(jié)合以鑒定所用的細(xì)胞或細(xì)胞膜的最佳珠子類型。結(jié)合于ERG材料(全細(xì)胞、細(xì)胞膜制備物或組織膜制備物)的珠子在測(cè)定緩沖液中與標(biāo)記的IKR封阻劑，例如[3H]-多非利特或[3H]-MK-499，在存在(測(cè)試)或者不存在(對(duì)照)測(cè)試化合物或者測(cè)試化合物混合物的條件下溫育。測(cè)試化合物或測(cè)試化合物混合物取代結(jié)合的放射性標(biāo)記的IKR封阻劑的能力通過檢測(cè)光發(fā)射，例如利用能夠和SPA技術(shù)一起應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)器來確定。
測(cè)定還可以包括如下的一個(gè)或多個(gè)步驟計(jì)算給出多非利特結(jié)合20％抑制(IC20)的測(cè)試化合物的濃度，計(jì)算給出多非利特結(jié)合50％抑制(IC50)的測(cè)試化合物的濃度，計(jì)算記作Ki的化合物親和力或者計(jì)算記作pKi的化合物親和力。
利用本發(fā)明的測(cè)定，自IKR封阻劑結(jié)合，例如[3H]-多非利特結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性取代所產(chǎn)生的IC20值，和與人QT延長(zhǎng)相關(guān)的游離藥物濃度不相上下。因此這種測(cè)定可用于預(yù)測(cè)可能導(dǎo)致不良心臟副作用的化合物的濃度。
為評(píng)價(jià)一種化合物或化合物的混合物是否可能延長(zhǎng)人心電圖QT間隔，進(jìn)行了以下步驟a)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行測(cè)定。
b)獲得IC20值；這預(yù)示了真實(shí)或預(yù)測(cè)的會(huì)發(fā)生人QT延長(zhǎng)的游離藥物濃度；c)將IC20值與化合物或化合物混合物在體內(nèi)預(yù)期的治療效果所需的游離藥物濃度相比較。
如果化合物或化合物混合物預(yù)期的治療效果所需的游離藥物濃度在該測(cè)定中化合物或化合物混合物IC20值的10到30倍的范圍之內(nèi)，則該化合物或化合物混合物很可能表現(xiàn)出人QT間隔的延長(zhǎng)。
與現(xiàn)存的測(cè)定例如HERG膜片鉗測(cè)定相比，本發(fā)明的測(cè)定是藥物分子體內(nèi)QT延長(zhǎng)效應(yīng)的一個(gè)較好的預(yù)測(cè)方法。
附圖清單

圖1表示[3H]-多非利特在(a)過濾結(jié)合中，(b)SPA 96孔形式中以及(c)SPA 384孔形式中結(jié)合HERG的飽和曲線數(shù)據(jù)。
圖2比較從過濾結(jié)合和SPA結(jié)合測(cè)定中獲得的pKi值的關(guān)系圖(a)96孔hERG[3H]-多非利特SPA測(cè)定與放射配體結(jié)合測(cè)定之間的相關(guān)性，(b)96孔和384孔hERG[3H]-多非利特SPA測(cè)定間的相關(guān)性。
圖3(a)E-4031，(b)多非利特，(c)特非那定和(d)西沙必利對(duì)[3H]-多非利特結(jié)合hERG的抑制、hERG膜片鉗、以及誘導(dǎo)人QT間隔延長(zhǎng)的已知游離藥物濃度之間的比較。
圖4在由人ERG(hERG(▲))或犬ERG(cERG(■))轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞的細(xì)胞膜中進(jìn)行的多非利特結(jié)合測(cè)定中多非利特IC50的比較。
圖5cERG或hERG轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞膜中多非利特結(jié)合測(cè)定中特非那定IC50的比較。
圖6cERG或hERG轉(zhuǎn)染的細(xì)胞HEK-293膜中多非利特結(jié)合測(cè)定中E4031 IC50的比較。
圖7(a)多非利特和(b)雙苯丁胺在氚化多非利特SPA測(cè)定中使用50mM Tris·Cl、10mM KCl、pH7.4的測(cè)定緩沖液時(shí)的平均(n＝2)濃度效應(yīng)曲線。
實(shí)施例實(shí)施例1從表達(dá)人或犬ERG的HEK-293細(xì)胞制備膜一個(gè)表達(dá)人ERG的粘附HEK-293細(xì)胞系(Zhou，Zet al(1998)Biophys.J.74，230-241)由美國(guó)威斯康新大學(xué)的Craig January博士提供；這個(gè)細(xì)胞系被命名為“January”細(xì)胞系。一個(gè)替代的粘附HEK-293細(xì)胞系，命名為細(xì)胞系15(293S-HERG克隆15)是按照Z(yǔ)hou，Z等(1998)描述的方法制備的。全長(zhǎng)的人ERG cDNA被插入pcDNA3.1(Invitrogen)的CMV啟動(dòng)子下游，該載體還具有驅(qū)動(dòng)新霉素抗性基因表達(dá)的SV40啟動(dòng)子。這種構(gòu)建物被轉(zhuǎn)染進(jìn)人胚胎腎293S(HEK-293)細(xì)胞中。利用G418(Gibco)選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。雖然細(xì)胞系15比January細(xì)胞系具有稍微較低的hERG表達(dá)，但是它具有改善的生長(zhǎng)特征。
