專利名稱：結(jié)合相光聚合溶膠-凝膠柱和相關的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明的背景本發(fā)明一般地涉及分離柱，和特別地涉及結(jié)合相(a bondedphase)光聚合溶膠-凝膠柱。毛細管電色譜法(CEC)已經(jīng)被認為是非常有希望的分析分離技術(shù)，它兼顧了毛細管區(qū)帶電泳(CZE)的效率與液相色譜的選擇性。雖然CEC已經(jīng)用于許多不同領域，但是填充柱制備和低的探測靈敏度使這一技術(shù)面臨挑戰(zhàn)。含有小的硅石填充物的毛細管柱已經(jīng)成為CEC的主要依靠。填充柱的一個缺點是具有控制的孔徑、長度和高的機械穩(wěn)定性的多孔熔結(jié)玻璃料(frit)的制造。對熔結(jié)玻璃料制造問題作出響應，表面官能化的開口毛細管柱和整體毛細管已作為填充毛細管柱的變型而開發(fā)。整體毛細管柱已經(jīng)受到很多的關注，因為在滲透性和表面電荷的控制中所獲得的優(yōu)點。在CEC技術(shù)中的主要挑戰(zhàn)是含有低濃度的被分析物的樣品的檢測。在低濃度下的敏感性的缺乏歸因于小的樣品容積和在線檢測的短的光程長度。在樣品注入之前富含目標被分析物的專用樣品制備歷程常常是為了獲得許多現(xiàn)實世界分析的必要敏感性所需要的。歷程如溶劑-溶劑萃取和固相萃取常常是非常乏味的和耗時的。這些歷程的替代是在線預濃縮。在氣相色譜中，這一目標通過讓氣流通過冷柱(隨后加熱)來實現(xiàn)。在高效液相色譜(HPLC)中，這一工藝通常利用梯度HPLC來進行，其中對于第一種溶劑與對于后繼的溶劑相比，被分析物更加強烈地保留在柱上。在線的預濃縮也享受著在電泳分離中的一些成功。例如，在毛細管電泳(CE)中，這些包括等速電泳，樣品堆積，清掃，和動態(tài)pH交點的使用。在CZE，F(xiàn).E.P.Mikkers，F(xiàn).M.Everaerts，P.E.M.Verheggen，J.Chromatogr.169(1979)，pp.1-10和R.L.Chien，D.S.Burgi，Anal.Chem.64(1992)pp.489A-496A說明了在樣品和背景溶液區(qū)段之間電場強度的變化能夠聚集(即，堆積)帶電荷的物質(zhì)。在動電學色譜分析，J.P.Quirino，S.Terabe，Science，282(1998)pp.465-68和J.P.Quirino，S.Terabe，Anal.Chem.71(8)(1999)pp.1638-44中已經(jīng)顯示膠束能夠用于濃縮(即清掃)中性和帶電荷的物質(zhì)。在使用顆粒(例如，十八烷基硅石)填充柱的CEC中，已經(jīng)報道了與在梯度高效液相色譜法中類似的聚集效應。這些聚集效應通過使用(1)分步梯度洗脫，(2)在非洗脫溶劑中的樣品的制備，或在樣品注入之后水栓的注射，來實現(xiàn)。M.R.Taylor，P.Teale，D.Westwood，D.Perrett，Anal.Chem.69(1997)pp.2554-58最先于1997年報道了分步梯度在甾族樣品的預濃縮中的應用。D.A.Stead，R.G.Reid，R.B.Taylor，J.Chromatogr.A 798(1998)pp.259-67利用使用非洗脫樣品基體(matrix)的預濃縮來實現(xiàn)了甾族化合物的混合物的檢測靈敏度的17倍增加。Y.Zhang，J.Zhu，L.Zhang，W.Zhang，Anal.Chem.72(2000)pp.5744-47也使用非洗脫溶劑分別將苯偶姻和乙基苯基-N-甲基-乙內(nèi)酰脲預濃縮134和219的因數(shù)。C.M.Yang，Z.El Rassi，Electrophoresis 20(1999)pp.2337-42報道了通過使用在長栓塞的樣品之后所注射的短栓塞的水，對殺蟲劑的稀釋樣品的預濃縮。M.J.Hilhorst，G.W.Somsen，G.J.de Jong，Chromatographia 53(2001)pp.190-96說明了通過使用非洗脫基體和分步梯度洗脫，對在結(jié)構(gòu)上相關的甾族化合物的預濃縮。報道在敏感性上獲得了7到9倍的增加。類似地，T.Tegeler，Z.El Rassi，Anal.Chem.73(14)(2001)pp.3365-72最近剛剛報道了通過聯(lián)合使用非洗脫基體和分步梯度洗脫，在氨基甲酸酯類殺蟲劑的混合物中被分析物的預濃縮。最高允許樣品栓塞長度是～20cm和對于蟲螨威(carbofuran)實現(xiàn)了500倍的敏感性提高。Zhang和同事通過將場增強的樣品注射與溶劑梯度洗脫相結(jié)合而實現(xiàn)了檢測靈敏度的進一步提高。他們說明了在帶正電荷的被分析物，propatenene，的峰高度上的17,000倍增加。希望提供具有改進特性和容易制造的分離柱。
本發(fā)明的概述分離柱包括分離通道和在通道中的分離介質(zhì)。該介質(zhì)包括多孔基體，和該多孔基體包括載體和靜止相。該載體包括金屬有機聚合物，和該靜止相包括結(jié)合相(a bonded phase)。聚合物可以是光聚合物。在優(yōu)選實施方案中，多孔基體不含有色譜分析的顆粒。多孔基體可用于在沒有色譜分析顆粒的情況下預濃縮和分離被分析物。該分離柱允許濃縮和分離出比有色譜分析顆粒的分離柱更大體積的被分析物。提供了制備整體單段(monolith)的方法。提供了分離柱?；旌衔锉灰氲椒蛛x柱中?；旌衔锇ń饘儆袡C化合物?；旌衔锝?jīng)過輻射而利用光引發(fā)聚合反應來形成固體多孔基體。偶聯(lián)劑被引入該柱中。因此，在柱中形成了結(jié)合相多孔基體。在優(yōu)選實施方案中，多孔基體是非熔結(jié)玻璃料(fritless)和不含有色譜分析的顆粒。沒有色譜分析顆粒的非熔結(jié)玻璃料式分離介質(zhì)的制備比制備具有熔結(jié)玻璃料或色譜分析顆粒的分離介質(zhì)更簡單。多孔基體可用于預濃縮和分離被分析物。制備多孔基體的光化學途徑具有許多優(yōu)點(1)短的制備時間，(2)孔隙大小的控制，(3)多孔基體的鍵接(placement)和長度的控制，(4)高的機械強度，和(5)導致開裂的高溫的避免。結(jié)合相的優(yōu)點是改變在色譜分離中各種條件的數(shù)量的能力。提供了分離被分析物的樣品的方法。提供了包括分離通道和在通道中的分離介質(zhì)的分離柱。該介質(zhì)包括多孔基體，和該多孔基體包括載體和靜止相。該載體包括金屬有機聚合物，如光聚合物，和靜止相包括結(jié)合相。在優(yōu)選實施方案中，多孔基體不含有色譜分析的顆粒。在溶液中攜帶的被分析物樣品被引入通過該柱。該介質(zhì)將被分析物濃縮在柱上。溶液被引起流過該柱，因此分離并洗脫該被分析物。該介質(zhì)既預濃縮又分離該被分析物。除了由介質(zhì)所發(fā)揮的作用之外，預濃縮能夠進一步通過溶劑梯度或樣品堆積來增強。
附圖的簡述在結(jié)合附圖閱讀下面的詳細說明之后，本發(fā)明的以上和其它特征和方面將變得更清楚，其中