細(xì)胞系15(293S-HERG(克隆15))于2002年6月26日按照布達(dá)佩斯條約1977的條款保藏于ECACC(CAMR Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，UK)，保藏號(hào)為02062678。
表達(dá)人ERG的粘附HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充有10％胎牛血清(PAALaboratories)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)、1mM丙酮酸鈉(Sigma)、0.4mg/ml G418(Life Technologies)并添加1×非必需氨基酸(LifeTechnologies)的MEM Earles培養(yǎng)基(Life Technologies)中。細(xì)胞在T225cm3燒瓶里在具有5％CO2的潮濕氣氛中于37℃生長(zhǎng)。在達(dá)到80％融合后用細(xì)胞離散液(Sigma，目錄號(hào)C5914，2001)將細(xì)胞按1∶3到1∶5分裂，隨后在不存在G418的條件下接種到850cm2的CO2通氣滾瓶(Corning，目錄號(hào)430849，2001)中。
為制備膜，通過刮除從滾瓶中收集細(xì)胞并重懸于PBS(LifeTechnologies目錄號(hào)14190-094，2001)中。使所有的細(xì)胞沉淀、用PBS洗滌兩次，并在干冰上快速冷凍，之后于-80℃貯存?zhèn)溆谩?br> 表達(dá)犬ERG的HEK-293細(xì)胞系通過HEK-293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染制備。cERG cDNA的完整編碼序列(Zenelein et al(2001)Pflugers Archiv.European Journal of Physiology.442(2)188-191)由德國(guó)海丁堡大學(xué)的Zehelein教授提供在pBluescript載體(Stratagene)中。在pBluescript構(gòu)建物中，cERG cDNA側(cè)接BamH I位點(diǎn)。最初的實(shí)驗(yàn)顯示了將cERG BamH I片段直接插入所需載體pcDNA3.1的較低的插入效率。為克服這點(diǎn)，利用克隆載體pSP73(Promega)設(shè)計(jì)了間接克隆法。cERG/pBluescript構(gòu)建物和pSP73載體經(jīng)BamH I消化，以減少連接反應(yīng)中因pBluescript BamH I片段的存在而造成的干擾，cERG/pBluescript BamH I消化物還經(jīng)Sca I消化以切割pBluescript并確保cERG BamH I在瓊脂糖凝膠上更有效的分離。限制性酶切混合物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，含cERG和pSP73 BamH I片段的條帶在用溴化乙錠染色和UV光照之后顯現(xiàn)。cERG和pSP73條帶被切下，并根據(jù)制造商的說明利用QIAgen MinElute凝膠抽提試劑盒從凝膠中洗脫出來。為防止連接反應(yīng)期間pSP73 DNA BamH I端點(diǎn)的重連，質(zhì)粒DNA片段利用標(biāo)準(zhǔn)方案經(jīng)CIP處理。cERG BamH I片段利用標(biāo)準(zhǔn)連接方案連接到pSP73 BamH I片段上。反應(yīng)后，連接混合物利用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方案轉(zhuǎn)化到cJM109感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化子通過涂板含氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂(Millers)挑選并于37℃過夜孵育。利用轉(zhuǎn)化細(xì)胞的過夜培養(yǎng)物根據(jù)制造商的說明使用QIAgen Miniprep試劑盒制備cERG/pSP73 DNA小量產(chǎn)物。所得的DNA經(jīng)限制性酶切消化和瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆。
cERG cDNA作為Xho I(5’)EcoR I(3’)片段從cERG/pSP73中切割下來，該片段被連接到反向多聚接頭形式的pcDNA3.1的Xho I/EcoRI片段中，pcDNA3.1(-)xho I/EcoR I。在這個(gè)例子中使用反向多聚接頭形式是因?yàn)樗x的cERG/pSP73克隆含有反向cERG。連接到pcDNA3.1(-)中以后，cERG 5’端的定位毗鄰來自人巨細(xì)胞病毒(CMV)的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列。連接混合物利用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方案轉(zhuǎn)化到cJM109感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化子通過與所需的對(duì)照-起涂板含氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂(Millers)并于37℃過夜孵育挑選。從cERG/pcDNA3.1(-)平板中隨機(jī)挑取的集落被接種到含氨芐青霉素(50μg/ml)的5ml LB培養(yǎng)基中并于37℃、200rpm過夜孵育。隨后利用這些過夜培養(yǎng)物使用QIAgen Miniprep試劑盒制備DNA小量產(chǎn)物。所得的DNA經(jīng)Xho I和EcoR I雙重消化，并在1％瓊脂糖凝膠上測(cè)定。由于連接反應(yīng)中插入效率低，加上只有來自少數(shù)克隆的DNA利用小量制備法予以測(cè)定的事實(shí)，沒有鑒定到陽(yáng)性cERG/pcDNA3.1(-)克隆。因此利用集落PCR法從較大數(shù)目的集落中篩選陽(yáng)性克隆。