圖1是根據(jù)本發(fā)明的實施方案的分離柱的示意性縱視圖；圖2A和2B是使用本發(fā)明的實施方案的兩個代表性的電色譜，顯示了(a)一根柱和(b)另一根柱的吸收率/保留時間的曲線；圖3是使用本發(fā)明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖4A和4B是本發(fā)明的實施方案的SEM顯微照片；圖5A和5B是使用本發(fā)明的實施方案的代表性電色譜，顯示了不同被分析物的吸收率/保留時間的曲線；圖6是使用本發(fā)明的實施方案的代表性電色譜，顯示了吸收率/保留時間的曲線；圖7(a和b)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖8(a，b，和c)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖9(a，b，c，d，和e)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖10是顯示使用本發(fā)明的實施方案的峰高比的對數(shù)對樣品中水的百分比的曲線的圖示；圖11(a，b，和c)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖12A，12B和12C是顯示使用本發(fā)明的實施方案的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖13(a和b)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖14(a，b，c，d，和e)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖15(a，b，c，d，e，和f)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖16(a和b)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖17(a，b，c，d，和e)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖18A和18B是本發(fā)明的實施方案的SEM顯微照片；圖19(a，b，c，d，e，和f)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖20(a和b)是顯示使用本發(fā)明的實施方案的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖21是顯示了使用本發(fā)明的實施方案的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；圖22是顯示了使用本發(fā)明的實施方案的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜；和圖23是顯示了使用本發(fā)明的實施方案的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。為了描述的簡單起見，同樣的符號用于在本申請中同樣或相似的部分。
實施方案的詳細說明圖1是根據(jù)本發(fā)明的實施方案的分離柱的縱向剖視圖。該分離柱11包括在管12內(nèi)的分離通道13和在通道13中的分離介質(zhì)15。該分離柱11可以是毛細管或平面片，并且該分離通道13可以包括檢測窗口。該分離介質(zhì)15填充該通道13的至少一段。該介質(zhì)15是均勻的和優(yōu)選不具有熔結(jié)玻璃料或色譜分析的顆粒。該介質(zhì)15可以附著于通道13的通道壁17上。優(yōu)選，該介質(zhì)15可以以共價鍵鍵接于該通道壁17上。管12能夠具有許多不同的橫截面，如圓形橫截面。另外地，管12能夠具有細長的橫截面。這些和其它橫截面對于管12是可能的并且是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。管12可以是典型地由熔凝硅石制造的圓形毛細管。毛細管的內(nèi)徑(i.d.)可以是約10μm到約1000μm，優(yōu)選約75μm到約500μm。管12可以是平面片或限定空間，如由兩個片所限定而成的柱。該介質(zhì)15包括多孔基體，和該多孔基體包括載體和靜止相。該載體包括金屬有機聚合物，如光聚合物，和靜止相包括結(jié)合相。聚合物的前體可以金屬醇鹽，如硅烷。該金屬可以是鋁，鋇，銻，鈣，鉻，銅，鉺，鍺，鐵，鉛，鋰，磷，鉀，硅，鉭，錫，鈦，釩，鋅，或鋯。該前體可以包括感光的基團，如甲基丙烯酸酯。在一個實施方案中，該前體可以是甲基丙烯酸三甲氧基甲硅烷基丙基酯，也已知為甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。不同的官能化或衍生化單體可用于制備具有不同物理性能如孔隙大小、聚合物電荷密度和疏水性的多孔基體。利用不同孔隙產(chǎn)生劑(porogens)控制孔隙形狀和尺寸能夠獲得具有寬的孔隙尺寸分布(即孔隙尺寸梯度)的多孔基體。具有孔徑尺寸梯度的多孔基體能夠用作毛細管電泳和毛細管電色譜法中的“分子分類器”。多孔基體能夠分離尺寸結(jié)構(gòu)或化學性質(zhì)不同的大分子的混合物(例如，DNA片段)。另外，分離柱11能夠為反轉(zhuǎn)相，尺寸排阻，親合性，離子交換色譜分析等等而設計。多孔基體可以是從單體的混合物制備的混合相多孔基體。例如，該單體可以包括甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷，和雙(三乙氧基甲硅烷基)辛烷。該混合相多孔基體可具有不同的性能，如疏水性。多孔基體的性能也能夠通過結(jié)合相的使用來改變。結(jié)合相是以共價鍵鍵接于載體顆粒上或鍵接于柱管料的內(nèi)壁上的靜止相。例如，該結(jié)合相可以包括鍵接于金屬有機聚合物的表面上的官能團。該官能團可以是任何官能團，如疏水性或親水性基團，帶電荷的或無電荷的基團，或有機或無機基團。該官能團能夠改變多孔基體的性能，如疏水性，電荷，保留系數(shù)，相互作用的類型，或多孔基體的手征性。該結(jié)合相多孔基體可用于正常相，反相，離子交換，親合性，疏水性相互作用，尺寸排阻，或手性色譜分析。結(jié)合相能夠增強被分析物的分離的拆分和能夠在某種程度上使聚合物的表面減活。該減活可以減少由于游離羥基的離子化產(chǎn)生的現(xiàn)有負電荷所引起的表面活性。該結(jié)合相多孔基體則能夠支持在柱中的電滲流(EOF)。該結(jié)合相多孔基體對于被分析物具有親和性并能夠用于預濃縮和分離被分析物的樣品。被分析物的親合性可由被分析物的保留系數(shù)k來表述。該保留系數(shù)k等于 該保留系數(shù)，k，也可以表示為k=tR-t0t0---(2)]]>其中tR是被分析物的遷移時間，和t0是“未保留”被分析物的遷移時間。該保留系數(shù)受到溶劑的性質(zhì)，被分析物的性質(zhì)，柱的長度，多孔基體的滲透性，多孔基體的疏水性，鍵接于金屬有機聚合物上的官能團，和多孔基體的詳細形態(tài)的影響。該分離柱11可以用于分析或半制備性工作。亞毫克到毫克量的被分析物的分離對于在分離柱11上的預濃縮而變得可能。例如，超過約100-nL的處于mM水平的被分析物濃度下的樣品溶液能夠注入到該柱中，但沒有超負載的明顯證據(jù)。提供了在分離柱11中制備整體單段的方法。提供了分離柱。該分離柱可以是典型地由熔凝硅石制成的圓形毛細管。毛細管的內(nèi)徑(i.d.)可以是約10μm到約1000μm，優(yōu)選約75μm到約500μm。包括金屬有機化合物的混合物被引入該分離柱中?；旌衔锝?jīng)由光引發(fā)的聚合反應形成固體多孔基體?；旌衔锟梢园ń饘儆袡C單體，孔隙產(chǎn)生劑，和光引發(fā)劑。該金屬有機單體可以是金屬醇鹽，如硅烷，或金屬醇鹽的混合物。該金屬可以是鋁，鋇，銻，鈣，鉻，銅，鉺，鍺，鐵，鉛，鋰，磷，鉀，硅，鉭，錫，鈦，釩，鋅，或鋯。金屬醇鹽可以包括感光的基團，如甲基丙烯酸酯。在一個實施方案中，該前體可以是甲基丙烯酸三甲氧基甲硅烷基丙基酯，也已知為甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。在另一個實施方案中，該前體可以是甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和另一種前體，如雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷或雙(三乙氧基甲硅烷基)辛烷的混合物。該金屬有機單體可以被加入到酸或堿催化劑中以進行前體的水解。該催化劑將烷氧基轉(zhuǎn)化為羥基。例如，硅烷可以進行下列水解反應而形成全水解的硅烷(3)該水解反應可以在部分水解的硅烷，Si(OR)4-n(OH)n上停止。該金屬有機單體和該催化劑可以攪拌大約零分鐘到大約二十四小時?？紫懂a(chǎn)生劑或孔隙產(chǎn)生劑的混合物可以與金屬有機單體和催化劑混合，和混合物可以攪拌大約零分鐘到大約二十四小時。在這一時間中，該金屬有機單體可以進行縮合反應而形成二聚物，三聚物，和其它低聚物。例如，部分水解的硅烷可以進行下列縮合反應(4)較大的低聚物可以通過提高反應的溫度來形成。該孔隙產(chǎn)生劑提供分子模板而在基體內(nèi)形成孔隙。例如，該孔隙產(chǎn)生劑可以是溶劑，如甲苯或己烷和甲苯的1∶1混合物，聚合物，或無機鹽，如氯化鈉粉末或硫酸鈉。聚合物孔隙產(chǎn)生劑可以是聚(甲基丙烯酸甲酯)或聚苯乙烯，由D.Horak，J.Labsky，J.Pilar，M.Bleha，Z.Peizbauer，F(xiàn).Svec，Polymer 34(16)(1993)pp.3481-89進行了報道。該孔隙產(chǎn)生劑可以可控地選擇以便在基體15中形成孔隙?；w的孔隙度可以通過所使用的化學品(即孔隙產(chǎn)生劑)的類型以及它在反應溶液中的體積或濃度來控制。例如，單體與孔隙產(chǎn)生劑的克分子或體積比可以經(jīng)過選擇以在混合物中形成孔隙。通過調(diào)節(jié)單體和孔隙產(chǎn)生劑的摩爾比率，基體的物理性能(例如，孔隙尺寸)可以得到控制。該光引發(fā)劑或在單體上的光活性基團如甲基丙烯酸酯吸收光來催化金屬有機化合物的聚合反應。在一個實施方案中，該光引發(fā)劑可以是Irgacure 1800，可以從Ciba Geigy，Tarrytown，New York商購。如果該分離柱具有對光源不透明的外涂層，則涂層首先被除去以制造輻射窗口。涂層的長度將決定了在分離柱中所形成的多孔基體的長度?；旌衔锉灰朐摲蛛x柱中。例如，混合物可以通過使用注射器而流過該分離柱。分離柱的末端可以密封。混合物被輻射，因此在分離柱中形成均勻的分離介質(zhì)。例如，該分離柱可以在一段短時間如大約五分鐘暴露于輻射。輻射的波長取決于用于該反應中的光引發(fā)劑或光活性基團的類型。該輻射可以包括可見光或紫外光。例如，365nm波長的輻射可用于光引發(fā)劑Irgacure 1800。該光活性基團甲基丙烯酸酯可以在300nm或365nm的波長下光聚合，如分別在C.Yu，F(xiàn).Svec，J.M.J.Frechet，Electrophoresis 21(1)(2000)pp.120-27和H.-G.Woo，L.-Y.Hong，S.-Y.Kim，S.-H.Park，S.-J.Song，H.-S.Ham，Bull.Korean Chem.Soc.16(1995)pp.1056-59中所報道。當混合物暴露于輻射時發(fā)生光化反應。在單體上的光引發(fā)劑或光活性基團吸收光來催化金屬有機化合物的聚合反應。制備多孔基體的光化學途徑具有許多優(yōu)點(1)短的制備時間，(2)孔隙大小的控制，(3)多孔基體的鍵接和長度的控制，(4)高的機械強度，和(5)導致開裂的高溫的避免。該分離介質(zhì)優(yōu)選不具有熔結(jié)玻璃料或色譜分析的顆粒，因此分離介質(zhì)的制備比用熔結(jié)玻璃料或色譜分析顆粒制備普通的分離介質(zhì)更容易。任選，有機溶劑可以被引入到分離柱中。例如，該有機溶劑可以是乙醇。多孔基體可以使用有機溶劑被洗凈任何未反應的物質(zhì)，孔隙產(chǎn)生劑，和光引發(fā)劑。溶劑可以通過使用注射器或其它器具而流過該分離柱。偶聯(lián)劑被引入該柱中而形成結(jié)合相多孔基體。偶聯(lián)劑可具有單官能度，雙官能度，或三官能度。偶聯(lián)劑可以是有機偶聯(lián)劑，如鹵代芳族或酰鹵。例如，氰化鈉和氯化銨能夠與金屬有機聚合物上的酮起反應，或鹵代芳族或酰鹵能夠進行縮合反應。偶聯(lián)劑可以包括官能團和金屬。該金屬可以是鋁，鋇，銻，鈣，鉻，銅，鉺，鍺，鐵，鉛，鋰，磷，鉀，硅，鉭，錫，鈦，釩，鋅和鋯。例如，硅烷偶聯(lián)劑可以是有機氯硅烷，有機烷氧基硅烷，有機氨基硅烷，或其它反應性硅烷。該硅烷偶聯(lián)劑可用于金屬有機聚合物的表面羥基被官能團的衍生化中。例如，該金屬有機聚合物和硅烷偶聯(lián)劑，如包括官能團R’的有機氯硅烷可以進行下列反應而形成結(jié)合相多孔基體(5)該溫度不需要升高以提高該反應速率；該反應可以在室溫下進行。反應的時間將取決于官能團而變化。例如，增加的反應時間將對于較大官能團導致相塌陷。當官能團彼此太接近和彼此屏蔽時會發(fā)生相塌陷，據(jù)此減少了在表面上活性基團的數(shù)目。任選，有機溶劑可以被引入到包括結(jié)合相多孔基體的柱中。例如，該有機溶劑可以是甲苯，吡啶，或三乙胺。任何未反應的硅烷偶聯(lián)劑和該反應的副產(chǎn)物，如鹽酸或醇，可以通過將有機溶劑引入到柱中而從結(jié)合相多孔基體中除去。溶劑可以通過使用注射器或其它器具而流過該分離柱。該分離柱可以在將柱用于分離之前用分離溶液調(diào)理。分離溶液可以包括緩沖劑，如含水乙酸銨，和洗脫溶劑，如乙腈。提供了分離被分析物的樣品的方法。樣品溶液中的被分析物的樣品被引入通過分離柱11。被分析物包括中性物質(zhì)，如多環(huán)芳族烴，烷基苯，烷基苯基酮，和甾族化合物，和帶電荷的物質(zhì)，如肽。樣品溶液可以包括緩沖劑，如含水乙酸銨，和洗脫溶劑，如乙腈。該分離柱11包括分離通道13和在通道13中的均勻的分離介質(zhì)15。該分離柱11可以是毛細管或平面結(jié)構(gòu)。該分離介質(zhì)15優(yōu)選不具有熔結(jié)玻璃料或色譜分析的顆粒。均勻的分離介質(zhì)的使用是有利的，因為，在一些應用中，色譜分析的顆粒(即非均勻的分離相)的使用會引入不需要的變寬(即拆分度不足)。該分離介質(zhì)15可能包括含有基本上相同的多孔均勻靜止相的兩區(qū)段，而且兩區(qū)段可以被另一個區(qū)段分開，如具有不同的孔隙尺寸或表面電荷的整體單段(monolith)。優(yōu)選，該分離介質(zhì)15是連續(xù)的。分離介質(zhì)15包括多孔基體，和多孔基體包括載體和靜止相。該載體包括金屬有機光聚合物，和該靜止相包括結(jié)合相。該分離介質(zhì)15將被分析物濃縮在柱上。樣品可以通過對柱11施加壓力或電壓來引入。例如，該壓力可以在一段時間(兩秒至1920秒鐘)中是0.5psi或20psi，或約40V/cm的電場強度施加一段時間。例如，大于約兩厘米的注射栓塞長度可以注入到該柱11中。被分析物利用柱11來濃縮。預濃縮的程度純粹地取決于保留系數(shù)，即k值。該保留系數(shù)受到溶劑的性質(zhì)，被分析物的性質(zhì)，和分離介質(zhì)的詳細形態(tài)的影響。而且，該流速幾乎不影響預濃縮的程度。多孔基體的高孔隙度的性質(zhì)導致了對于被分析物的高質(zhì)量轉(zhuǎn)移速率，它促進該預濃縮效果。高質(zhì)量轉(zhuǎn)移速率起因于被分析物對于多孔結(jié)構(gòu)的結(jié)合部位的增強的可達到性。因為高質(zhì)量轉(zhuǎn)移速率，被分析物-多孔基體相互作用的動力學(即被分析物在移動相和靜止相之間的分配)不是該分離中的速率限制步驟。高質(zhì)量轉(zhuǎn)移速率使得該分離方法區(qū)別于先前形式的色譜分離。對于這一分離方法，因為高質(zhì)量轉(zhuǎn)移速率，有可能注入和濃縮更大體積的樣品溶液，與含有正常的色譜分析材料的柱相比而言?？偟念A濃縮效果與保留系數(shù)成正比，其中較長的注射栓塞長度(例如，大于約25mm)導致具有低k值的被分析物的嚴重的峰加寬。這一行為暗示了在峰形狀折中之前，各被分析物的樣品栓塞的最大長度。該保留系數(shù)能夠通過改變結(jié)合相來改變。在線預濃縮的主要優(yōu)點是它降低了給定的被分析物的檢測極限。另一個優(yōu)點是預濃縮可用于為被分析物清洗掉在樣品基體中見到的可能的干擾性物質(zhì)。