集落PCR方案允許迅速檢測(cè)cERG/pcDNA3.1(-)克隆。設(shè)計(jì)并制備了3個(gè)引物用于該P(yáng)CR方案
引物1‘CERG01’(SEQ ID NO1)，它與cERG在編碼序列601-620的核苷酸位置雜交5’-ACCACATCCACCAGGCACAG-3’引物2‘NHE PCDNA3’(SEQ ID NO2)，它與pcDNA3.1(-)在886-910的核苷酸位置(在側(cè)接Nhe I克隆位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)內(nèi))雜交5’-CCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACGG-3’引物3‘T7 SP73’(SEQ ID NO3)，它被用作為對(duì)照，并用作為已知產(chǎn)生cERG/pSP73的集落的對(duì)照。它與pSP73在98-121的核苷酸位置，在T7聚合酶啟動(dòng)子序列內(nèi)雜交5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’從LB瓊脂轉(zhuǎn)化板上挑取95個(gè)cJM109集落，并轉(zhuǎn)移到無菌深孔96孔板中，含1ml/孔補(bǔ)充有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB肉湯。作為對(duì)照，已知含有cERG/pSP73質(zhì)粒的集落被轉(zhuǎn)移到含有LB-amp肉湯的最后的第96孔中。該板被蓋上并于37℃在200rpm過夜孵育。一份70μl的每種小量培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到96孔PCR板中(0.5ml/孔)，并置于Beckman Allegra 6R離心機(jī)中2800rpm室溫下離心10分鐘。棄上清，并且板被抽干3分鐘。如下建立PCR反應(yīng)混合物并添加到含有細(xì)菌沉淀的PCR板中測(cè)試孔 對(duì)照孔cERG/pSP73Taqman Gold緩沖液(×10)10.0μl10μl
dNTPs(×10，2mM/dNTP)2.0μl 2μlTaqman Gold聚合酶(5單位/μl) 0.5μl 0.5μlCERG01(引物1-25μM) 2μl 2μlNHE PCDNA3(引物2-25μM) 2μl -T7 SP73(引物3-25μM) -2μl無核酸酶的水 83.5μl 83.5μl細(xì)菌沉淀重懸于PCR反應(yīng)混合物中。PCR反應(yīng)如Taqman Gold PCR試劑盒的制造商方案中所說明的(Applied Biosystems，1990版)這樣進(jìn)行溫度 時(shí)間步驟1-熱啟 95℃ 6分步驟2-變性 95℃ 1分步驟3-退火 60℃ 1分步驟4-延伸 72℃ 1分 轉(zhuǎn)步驟2，35個(gè)循環(huán)后轉(zhuǎn)步驟5步驟5-變性 95 ℃ 45秒步驟6-退火 60℃ 45秒步驟7-延伸 72 ℃ 5分然后每孔的PCR產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠上利用100bp的DNA階梯標(biāo)記物(ladder marker)通過于1×TAE緩沖液中在100V電泳25分鐘分離，并利用UV光顯現(xiàn)。鑒定推定的陽(yáng)性克隆，來自這些PCR反應(yīng)混合物的樣品在第二個(gè)分離1.5％瓊脂糖凝膠上于100V跑1小時(shí)以檢查PCR產(chǎn)物的大小。
給出擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的小量培養(yǎng)物分別從原始的深孔96孔板上接種到裝有含50μg/ml氨芐青霉素的5ml LB肉湯的無菌試管中，并于37℃在200rpm過夜孵育。然后利用過夜培養(yǎng)物使用QIAgen Miniprep試劑盒制備DNA小量產(chǎn)物。所得的DNA經(jīng)xho I和EcoR I雙重消化，以檢查cERG/pcDNA 3.1(-)的存在。限制性酶消化產(chǎn)物通過和1kb的DNA階梯標(biāo)記物(20μl樣品加載2μl凝膠上樣液)在1％瓊脂糖凝膠上于100V跑1小時(shí)進(jìn)行測(cè)定。進(jìn)行進(jìn)一步限制性酶消化測(cè)定，以確認(rèn)來自轉(zhuǎn)化子的純化質(zhì)粒確實(shí)是cERG/pcDNA3.1(-)。
未轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞通常保持在補(bǔ)充有10％(v/v)胎牛血清(FCS)、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉和1mM非必需氨基酸的50ml基本必需培養(yǎng)基(MEM)中。細(xì)胞接種到225cm2通氣的有塞燒瓶里，并保持在含5％CO2的潮濕氣氛中。本研究所用的HEK-293細(xì)胞傳代數(shù)目在39-48之間。細(xì)胞典型地每三天以1∶3的比例自80-90％融合的燒瓶中傳代；當(dāng)用10ml PBS洗滌兩次并且利用細(xì)胞離散液與燒瓶分離開之后加入新鮮培養(yǎng)基。
cERG/pcDNA3.1(-)構(gòu)建物利用以下方法轉(zhuǎn)染到在225cm2通氣燒瓶里生長(zhǎng)至80-95％融合的HEK-293細(xì)胞中。無細(xì)菌內(nèi)毒素的cERG/pcDNA3.1(-)DNA(94μg)和Lipofectamine2000(Gibco BRL)(94μg)被添加到無菌10ml離心管中的2.25ml OPTIMEM-I培養(yǎng)基中(Gibco BRL)中；室溫溫育5分鐘之后進(jìn)行混合。Lipofectamine2000/DNA/OPTIMEM-I混合物接著在室溫下溫育20分鐘，之后另外加入10.5ml OPTIMEM-I。HEK-293細(xì)胞用10ml PBS洗滌，然后加入Lipofectamine2000/DNA/OPTIMEM-I混合物，并在含5％CO2的潮濕氣氛中于37℃孵育3.5小時(shí)。孵育后，加入50ml MEM(補(bǔ)充有10％(v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉和1mM非必需氨基酸)。HEK-293細(xì)胞于37℃孵育24小時(shí)。24小時(shí)后通過用PBS洗滌、將細(xì)胞刮到10ml PBS中、并在1000rpm于室溫離心5分鐘收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。所得的cERG/pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞沉淀在-80℃貯存?zhèn)溆谩?br> 從表達(dá)人或犬ERG的HEK-293細(xì)胞制備膜細(xì)胞膜碎片從冷凍的小份細(xì)胞中制備。所有操作除非另外陳述都在4℃進(jìn)行。冷凍的小份細(xì)胞在室溫下融化，并重懸于測(cè)定緩沖液(例如50mM Tris·Cl，10mM KCl，1到1.2mM MgCl2，pH7.4，或者50mM Tris·Cl，10mM KCl，pH7.4)中。然后在0mni LabTek勻漿機(jī)中通過在20,000rpm勻漿30秒裂解細(xì)胞。勻漿在48,000×g離心20分鐘(4℃，SorvallRC5B離心機(jī))，并除去上清。所得的沉淀重懸于測(cè)定緩沖液中，并如上所述勻漿10秒。通過離心收集沉淀，并且將最終的沉淀重懸于測(cè)定緩沖液中。蛋白含量利用考馬斯亮藍(lán)為基礎(chǔ)的蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定。小份在-80℃貯存?zhèn)溆茫划?dāng)在這些條件下貯存時(shí)，細(xì)胞膜碎片的結(jié)合能力被證明至少在4個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。
實(shí)施例2[3H]-多非利特過濾結(jié)合測(cè)定[3H]-多非利特(80-83 Ci/mmol)通過催化氚化合成(例如，由Amersham Life Science提供的客戶服務(wù))。不過，熟練技術(shù)人員公知的其它可檢測(cè)標(biāo)記可以被用來替代3H，例如熒光標(biāo)簽、其它放射性標(biāo)記、抗體等。
在測(cè)定當(dāng)天，測(cè)試化合物以1mM溶于50％DMSO或100％DMSO中，然后在測(cè)定緩沖液中稀釋到所需濃度(例如直到100μM，或者直到該化合物的溶解度界限)。對(duì)于最佳的測(cè)定條件而言，測(cè)定溫育液中DMSO的終濃度優(yōu)選1.0到1.5％或者更低。
除非另外指出，溫育在測(cè)定緩沖液(50mM Tris·Cl，10mM KCl，1.0mM到1.2mM MgCl2，pH7.4)中包括50μg/ml的膜勻漿、[3H]-多非利特(4到7nM)以及測(cè)試化合物或測(cè)試化合物混合物或者對(duì)照介質(zhì)。過濾測(cè)定在室溫下溫育90分鐘。非特異性結(jié)合在存在10μM多非利特的條件下測(cè)定，并且通常低于總結(jié)合的15％。結(jié)合配體通過，利用例如Brandel細(xì)胞收集器迅速過濾通過GF/B玻璃纖維過濾墊，或者利用Packard Filermate 96收集器過濾到GF/B單過濾96孔過濾板(Packard)上與游離配體分離。過濾墊和板預(yù)先浸泡在5％PEI(w/v)中60分鐘，并在收集后用3次×1ml冰凍測(cè)定緩沖液洗滌。單過濾板在加入Microscint-O(Packard)之前于37℃空氣中干燥最低限度1.5小時(shí)。結(jié)合的[3H]-多非利特利用適當(dāng)?shù)挠?jì)數(shù)器通過液體閃爍光譜，例如對(duì)于單過濾板來說，在Packard TopCount閃爍計(jì)數(shù)器(NXT計(jì)數(shù)器)或Wallac計(jì)數(shù)器(Trilux)中，而當(dāng)利用過濾墊時(shí)，在Wallac大斑點(diǎn)計(jì)數(shù)器中測(cè)定。
在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，按常規(guī)進(jìn)行三份測(cè)定，并將數(shù)據(jù)平均化。特異性結(jié)合利用GraphPad Prism軟件(Graphpad，San Diego)通過非線性回歸擬合進(jìn)行測(cè)定。IC50值利用PRISM來自于一個(gè)4參數(shù)的對(duì)數(shù)擬合，并利用Cheng & Prusoff方程式換算為Ki值；IC20值是從圖中推斷出來的。
實(shí)施例3閃爍親近測(cè)定法閃爍親近測(cè)定法(SPA)在由50mM Tris·Cl，10mM KCl，1.0mM到1.2mM MgCl2，pH7.4組成的測(cè)定緩沖液中，或者使用由50mM Tris堿，10mM KCl，pH7.4組成的測(cè)定緩沖液進(jìn)行。評(píng)價(jià)珠子對(duì)膜的結(jié)合，以確定所用的細(xì)胞系的最佳珠子類型。YSi麥胚凝集素珠子被用于來自January HEK-293 hERG表達(dá)細(xì)胞系的細(xì)胞膜；YSi聚賴氨酸珠子被用于使用來自細(xì)胞系15(HEK-293 hERG表達(dá)細(xì)胞系)的膜的研究中。在描述ERG藥理學(xué)特征之前，有關(guān)珠子和細(xì)胞膜勻漿的濃度條件被優(yōu)化。溫育液(對(duì)于96孔板每孔總共200μl，而對(duì)于384孔板每孔總共60μl)包括25μg細(xì)胞膜勻漿每mg珠子。膜勻漿用YSi麥胚凝集素或者YSi聚賴氨酸珠子懸液于4℃在滾輪振蕩器上預(yù)偶聯(lián)大約2小時(shí)。為進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定，膜勻漿珠子懸液在白色透明底的96或384孔板中與5nM[3H]-多非利特在不存在或存在競(jìng)爭(zhēng)物即測(cè)試化合物或測(cè)試化合物混合物的情況下溫育。板在室溫下溫育，并振蕩大約1小時(shí)。允許珠子靜置最少30分鐘，之后在TopCount NXT閃爍計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)板上保留的放射性。非特異性結(jié)合即背景計(jì)數(shù)，通過添加10μM多非利特測(cè)定。背景計(jì)數(shù)通常小于總結(jié)合的15％。對(duì)于飽和度研究，[3H]-多非利特的特異性結(jié)合在一個(gè)濃度范圍內(nèi)(5到500nM)在不存在或存在冷(即未標(biāo)記的)10μM多非利特的條件下測(cè)定。
實(shí)施例4測(cè)定的優(yōu)化a)基于Hepes和基于Tris的緩沖液對(duì)多非利特結(jié)合的影響為優(yōu)化多非利特對(duì)含ERG細(xì)胞膜勻漿的特異性結(jié)合，[3H]-多非利特與細(xì)胞膜制備物的相互作用在存在基于Hepes的緩沖液(25mM Hepes，135mM NaCl，5mM KCl，1mM MgSO4，50mM CaCl2，pH7.4)和基于Tris的緩沖液(50mM Tris·Cl，10mM KCl，1mM或1.2mM MgCl2)的條件下進(jìn)行檢測(cè)。這些緩沖液中特異性結(jié)合的比較揭示，在基于Tris和基于Hepes的緩沖液中的百分比特異性結(jié)合是類似的。不過，如表1所示，在基于Tris的緩沖液中特異性計(jì)數(shù)比在基于Hepes的緩沖液中所檢測(cè)到的高兩倍。
表1.基于Tris和基于Hepes的緩沖液對(duì)[3H]-多非利特結(jié)合表達(dá)hERG的細(xì)胞膜勻漿的比較效果緩沖液 25mM HEPES 自由酸，135mM 50mM Tris，10mM KClNaCl，5mM KCl，1mM MgSO4，50μM及1.0或1.2mM MgCl2CaCl2pH7.4室溫pH7.4室溫總結(jié)合(ccpm) 8510±669 19627±1189非特異性結(jié)合(ccpm) 321±27 315±23
特異性結(jié)合(ccpm) 8189 19312％特異性結(jié)合 9698總結(jié)合和非特異性結(jié)合數(shù)據(jù)代表在75μg/ml的蛋白濃度和平均6.7nM的[3H]-多非利特濃度時(shí)進(jìn)行的兩次測(cè)定中每份緩沖液分離液的14個(gè)單獨(dú)孔的算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差平均數(shù)。溫育在室溫下進(jìn)行60分鐘。ccpm＝每分鐘的校正計(jì)數(shù)。
因此最大特異性結(jié)合窗口是能夠?qū)崿F(xiàn)的；實(shí)施例1到8中所用的測(cè)定緩沖液是Tris為基礎(chǔ)的溫育緩沖液(50mM Tris·Cl，10mM KCl，1mM MgCl2)。此外，還進(jìn)行了優(yōu)化用于過濾和SPA結(jié)合測(cè)定的細(xì)胞膜蛋白濃度和珠子濃度的實(shí)驗(yàn)。