讓分離溶液流過柱11，因此分離并洗脫該被分析物。該分離溶液可通過對柱11施加電壓或壓力而被引起流動。例如，該壓力可以在一段時間(兩秒至1920秒鐘)中是0.5psi或20psi，或300V/cm的電場強度施加一段時間。分離溶液可以包括緩沖劑，如含水乙酸銨，和洗脫溶劑，如乙腈。在一個實施方案中，該分離溶液與樣品溶液相同。結(jié)合相多孔基體用于從溶液中萃取被分析物以及為被分析物的色譜分離提供靜止相。正是這一萃取器-分離器聯(lián)合，使得這一方法更有效力。例如，樣品溶液的超過約兩厘米栓塞能夠裝載到毛細管中并使用與該樣品溶液相同的分離溶液來濃縮。在一個實施方案中，該被分析物可以通過進行正常相，反相，離子交換，親合性，疏水性相互作用，尺寸排阻，或手性色譜分析來分離。在另一個實施方案中，除了由多孔基體所發(fā)揮的效果，溶劑梯度可用來進一步增強被分析物的預濃縮。在這一實施方案中，樣品可以溶于溶液中，后者具有比在分離溶液中更高濃度的緩沖劑(例如，水)。緩沖劑在樣品溶液中的較高濃度會提高樣品對靜止相的親合性。當使用溶劑梯度時，栓塞長度能夠長于柱的長度。例如，91.2cm栓塞的注入，它是毛細管的總長度的三倍以上，是可能的，而僅僅在拆分率上有輕微損失。在梯度條件下獲得的峰高度的改進能夠是大于一千倍。對于中性被分析物，現(xiàn)有在多孔基體上使用梯度的兩種途徑。第一種途徑是提高在分離溶液和樣品溶液之間的有機溶劑比率。第二種途徑是通過提高水在分離溶液中的百分比，同時維持在分離溶液和樣品溶液之間有機溶劑的合理百分比，來提高在分離中的保留系數(shù)k。分析對于第一種途徑是更快的，而拆分率對于第二種途徑是更好的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，除了由多孔基體所發(fā)揮的效果，樣品堆積可用來進一步增強被分析物的預濃縮。樣品堆積是帶電荷的被分析物的聚集，當該被分析物經(jīng)過分開高和低電場強度的區(qū)域的濃度邊界時。高的電場區(qū)域是含有更多洗脫溶劑的較低導電性樣品溶液，而低電場區(qū)域是較高導電性分離溶液。該洗脫溶劑，如乙腈，具有比緩沖劑如乙酸銨水溶液更低的導電性。因此，較高濃度的洗脫溶劑導致降低樣品基體導電性。該分離柱是用分離溶液制得。當被分析物被引入該分離柱中和施加電壓時，樣品溶液中的被分析物在柱的進口快速地加速移向早已在柱中存在的分離溶液(較低電場強度)，而穿越在樣品溶液和分離溶液之間的邊界時，他們減慢速度并堆積在界面上的窄區(qū)段中。樣品堆積基本上是由在濃度邊界上電泳速度的變化所引起。電泳速度是電泳遷移率和電場強度的乘積。當電泳速度在濃度邊界處降低時發(fā)生聚集(樣品堆積)。樣品堆積也通過使用等速電泳的基本原理和科爾勞施(Kohlrausch)定律來解釋。現(xiàn)有在多孔基體上進行樣品堆積的兩種途徑。第一種途徑是提高有機溶劑如乙腈的百分比。第二種途徑是降低緩沖組分在樣品溶液中的濃度。提高乙腈或其它合適有機溶劑的百分比尤其可用于含有高濃度鹽的真實樣品。脫鹽，例如通過透滲析，因此是制備供注射用的較低導電性溶液所不需要的。當脫蛋白質(zhì)是樣品制備的一部分時，有機溶劑的使用也用于生物樣品。本發(fā)明利用下列實施例更詳細地進行描述。下列實施例僅僅為了進一步說明和公開本發(fā)明而給出，不應該認為限制本發(fā)明。
實施例1原料和化學品。熔凝硅石毛細管(75μm i.d.×365μm o.d.)是從Polymicro Technologies，Phoenix，Arizona商購的。甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)是從Gelest，Tullytown，Pennsylvania和Sigma-Aldrich，Milwaukee，Wisconsin商購的并且在沒有提純的情況下使用。HPLC-級甲苯，菲，芘，烷基苯，烷基苯基酮，和甾族化合物是從Sigma-Aldrich，Milwaukee，Wisconsin購得。Irgacure 1800是從Ciba，Tarrytown，New York獲得。安裝儀器。使用帶有UV吸光檢測器的Beckman P/ACE2000毛細管電泳儀來進行全部CEC實驗。X1-1500 UV cross-linker，可從Spectronics Corp.，Westbury，New York獲得，裝有主要地365nm波長的六只15W黑光燈管，用于輻射該反應溶液。在從Eindhoven，Netherlands獲得的Philips SEM 505掃描電子顯微鏡上進行掃描電子顯微鏡(SEM)分析。聚合反應程序。通過將375μl的MPTMS添加到100μl的0.12N HCl中，剛好在使用之前制備單體貯備溶液。這一溶液在室溫下攪拌大約三十分鐘而獲得透明、單相的溶液。將合適量的甲苯(孔隙產(chǎn)生劑)加入到該單體貯備溶液中，如在下表1中所示。
表1
光引發(fā)劑，Irgacure 1800，首先被添加到該甲苯中，按照甲苯/單體貯備溶液的總重量的5％。這一光引發(fā)劑溶液然后被加到相應量的單體貯備溶液中，并在室溫下攪拌三十分鐘而獲得黃色，單相的溶液。為了最大程度地減少甲苯的蒸發(fā)，該溶液是在具有聚硅酮封蓋的管形瓶中制備，在溶液的填充過程中經(jīng)由該封蓋將毛細管插入。通過使用位于毛細表面的45°角的刀片，除去在30v長的毛細管上的聚酰亞胺涂層的15cm細條。毛細管的機械穩(wěn)定性是顯著地優(yōu)良的，盡管有聚酰亞胺涂層的細條的除去。輻射光僅僅通過該15cm細條進入毛細管。在毛細管中沒有形成整體單段，其中聚酰亞胺涂層(“掩蔽層”)完整無損。通過使用0.5ml一次性注射器，在用溶液裝填該毛細管之前將大約0.2ml的反應溶液沖洗通過該毛細管以便徹底地濕潤壁面。這導致整體單段粘結(jié)于毛細血管壁上。不需要毛細血管壁的特殊預處理來將整體單段粘結(jié)于壁上。填充好的毛細管在UV cross-linker中使用365nm光進行輻射(9×105mJ/cm2)五分鐘而形成多孔基體。在輻射后，該毛細管利用手持注射器用乙醇洗滌，以除去未反應的試劑或孔隙產(chǎn)生劑。因為該整體單段是高度滲透性的，不需要高壓來驅(qū)動液體通過該毛細管。一旦未反應的試劑被除去，該整體單段變成不透明的并且無需借助顯微鏡就能清楚地透過該毛細管看見。多孔基體的均勻性是在100X放大倍數(shù)下證實。緊接著在整體單段區(qū)段之后用發(fā)煙硫酸燒除聚酰亞胺涂層而形成檢測窗口。一旦制造之后，該毛細管成功地安裝在盒中，沒有任何損害。使用注射器和手持鉗子，該毛細管用分離緩沖液調(diào)理大約五分鐘。一次在該儀器中，毛細管進一步通過用分離緩沖液加壓漂洗(20psi)來調(diào)理或通過在5kV或10kV下電動力學調(diào)理三十分鐘。表征。SEM用于研究分離柱的形態(tài)。毛細管被小心地切開以暴露該整體單段。毛細管的切開段用金進行濺射，之后進行SEM分析。被分析物分離。在移動相中制備被分析物，以防止在CEC實驗過程中的梯度效應。該移動相是由各種比率(v/v)的50mM乙酸銨，水，和乙腈組成。新樣品溶液用于每一次注射，以維持在樣品溶液和移動相中相同濃度的乙腈。圖2A是顯示柱B的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。該分離是用50mM乙酸銨/水/乙腈(1/3/6)溶液來進行。樣品溶液在0.5psi壓力下注入達到三秒鐘，和在20℃的溫度下用1kV的外加電壓進行分離和然后在214nm下檢測。分離的洗脫順序是(1)硫脲，(2)四氫呋喃，(3)萘，(4)菲，(5)熒蒽，(6)芘，(7)1，2-苯并蒽，和(8)1，2，5，6-苯并蒽(bienzanthracene)。圖2B是顯示柱D的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。該分離是用50mM乙酸銨/水/乙腈(1/4/5)溶液來進行。樣品溶液在0.5psi壓力下注入達到三秒鐘，和在20℃的溫度下用15kV的外加電壓進行分離和然后在200nm下檢測。