b)飽和度結(jié)合作出時(shí)間曲線以確定結(jié)合活性的最佳溫育時(shí)間。溫育時(shí)間對(duì)于過濾結(jié)合和SPA測(cè)定是相似的。過濾結(jié)合測(cè)定在90分鐘內(nèi)達(dá)到平衡，SPA需要60分鐘。過濾結(jié)合及閃爍親近測(cè)定法中[3H]-多非利特與ERG的結(jié)合都是可飽和的，對(duì)于過濾結(jié)合KD為5.08±1.0nM，而對(duì)于96和384孔形式的閃爍親近測(cè)定法KD值分別為8.9±0.6 nM和9.1±1.8nM(圖1a-c，其中圖1a顯示過濾結(jié)合測(cè)定的結(jié)果，圖1b是SPA96孔形式的結(jié)果，而圖1c顯示SPA384孔形式的結(jié)果)。這個(gè)數(shù)據(jù)的非線性曲線擬合表明結(jié)合是單一位點(diǎn)的。從過濾結(jié)合中獲得的Bmax為7.4±0.7pmol[3H]-多非利特/mg蛋白(圖1)。由于閃爍親近測(cè)定法沒有給出dpm(每分鐘衰變數(shù))值的精確測(cè)定，對(duì)SPA未引用Bmax。
c)SPA和過濾結(jié)合技術(shù)的比較SPA和過濾結(jié)合技術(shù)的比較顯示了結(jié)果的精彩相關(guān)性。兩種類型測(cè)定的親和力值之間表現(xiàn)出精彩的相關(guān)性，并且化合物親和力的數(shù)量級(jí)是相同的，如圖2所示(比較從過濾結(jié)合及SPA結(jié)合測(cè)定中獲得的pKi值的相互關(guān)系圖)。
d)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合研究檢測(cè)了一系列化合物，包括已知延長(zhǎng)人QT間隔的hERG封阻劑，對(duì)[3H]-多非利特的競(jìng)爭(zhēng)性取代。E4031、多非利特、特非那定、以及西沙必利產(chǎn)生了特異性結(jié)合的完全抑制，具有一系列總結(jié)于表2的計(jì)算的親和力值。
表2.針對(duì)[3H]-多非利特HERG過濾和SPA結(jié)合測(cè)定的測(cè)試化合物的親和力值化合物 過濾結(jié)合 SPA96 SPA384pKipKipKi多非利特 8.22±0.048.05±0.54 8.26±0.12E4031 7.82±0.037.81±0.05 7.89±0.11特非那定 7.53±0.097.75±0.07 7.72±0.41西沙必利 7.34±0.057.15±0.04 7.55±0.22格列本脲 ＜5 ＜5 ＜5D-甲磺胺心定 ＜5 ＜5 ＜5數(shù)據(jù)表達(dá)為pKi值(取代50％5nM[3H]-多非利特結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性配體的摩爾濃度的負(fù)對(duì)數(shù))。數(shù)據(jù)是至少n＝3次實(shí)驗(yàn)的平均值。
實(shí)施例5化合物對(duì)人QT間隔延長(zhǎng)效應(yīng)的預(yù)測(cè)如圖3所示，對(duì)于一系列化合物來說，利用本發(fā)明的測(cè)定方法從[3H]-多非利特結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性取代中得到的IC20值和與人QT延長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)的游離藥物濃度相當(dāng)，包括E-4031(圖3a)、多非利特(圖3b)、特非那定(圖3c)和西沙必利(圖3d)。對(duì)于每一種化合物，結(jié)合測(cè)定(過濾結(jié)合技術(shù))以及hERG膜片鉗測(cè)定中的多非利特結(jié)合抑制都和與人QT間隔延長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)的游離藥物濃度相比較(FulikiA，et al.(1994)Cardiovascular Pharmacol，23374-378；Van Haarst AD et al.(1998)Clin Pharmacol.Ther.64542-546；Honig PK，et al.(1993)J.A.M.A.2691513-1518)。
ERG膜片鉗測(cè)定提供了通過ERG通道的電流的測(cè)量值，并顯示了細(xì)胞中存在的離子通道的數(shù)目。不過，由于膜片鉗研究(Walker，B.D.etal(1999)British J.Pharmacol 128，444-450)中所觀察到的-通過許多已知具有在體內(nèi)延長(zhǎng)QT間隔傾向的hERG封阻劑所呈現(xiàn)的-狀態(tài)依賴性封阻現(xiàn)象，配體結(jié)合測(cè)定提供了比hERG膜片鉗技術(shù)更好的關(guān)于藥物在體內(nèi)的QT延長(zhǎng)效應(yīng)的指標(biāo)(圖3d)。
為評(píng)價(jià)一種化合物或化合物的混合物是否可能延長(zhǎng)人心電圖QT間隔，進(jìn)行了以下步驟a)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行結(jié)合測(cè)定，舉例來說，象實(shí)施例2或?qū)嵤├?所描述的那樣，測(cè)試化合物或化合物混合物對(duì)ERG，優(yōu)選hERG或cERG的親和力；b)獲得IC20值，例如象實(shí)施例2末尾所描述的那樣；該IC20是真實(shí)或預(yù)測(cè)的會(huì)發(fā)生人QT延長(zhǎng)的游離藥物濃度；c)將IC20值與化合物在體內(nèi)預(yù)期的治療效果所需的游離藥物濃度相比較。
如果化合物預(yù)期的治療效果所需的游離藥物濃度在本發(fā)明測(cè)定中化合物IC20值的10到30倍的范圍之內(nèi)，則該化合物非?？赡軐?dǎo)致人QT間隔的延長(zhǎng)。
實(shí)施例6利用轉(zhuǎn)染了cERG或hERG的HEK-293細(xì)胞中進(jìn)行的多非利特結(jié)合測(cè)定的比較如實(shí)施例2所述利用轉(zhuǎn)染了人ERF或者犬ERG的HEK 293細(xì)胞進(jìn)行多非利特結(jié)合測(cè)定。結(jié)果示于圖4，從中可以看出，犬和人ERG的多非利特IC50是相似的，分別為13.9nM和15.6nM。犬和人ERG的多非利特IC20值分別為1.92nM和2.15nM。
實(shí)施例7利用轉(zhuǎn)染了cERG或hERG的HEK-293細(xì)胞進(jìn)行的特非那定競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的比較利用特非那定作為測(cè)試化合物進(jìn)行多非利特結(jié)合測(cè)定。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的cERG HEK-293細(xì)胞膜(200μg/孔)，或者穩(wěn)定的hERG HEK-293細(xì)胞膜(100μg/孔)與12種不同濃度的特非那定和5nM[3H]-多非利特在室溫下溫育90分鐘?？偨Y(jié)合及非特異性結(jié)合通過與10％DMSO和10μM未標(biāo)記的多非利特在200μl的測(cè)定總體積中溫育測(cè)量。膜用Packard單過濾器細(xì)胞收集器通過過濾收集，并測(cè)量放射性(cpm)。對(duì)cERG和hERG表達(dá)細(xì)胞膜樣品各自進(jìn)行兩個(gè)飽和度實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行三份。圖5顯示了每種細(xì)胞類型的(cERG或hERG轉(zhuǎn)染的)實(shí)驗(yàn)平均值，并表明cERG和hERG的特非那定IC50相似，分別為77.2nM和88.9nM。犬和人ERG的特非那定IC20值分別為10.7nM和12.3nM。
實(shí)施例8轉(zhuǎn)染了cERG或hERG的HEK-293細(xì)胞中E4031競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的比較利用E4031作為測(cè)試化合物進(jìn)行多非利特結(jié)合測(cè)定。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的cERG HEK-293細(xì)胞膜(200μg/孔)，或者穩(wěn)定的hERG HEK-293細(xì)胞膜(100μg/孔)與12種不同濃度的E4031和5nM[3H]-多非利特在室溫下溫育90分鐘?？偨Y(jié)合及非特異性結(jié)合通過與10％DMSO和10μM未標(biāo)記的多非利特在200μl的測(cè)定總體積中溫育測(cè)量。膜用Packard單過濾器細(xì)胞收集器通過過濾收集，并測(cè)量放射性(cpm)。對(duì)cERG和hERG表達(dá)細(xì)胞膜樣品各自進(jìn)行兩個(gè)飽和度實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行三份。圖6顯示了每種細(xì)胞類型的(cERG或hERG轉(zhuǎn)染的)實(shí)驗(yàn)平均值，并表明cERG和hERG的E4031 IC50相似，分別為27.3nM和35.4nM。犬和人ERG的E4031 IC20值分別為3.8nM和4.9nM。
當(dāng)比較測(cè)試化合物的IC50(或IC20)值的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)于cERG和hERG是相似的。這表明hERG或cERG都可以用于本發(fā)明的測(cè)定，來預(yù)測(cè)人QT延長(zhǎng)的發(fā)作。
實(shí)施例9進(jìn)一步測(cè)定優(yōu)化研究為進(jìn)一步優(yōu)化多非利特對(duì)含hERG細(xì)胞膜勻漿的特異性結(jié)合測(cè)定，以SPA測(cè)定形式利用以Tris為基礎(chǔ)的含KCl或MgCl2的緩沖液研究[3H]-多非利特與細(xì)胞膜制備物的相互作用。SPA測(cè)定根據(jù)實(shí)施例3在作為測(cè)定緩沖液的50mM Tris·Cl，10mM KCl，pH7.4或者50mM Tris·Cl，1mM MgCl2，pH7.4中進(jìn)行。測(cè)定利用多非利特或雙苯丁胺作為測(cè)試化合物進(jìn)行。在這些緩沖液條件中所檢測(cè)到的特異性結(jié)合的比較揭示當(dāng)所用的測(cè)定緩沖液為50mM Tris·Cl，1mM MgCl2，pH7.4時(shí)未觀察到特異性結(jié)合；在由50mM Tris·Cl，10mM KCl，pH7.4組成的測(cè)定緩沖液觀察到特異性結(jié)合。對(duì)于在作為測(cè)定緩沖液的50mM Tris·Cl，10mMKCl，pH7.4中進(jìn)行的測(cè)定，得到了每個(gè)測(cè)試化合物的IC50和IC20。多非利特的平均IC50值為8.69±0.45nM，雙苯丁胺的平均IC50值為1.87±0.00μM。多非利特的平均IC20值為1.2nM，雙苯丁胺的平均IC20值為0.248μM。
序列表<110>輝瑞大藥廠(CA，EP除了EP(GB)，JP，US.之外)輝瑞有限公司(EP(GB)).