分離的洗脫順序是(1)苯，(2)甲苯，(3)乙烯苯，(4)丙基苯，(5)丁基苯，和(6)己基苯。柱的洗脫順序類似于利用比小分子量或較高親水性的被分析物更遲洗脫的較大分子量或較高疏水性的被分析物來進行的反相色譜的洗脫順序。在兩圖中的被分析物的洗脫是在低于七分鐘內(nèi)進行。氣泡形成不是CEC實驗中的問題，為此典型的操作電流是在3和10μA之間。對于典型的毛細管柱D，對于硫脲，較少保留的化合物，實現(xiàn)了高達100,000板/m的效率。在三天的時間中(n＝33)對于硫脲(0.65％RSD)，萘(1.10％RSD)，菲(1.14％RSD)，和芘(1.14％RSD)觀察到洗脫時間的小變化。圖3是顯示柱D的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。該分離是用50mM乙酸銨/水/乙腈(1/3/6)溶液來進行。樣品溶液在0.5psi壓力下注入達到三秒鐘，和在20℃的溫度下用1kV的外加電壓進行分離和然后在214nm下檢測。硫脲，萘，菲，和芘的樣品是在僅僅20psi(儀器的最高界限)的施加的壓力下在110分鐘中被分離。峰拖尾對于芘是最嚴重的，因為它與多孔基體的強相互作用，但對于硫脲沒有觀察到拖尾，因為硫脲在柱上較低停留。圖4A是在75μm-i.d.毛細管柱中用80％(v/v)甲苯(毛細管B)形成的金屬有機光聚合物的橫截面的掃描電子顯微照片。該顯微照片顯示了1μm球形結(jié)構(gòu)的互連網(wǎng)絡，在其中散布了微米級尺寸的大孔(大到5μm)。圖4B是在75μm-i.d.毛細管柱中用50％(v/v)甲苯形成的金屬有機光聚合物的橫截面的掃描電子顯微照片。與圖4A中示出的多孔基體相反，在圖4B中示出的結(jié)構(gòu)是具有2μm或更低直徑的大孔的致密的光聚合物。因此，在圖4B中的基體是較低滲透性的，和產(chǎn)生相當大的回壓。在接近200psi的壓力下沒有液體被驅(qū)動穿過該柱。多孔基體的滲透性是通過多孔基體的線速度來決定，它與滲透性成正比，如在達西定律(Darcy’s law)中所述。多孔基體的滲透性與大孔尺寸的關系高度取決于用于制備光聚合物的孔隙產(chǎn)生劑的體積和類型。對于用90％(v/v)甲苯制得的柱(柱A)，線速度是12.3cm/分鐘，和80％(v/v)柱(柱B)具有3.3cm/分鐘的線速度而用73％(v/v)甲苯制得的柱(柱D)具有0.6cm/分鐘的線速度。這些線速度數(shù)據(jù)提示了大孔隨著降低孔隙產(chǎn)生劑濃度而減少。這一行為與在文獻中報道的一致。
實施例2按照在實施例1中所述來制備分離柱。1∶1己烷/甲苯的混合物用于該孔隙產(chǎn)生劑。該分離柱具有與用80/20甲苯/反應溶液制得的分離柱的分離性能類似的分離性能。獲得了對于硫脲的68,000板/m(RSD 7.0％，n＝5)的柱效率和3.7cm/分鐘的電滲流(EOF)速度。
實施例3375μl的MPTMS和100μl的0.12M鹽酸的混合物在室溫下攪拌三十分鐘。27份的這一混合物與73份的甲苯混合而得到200μl的最終溶液。添加相當于最終溶液的5wt％的光引發(fā)劑Irgacure 1800，和所獲得的溶膠-凝膠溶液在使用之前攪拌五分鐘。75μm i.d.×365μmo.d.熔凝硅石毛細管用該溶膠-凝膠溶液填充，然后該分離柱在Spectrolinker X1-1500中暴露于365nm的UV光來進行光聚合。多孔基體的聚合反應長度可通過在五分鐘的輻射之前除去毛細管的聚酰亞胺涂層的15cm細條來控制。未反應的試劑用乙醇沖洗掉。毛細管的總長度是25.6cm(從進口到檢測器窗口為18.8cm)。在使用之前所獲得的柱用該分離溶液進行調(diào)理。全部電泳實驗用Beckman P/ACE 2000來進行。該毛細管然后恒溫在20℃。注射通過使用壓力(即，0.5psi和20psi)或電壓(1kV到10kV)和在兩秒到1920秒之間改變持續(xù)時間來進行。檢測是在214或254nm下進行。數(shù)據(jù)分析是用從Galactic Industries Corporation，Salem，New Hampshire獲得的GRAMS/32版本4.02來進行。圖5A和5B是顯示了使用本發(fā)明的實施方案的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。這些圖說明了，在含有小分子，硫脲，三種多環(huán)芳族烴(PAHs)，和8種烷基苯基酮的混合物的CEC分離中，隨著注入的栓塞長度的增加，檢測靈敏度提高。為了消除溶劑梯度影響，樣品是在該分離溶液中制備。樣品和分離溶液是50mM乙酸銨/水/乙腈(1/4/5)。在圖5A中，栓塞長度是0.1mm，6.8mm，13.7mm，27.4mm，和34.2mm。0.1mm栓塞長度屬于0.5psi的施加的壓力，而全部其它栓塞長度屬于20psi的施加的壓力。分離的外加電壓是20kV，和該吸收率是在214nm下測量。柱的洗脫順序是(1)12.5μM硫脲，(2)51.0μM萘，(3)1.0μM菲，和(4)123μM芘。在圖5B中，該柱是按照與前面所述的柱同樣的方式制備，只是該柱通過(3，3，3-三氟丙基)三氯硅烷在室溫下的三十分鐘的連續(xù)流動和隨后用甲苯漂洗來進行后改性。栓塞長度是0.7mm，7.2mm，10.7mm，17.9mm，和28.6mm。外加電壓是15kV，和該吸收率是在254nm下測量。柱的洗脫順序是(1)5μm硫脲，(2)乙酰苯，(3)丙酰苯，(4)丁酰苯，(5)戊酰苯，(6)己酰苯，(7)庚酰苯，(8)辛酰苯，和(9)癸酰苯。這些烷基苯基酮中的每一種的濃度是在分離溶液中0.1μg/mL。對于在圖5A中示出的PAH混合物，以0.1mm栓塞長度的典型注射幾乎看不見峰，但是當栓塞長度從6.8mm提高到34.2mm時峰高度提高。因此，該分離柱，本發(fā)明的實施方案，允許比典型分離柱更長的栓塞長度的注射。類似地，對于在圖5中示出的烷基苯基酮混合物，當栓塞長度從0.7mm增加到57.3mm時峰高度提高。隨著栓塞長度的增加，全部四個峰都顯示更多的變寬，但是后面的洗脫峰則在較小程度上比前面的洗脫峰更對稱。這一行為與在典型的色譜分離中觀察到的不同，在典型的色譜分離中，后面的洗脫峰因為分散效應而不如前面的峰對稱。這些結(jié)果顯示，在注射過程中被分析物在多孔基體的進口處積聚，其中較多保留性的物質(zhì)比較少保留性的物質(zhì)更有效地定位。在圖5A中，與0.1mm的典型注射相比27.4mm注射的峰高度分別對于萘，菲，和芘是50，125和127倍。在27.4mm注射中的樣品溶液是在典型的0.1mm注射中的樣品的10倍稀釋液。
實施例4
按照在實施例3中所述來制備分離柱。樣品和分離溶液是50mM乙酸銨/水/乙腈(1/3/6)。樣品在1kV下注入。外加電壓是15kV，和該吸收率是在214nm下檢測。圖6是顯示了使用本發(fā)明的實施方案的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。在分離溶液中39.0mM的萘被注射五秒鐘，由信號a表示，和在分離溶液中的3.9mM的萘被注射八十五秒，由信號b表示。通過控制樣品的十倍稀釋液的注射時間，兩電色譜的矯正峰面積(峰面積/遷移時間)彼此變得更靠近。在a和b兩線中電泳圖譜的矯正峰面積分別是0.0023(％RSD＝0.02％，n＝3)和0.0025(％RSD＝0.00，n＝3)任意單位/分鐘。進行對比，使得每一輪注射的萘分子的量是相同的。預濃縮是通過稀釋樣品的較長時間注射的稍高峰高度和對于兩實驗的幾乎相同的矯正峰寬(峰寬/遷移時間)來證實。在信號a和b中電色譜的峰高度分別是0.0869(％RSD＝0.36％，n＝3)和0.0937(％RSD＝0.06％，n＝3)任意單位。在a和b兩信號中電色譜的峰寬度分別是0.0253(％RSD＝0.07％，n＝3)和0.0249(％RSD＝0.01％，n＝3)任意單位/分鐘。在b線上遷移時間的變化是由較長注射時間所引起，這使得樣品栓塞的中心更靠近檢測器窗口。
實施例5
575μl的MPTMS和100μl的0.12M鹽酸的混合物在室溫下攪拌三十分鐘。20份的這一混合物與80份的甲苯混合而得到200μl的最終溶液。添加相當于最終溶液的總體積的10％的光引發(fā)劑，和所獲得的溶膠-凝膠溶液在使用之前攪拌五分鐘。如以上在實施例3中所述來制備分離柱。未反應的試劑用甲苯?jīng)_洗掉。多孔基體的表面通過五氟苯基三氯硅烷在室溫下經(jīng)由毛細管的四十五分鐘的連續(xù)流動和隨后用甲苯漂洗來改性。圖7(a和b)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。分離溶液是50mM磷酸/水/乙腈(1/5/4)。外加電壓是15kV，和該吸收率是在214nm下檢測。圖7(a)顯示了試驗肽的在0.1mm栓塞長度的0.5psi注射，和圖7(b)顯示了試驗肽的在12mm栓塞長度的0.5psi注射。試驗肽，它們是帶電荷的被分析物，是(1)血管舒緩激肽，(2)血管緊張素II，(3)三肽I，(4)三肽II，和(5)蛋氨酸腦啡肽。肽的濃度是16.7μg/ml。肽的陰極引導速度是由電泳和電滲流效應來支配。該肽在分離溶液的pH(pH＝2)下具有凈正電荷。與0.1mm栓塞長度的典型注射相比更長時間的注射的峰高度的改進分別對于血管舒緩激肽，血管緊張素II，三肽I，三肽II，和蛋氨酸腦啡肽是21，19，16，18和22倍。這一結(jié)果說明了這一方法對于帶電荷的被分析物的有用性。
實施例6
與在實施例3中一樣制備分離柱。圖8(a，b，和c)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。圖8顯示了尿樣品的分析結(jié)果，摻加0.1mM皮質(zhì)甾醇(峰1)，0.3mM黃體酮(峰2)和0.2mM可的松(峰3)。四份的摻加或未摻加的尿與六份的乙腈混合和離心處理以除去蛋白質(zhì)。在注射之前一份的各上層清液與一份的50mM乙酸銨/水/乙腈(1/7/2)混合。圖8(a)顯示了0.1mm的注射栓塞長度，和圖8(b)顯示了21.4mm的注射栓塞長度。圖8(c)表示了尿空白的21.4mm注射栓塞長度。分離溶液由50mM乙酸銨/水/乙腈(1/5/4)組成。分離的外加電壓是17kV，和該吸收率是在254nm下測量。在用乙腈進行蛋白質(zhì)沉淀后，這些甾族化合物被檢測和用樣品溶液的21.4mm注射來定量，但是用典型的0.1mm注射來微弱地檢測。在空白試驗和摻加的試驗之間的對比表明，仍然含有其它生物分子的樣品基體沒有顯著地干擾該分離柱的甾族化合物分析。這一結(jié)果說明了該技術(shù)在生物流體分析中的有用性。
實施例7
按照在實施例3中所述來制備分離柱。圖9(a，b，c，d，和e)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。1.1cm的樣品栓塞長度被注入。該分離溶液是在60％乙腈中5mM乙酸銨，和樣品溶液是在60％乙腈(a)，50％乙腈(b)，40％乙腈(c)，30％乙腈(d)，和20％乙腈(e)中的5mM乙酸銨。分離的外加電壓是15kV，和該吸收率是在254nm下檢測。洗脫順序是(1)硫脲，(2)乙酰苯，(3)丙酰苯，(4)丁酰苯，(5)戊酰苯，(6)己酰苯，(7)庚酰苯，(8)辛酰苯，和(9)癸酰苯。各被分析物的濃度是2nl/ml。該保留系數(shù)，k，對于乙酰苯(峰2)，丙酰苯(峰3)，丁酰苯(峰4)，戊酰苯(峰5)，己酰苯(峰6)，庚酰苯(峰7)，辛酰苯(峰8)和癸酰苯(峰9)獲得的保留系數(shù)k分別是0.18，0.25，0.32，0.41，0.53，0.67，0.85和1.33。在這一研究中，硫脲(峰1)用作供k的測定用的基本上未保留的中性溶質(zhì)。k的值和遷移時間跟隨烷基鏈長度的增加。通常，當水濃度從40％提高到50％，60％，70％和80％時改進了峰形狀和拆分，這可分別由a，b，c，d，和e來證實。
實施例8
該實驗條件與在實施例7中相同。圖10是曲線的圖解表示，顯示了峰高度比率(從樣品基體中較高濃度的水獲得的峰高度除以從與分離溶液的樣品基體類似的樣品基體獲得的峰高度)的對數(shù)/樣品基體中水的百分比的關系。該數(shù)據(jù)顯示存在一種限度，在該限度上峰高度能夠通過提高樣品基體中緩沖劑的濃度來改進。預濃縮得到改進，歸因于被分析物對多孔基體的增加的吸引。當峰高度比的對數(shù)的值是低于1，約1，或大于1時，與使用分離溶液作為樣品基體的類似注射相比，在峰高度中分別有降低，無變化，或提高。對于全部的試驗APK，當水濃度從40％提高到50％和從50％提高到60％時，峰高度得到改進。當水的百分比從60％提高到70％或更高時峰高度沒有改進，但是，當水的百分比從60％提高到70％時兩種最低k值的被分析物(乙酰苯和丙酰苯)除外。峰高度對于在80％水基體中的較高k值被分析物(庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯)則變惡化。峰高度的降低的原因是高k值被分析物在高度含水樣品基體中的溶解度的減少。矯正的峰面積，它是對于辛酰苯和癸酰苯所負載的樣品的量的量度，是在80％水基體中比所用其它樣品基體降低了10％到60％。為了避免溶解度問題，在接下來的實驗上的試驗APK是在具有至少30％乙腈的基體中制備的。
實施例9
如以上在實施例3中所述來制備分離柱。圖11(a，b，和c)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。該分離溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸銨。栓塞長度是對于在60％乙腈中的5mM乙酸銨的樣品溶液來說的0.2cm(a)；對于用于a的同樣樣品溶液來說的2.74cm(b)，和對于在30％乙腈中5mM乙酸銨的樣品溶液來說的2.74cm(c)。其它條件和峰的鑒別與在實施例7中相同。該梯度條件，如在圖11(c)中所示，顯示改良的拆分和峰形狀。在圖11中所示的在梯度條件下峰高度的改進(c)對于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯分別是36，35，38，41，42，38，32和24倍。所測量的峰高度的％RSD(n＝5)是在0.9％到2.5％范圍。遷移時間的％RSD(n＝5)是在0.3％到0.5％范圍。該程序因此在單個柱中可再現(xiàn)。
實施例10
圖12A，12B和12C是顯示使用本發(fā)明的實施方案的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。栓塞長度是對于在40％乙腈中的5mM乙酸銨的樣品溶液來說的2.74cm(圖12A)；對于在30％乙腈中5mM乙酸銨的樣品溶液來說的2.74cm(圖12B)，和對于與圖12B中相同的樣品溶液來說的5.48cm(圖12C)。該分離溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸銨(圖12A)和在50％乙腈中5mM乙酸銨(圖12B和12C)。其它條件和峰的鑒別與在實施例7中相同。在圖12B中的k值比在圖12A中的高，因為在分離溶液中的水的高百分率。被分析物分子在高百分比的水下更吸引到PSG相上。分配常數(shù)K(在PSG相中溶質(zhì)的摩爾數(shù)除以在分離溶液中溶質(zhì)的摩爾數(shù))，它與k值成正比，隨著提高在分離溶液中水的濃度而增大。在圖12B中，對于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯，和癸酰苯的k值分別是0.29，0.47，0.65，0.92，1.28，1.76，2.37和4.25。為了保持該梯度效應恒定，在分離溶液和樣品基體之間的有機溶劑比率的百分比被保持與圖12A和12B同樣的值。因為仍然未知的原因，在圖12B中的結(jié)果顯示，對于具有較低k值的被分析物(乙酰苯和丙酰苯)，與圖12A相比在峰高度上有輕微的提高。對于其它試驗溶質(zhì)，在峰高度上有一些下降。圖12C說明了對于5.48cm的較長注射栓塞和在分離溶液中較高百分比的水所遇到的情況。峰高度的改進對于乙酰苯，丙酰苯，丁酰苯，戊酰苯，己酰苯，庚酰苯，辛酰苯和癸酰苯分別是31，33，55，44，44，37，29和19倍。與圖11(c)中一樣，峰高度的改進沒有跟隨k，與在非梯度條件中不同。在峰高度上的改進可以與在分離溶液和樣品基體之間的較高百分比的有機溶劑所獲得的那些相當(圖11，c)。應該指出，在圖11中(c)注射栓塞比在圖12C中短兩倍。