<120>測(cè)定<130>PCS 22042<150>GB 0121440.2<151>2001-09-04<150>US 60/323973<151>2001-09-20<160>3<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>犬<400>1accacatcca ccaggcacag 20<210>2<211>25<212>DNA<213>pcDNA3.1(-)載體<400>2cccaagctgg ctagcgttta aacgg25<210>3<211>23<212>DNA<213>pSP73載體<400>3taatacgact cactataggg aga 2權(quán)利要求
1.一種測(cè)定方法，包括或由下列步驟組成a)將表達(dá)ERG的細(xì)胞、或者來自于ERG表達(dá)細(xì)胞的膜、或者來自于ERG表達(dá)組織的膜和標(biāo)記的IKR封阻劑在測(cè)定緩沖液中，在存在或不存在測(cè)試化合物或者測(cè)試化合物混合物的條件下溫育；b)測(cè)定特異性結(jié)合的標(biāo)記的IKR封阻劑；c)計(jì)算測(cè)試化合物或者測(cè)試化合物混合物對(duì)標(biāo)記IKR封阻劑結(jié)合的抑制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的測(cè)定方法，其中測(cè)定緩沖液是以Tris為基礎(chǔ)的含有KCl的緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的測(cè)定方法，其中測(cè)定緩沖液包含或由30到100mM Tris·Cl、5到20mM KCl和可選地0.6到2.0mM MgCl2組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的測(cè)定方法，其中測(cè)定緩沖液包含或由30到70mM Tris·Cl、6到15mM KCl和可選地0.6到1.6mM MgCl2組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的測(cè)定方法，其中測(cè)定緩沖液包含或由40到60mM Tris·Cl、7.5到12.5mM KCl和可選地0.8到1.4mM MgCl2組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的測(cè)定方法，其中測(cè)定緩沖液包含或由45到55mM Tris·Cl、8.5到11.5mM KCl和可選地0.9到1.3mM MgCl2或1.0到1.2mM MgCl2組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的測(cè)定方法，其中測(cè)定緩沖液包含或由50mMTris·Cl和10mM KCl組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的測(cè)定方法，其中測(cè)定緩沖液包含或由50mMTris·Cl、10mM KCl和1.0mM MgCl2；或者50mM Tris·Cl、10mM KCl和1.2mM MgCl2組成。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的測(cè)定方法，其中測(cè)定緩沖液室溫下pH是在7.2和7.6之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的測(cè)定方法，其中測(cè)定緩沖液pH是7.4。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的測(cè)定方法，其中ERG是人ERG。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的測(cè)定方法，其中標(biāo)記的IKR封阻劑是標(biāo)記的多非利特或標(biāo)記的MK-499。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的測(cè)定方法，其中標(biāo)記的多非利特或標(biāo)記的MK-499是放射性標(biāo)記的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的測(cè)定方法，其中放射性標(biāo)記是氚(3H)。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的測(cè)定方法，具有下列額外的步驟(d)計(jì)算測(cè)試化合物或測(cè)試化合物混合物的IC20，以及可選地，(e)將測(cè)試化合物或測(cè)試化合物混合物的IC20值與化合物在體內(nèi)預(yù)期的治療效果所需的濃度相比較。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的測(cè)定方法，其中測(cè)定作為過濾結(jié)合測(cè)定進(jìn)行。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任何一項(xiàng)的測(cè)定方法，其中測(cè)定作為閃爍親近測(cè)定法進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用標(biāo)記的內(nèi)部校正鉀通道(IKR)的封阻劑確定化合物在“ether－a－go－go”(ERG)鉀(K
文檔編號(hào)G01N33/68GK1708689SQ02818592
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2002年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月4日
發(fā)明者P·M·格林格拉斯, M·斯圖爾特, C·M·伍德 申請(qǐng)人:輝瑞大藥廠