實施例11
圖13(a和b)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。栓塞長度是0.22mm(a)和19.5cm(b)。該分離溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸銨。樣品溶液是在60％乙腈中(a)和在36％乙腈中(b)的5mM乙酸銨。樣品濃度是11-53μg/ml(a)和1.1-5.3μg/ml(b)。外加電壓是30kV，和該吸收率是在214nm下檢測。洗脫順序是硫脲(峰1)，萘(峰2)，菲(峰3)，芘(峰4)，和benz(e)acephenanthylene(峰5)。溶劑梯度改進了四種PAH的檢測，如在圖13中所示(b)。在分離溶液中高百分比的乙腈(60％)，更短的PSG長度(10cm)，和高的電場強度(781.3V/cm)用于更快速的分析時間。圖13(a)是在分離溶液中制備的樣品的0.22mm典型注射。圖13(b)是使用梯度的19.5cm注射，其中樣品處于36％乙腈基體中，這在樣品溶液和分離溶液之間提供高百分比的有機溶劑。長于19.5cm的栓塞會引起萘峰的變寬。有益的是應該指出，注射長度長于從進口到檢測器窗口的長度(18.8cm)。在樣品注射過程中實際上觀察到快速洗脫硫脲區(qū)段。硫脲區(qū)段因此是在分離電壓開始時的檢測窗口。對于萘(峰2)，菲(峰3)，芘(峰4)和benz(e)acephenanthylene(峰5)在峰高度上的改進分別是346，437，409和315倍。在圖13中的樣品濃度(b)比在圖13中(a)低10倍。對于萘，菲和芘，以上所述的值是比前面所報導的在非梯度條件下的值分別好了6.9，3.5和3.2倍。
實施例12
圖14(a，b，c，d，和e)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。栓塞長度是0.23mm(a)，7.6cm(b)，22.8cm(c)，45.6cm(d)，和91.2cm(e)。該分離溶液是在60％乙腈中的5mM乙酸銨。樣品溶液是在60％乙腈中(a)和在40％乙腈中(b，c，d和e)的5mM乙酸銨。樣品濃度是9-50μg/ml(a)，0.9-5μg/ml(b，c，d和e)。外加電壓是22kV，和該吸收率是在254nm下檢測。該洗脫順序是硫脲(峰1)，癸酰苯(峰2)，和芘(峰3)。癸酰苯(峰2)和芘(峰3)的峰高度隨著增加栓塞長度而提高。該注射是從0.23mm(a)提高到7.6cm(b)，22.8cm(c)，45.6cm(d)，和91.2cm(e)，這對應于總毛細管長度的0.1％，30％，89％，178％，和356％。多孔基體的高孔隙度或低流動阻力使得有可能以相當容易的方式引入更大長度的樣品溶液。長于91.2cm注射仍然是可能的。然而，它沒有進行，歸因于拆分能力的損失，正如在圖14(e)中所觀察的。在d或e中的電色譜被認為是在CEC中的第一個示范，顯示樣品注射長于總毛細管長度。所注射的樣品的體積也大于1μl。在a和e中獲得的峰高度的對比提示了對于癸酰苯和芘而言在峰高度上分別改進1118倍和1104倍。這些值是通過在CEC中使用簡單的在線預濃縮技術(shù)，對于中性被分析物的最高所報道的敏感性改進。被分析物與多孔基體的強相互作用和多孔基體的固有的快速質(zhì)量轉(zhuǎn)移特性使得可以觀察到此類突出的預濃縮效應。成功的分離已經(jīng)用PSG在250μm i.d.毛細管中實現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。這一工作產(chǎn)生了牽涉到長的栓塞注射的進行半制備性分離的可能性。在μl范圍中的注射體積能夠容易地做到。
實施例13
圖15(a，b，c，d，e，和f)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。栓塞長度是0.1mm(a)和1.8cm(b，c，d，e和f)。注射通過使用壓力來進行，其中注射時間被固定在1.8cm。該分離溶液是與分離溶液相同(a和b)，在20％乙腈中10mM磷酸(c)，在70％乙腈中10mM磷酸(d)，在40％乙腈中的50mM磷酸(e)，在40％乙腈中的0.05mM磷酸(f)。該分離溶液是在40％乙腈中的10mM磷酸。肽濃度是16.7μg/ml每次，外加電壓是12kV，和吸收率檢測是在214nm下進行。洗脫順序是血管舒緩激肽(峰1)，血管緊張素II(峰2)，三肽I(峰3)，三肽II(峰4)，和蛋氨酸腦啡肽(峰5)。雖然可以預期與非梯度條件(圖15，b)相比在梯度條件下峰形狀是更好的(圖15，c)，但是通過使用在樣品基體中更高濃度的乙腈，所獲得的峰形狀是更好的(圖15，d)。在從樣品堆積所形成的圖15(d)中觀察到更好的峰形狀。通過在樣品溶液中使用較高濃度的洗脫溶劑的變寬效果(因為較高濃度的洗脫溶劑所引起的反向梯度效應)沒有觀察到，因為一旦施加電壓之后陽離子肽立刻遷移到分離緩沖液中，因此在到達多孔基體之前肽區(qū)段(zones)早已存在于分離溶液中。樣品堆積也示于圖15(f)中，其中在具有與分離溶液相比更低濃度的緩沖組分和類似百分比的乙腈的基體中制備樣品。在從去堆積形成的圖15(c)中觀察到所不希望有的的峰形狀。去堆積(Destacking)是當被分析物經(jīng)過分開低和高電場強度的區(qū)域的濃度邊界時帶電荷的被分析物的變寬。低的電場區(qū)段是含有更多水的高電導率樣品基體。去堆積也示于圖15(e)中，其中在具有與分離溶液相比更高濃度的緩沖組分和類似百分比的乙腈的基體中制備樣品。
實施例14
圖16(a和b)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。注射是使用0.5psi壓力的0.1mm(a)和在5kV下的15-s(b)。樣品溶液是在40％乙腈中10mM磷酸(a)和在40％乙腈中0.5μm磷酸(b)。肽濃度是16.7μg/ml每一種(a)和167ng/ml每一種(b)。分離電壓是12kV。其它條件與在實施例13中相同。在圖16中的被分析物(b)是比圖16中的那些少濃縮了一百倍。對于血管舒緩激肽(峰1)，血管緊張素II(峰2)，三肽I(峰3)，三肽II(峰4)，和蛋氨酸腦啡肽(峰5)在峰高度上的改進分別是1040，820，810，950和711倍。對于預濃縮程序，峰高度的％RSD(n＝5)是在6.2％-16.2％范圍，而遷移時間的％RSD(n＝5)是在0.7％-1.5％范圍。借助于內(nèi)標物的使用應該改進峰高度的可再現(xiàn)性。通過將樣品溶于低導電率基體(在40％乙腈中0.5μM磷酸)中，隨后在檢測器端使用負電極的電壓進行注射，來進行電場增強的樣品注射。當施加電壓時，低導電率樣品基體借助于電滲流(EOF)進入毛細管，而陽離子肽借助于EOF和電泳流兩者進入柱中。僅僅非常小栓塞的樣品基體被引入，因為分離溶液的低pH顯著地減少EOF，這防止在毛細血管壁上硅烷醇基的解離。在30分鐘之后實際上檢測未保留的中性溶質(zhì)(硫脲)。在被引入柱中的樣品基體區(qū)段中的電場大大高于分離區(qū)段。這一效應引起了進入毛細管的陽離子肽的高電泳速度。高的被分析物電泳速度引起大量的肽被引入，與在水動力學注射中不同，負載的樣品的體積限制了所引入的樣品的量。高的被分析物電泳速度也引起在樣品基體和分離溶液之間的濃度邊界上肽的聚集或預濃縮(樣品堆積)。在動電學注射之前水栓的引入(被建議用于利用動電學注射的樣品堆積中)沒有改進峰高度，因為EOF和被分析物電泳速度的相似方向。進入毛細管的低導電率樣品基體也在注射過程中在毛細管的入口端維持電場的增加。利用在圖16中的條件，在5kV下的最佳動電學注射時間是15秒。比較久的注射導致峰的變寬。在注射之后，利用與在注射中同樣的極性來施加分離電壓(在檢測器側(cè)的負電極)。被分析物運動到陰極和隨后以它們在PSG柱上的保留為基礎再次預濃縮。該方法被認為對陽離子有選擇性，因為陽離子主要被引入毛細管中。所注入的中性物質(zhì)是在未保留的中性標記物和陽離子之后遷移，因為該EOF是非常緩慢的。在所使用的pH下，全部的被分析物是帶陽電荷的或中性。該技術(shù)對于其它陽離子樣品的適用性也是可能的。
實施例15
表2列出了用于制備不同的前體貯備溶液的試劑的類型和體積，其中酸催化劑與前體(甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷)的比率會改變或其中前體與共前體反應(形成混合相PSG整體單段)。
表2
1甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷2雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷3雙(三乙氧基甲硅烷基)辛烷40.12M
改變在反應溶液中前體的濃度或使用用于混合相的形成中的共前體可以改性母體PSG整體單段的化學性質(zhì)。分別從溶液A和J制備的PSG整體單段，PSG-A和PSG-J，僅僅在前體的體積上不同，該前體用于與含有比A更高體積的前體的J反應。在反應中較高體積的前體會導致在毛細管柱中形成致密的整體單段。PSG整體單段，PSG-K，是用前體和作為共前體的雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷來制備。PSG整體單段，PSG-M和PSG-P，是用前體和不同量的作為共前體的雙(三乙氧基甲硅烷基)辛烷制備的。共前體水解和與前體縮合而形成雜化溶膠(混合相)。對于溶液A和J，將合適量的前體添加到100μl的酸催化劑(0.12M HCl)中，和所形成的溶液在室溫下(在黑暗中)攪拌15分鐘。對于K，M和P，將合適體積的前體添加到100μl的0.12M HCl中，隨后添加合適量的雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷；所形成的溶液在室溫下(在黑暗中)攪拌15分鐘。全部這些溶液在兩小時中用于它們的制備。重復類似的程序，利用所添加的光引發(fā)劑來制備甲苯/前體貯備溶液。被添加到甲苯/前體貯備溶液中的光引發(fā)劑的量是10mg光引發(fā)劑/每100μl的甲苯/前體貯備溶液。該毛細管是按照與前面所述的相同的方法來制備和調(diào)理。PSG毛細管柱調(diào)理與前面相同。測定對于烷基苯基酮(APK)和多環(huán)芳族烴(PAH)的兩種試驗混合物而言的整體單段的分離系數(shù)。該分離系數(shù)是色譜系統(tǒng)的被分析物分離能力的量度。分離系數(shù)，α，是由k2/k1導出，其中k是具體的被分析物的保留系數(shù)，以及k2和k1是相鄰被分析物的k值。保留系數(shù)k＝(tR-t0)/t0是按通常方式測定的，其中tR是被分析物保留時間和t0是未保留的標記物的保留時間，對于標記物我們使用硫脲。表3列出了對于萘和芘的各PSG整體單段的分離系數(shù)。
表3 α的值是從PSG-K的2.43變化到PSG-P的2.76，其中PSG-P的分離系數(shù)稍微地高于另一個整體單段的分離系數(shù)。大于1的分離系數(shù)預示著被分析物的成功分離。圖17(a，b，c，d，和e)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。硫脲(T)，萘(N)，菲(PH)和芘(Py)的混合物是在PSG-A(圖17，a)，PSG-K(圖17，b)，PSG-J(圖17，c)，PSG-M(圖17，d)，和PSG-P(圖17，e)。在全部情況下不同被分析物的峰被充分拆分。拆分能力是從以下表達式確定Rs=N4(α-1)αk(k+1)]]>其中N是效率(理論塔板數(shù))，α是分離系數(shù)，和k是具體的被分析物的保留系數(shù)。PSG-A對于萘和芘具有2.43的最低拆分能力，而PSG-J對于相同的兩種被分析物具有4.35的拆分能力。與PSG-A相比更高體積的前體用于PSG-J的制備中可導致整體單段的提高的疏水性。在PSG-J上對于萘和芘的保留系數(shù)分別是0.31和0.79，和這些值反映了整體單段的疏水性的增加。這些值分別代表了55％和54％的提高。共前體，雙(三乙氧基甲硅烷基)辛烷在PSG-M中和雙(三乙氧基甲硅烷基)乙烷在PSG-K和PSG-P中的使用會導致對于萘和芘的拆分能力分別為4.09和9.03，與在母體PSG-A(Rs＝2.43)上的拆分能力相比有了高達73％的提高。萘(0.23)和芘(0.56)的保留系數(shù)兩者對于這三個整體單段而言都比PSG-A高60％，。
實施例16
按照與以上在實施例15中對于整體單段PSG-J所述的那樣來制備分離柱。對于具有15cm長度的多孔基體，萘和芘的保留系數(shù)，分別為kN和kPy，對于用80％甲苯制得的多孔基體分別是0.31和0.79。對于具有10cm長度的類似的多孔基體，kN和kPy分別是0.10和0.24。在長度和kN(r＝0.991)和kPy(r＝0.991)之間有線性關系。15cm，10cm，和5cm多孔基體的分離系數(shù)分別地是2.55，2.52和2.40。因此，對于最短的整體單段長度，保持了高的分離系數(shù)，而被分析物的洗脫時間顯著地減少。降低在毛細管柱中多孔基體的長度會導致試驗被分析物的洗脫時間的減少。降低這一長度具有降低萘和芘的保留系數(shù)的效果。
實施例17
如以上在實施例15中所述來制備分離柱。對于用80％甲苯制得的PSG-A，kN是0.14和kPy是0.36，而對于用73％甲苯制得的PSG-A，kN是0.30和kPy是0.74。對于用80％甲苯和73％甲苯制得的PSG-A來說的分離系數(shù)分別地是2.57(0.1％RSD)和2.47(0.1％RSD)。對于萘和芘，k的值提高了53％和51％，當73％甲苯用于整體單段的制備時。對于PSG-J觀察到類似的趨勢，其中對于用80％甲苯制得的整體單段，kN是0.31和kPy是0.79。當甲苯的濃度從80％下降到73％時，kN(0.49)和kPy(1.23)值提高了37％和36％。用80％甲苯和73％甲苯制得的PSG-J的分離系數(shù)分別地是2.55和2.51。當對比用80％和73％甲苯制得的PSG整體單段時，萘和芘的拆分能力差別較大。當孔隙尺寸減少時，這通過使用較低體積的甲苯來實現(xiàn)，隨著在相同分離溶液條件下的保留和拆分的增加，PSG表面增大。因此，多孔基體的滲透性影響被分析物的保留。
實施例18
單體，甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPTMOS)和硅烷偶聯(lián)管試劑，五氟苯基二甲基氯硅烷(PFPDM)，五氟苯基三乙氧基硅烷(PFP)，3，3，3-三氟丙基三氯硅烷(C3F3)，正辛基二甲基氯硅烷(C8)，(十三氟-1，1，2，2-四氫辛基)二甲基氯-硅烷(CF13)，和正丙基氨基三乙氧基硅烷(NH2)，是從Sigma Aldrich(Milwaukee，WI)或Gelest(Tullytown，PA)商購并以接收的形式使用。光引發(fā)劑，Irgacure1800，是由Ciba(Tarrytown，NY)贈予。全部溶劑屬于從Sigma-Aldrich獲得的光譜級。具有75m內(nèi)徑×365μm外徑的熔凝硅石毛細管是從Polymicro Technologies(Phoenix，AZ)商購的。硫脲，烷基苯基酮，萘，菲，芘，核苷，紫杉酚，紫杉酚衍生物，和肽是從Sigma-Aldrich商購并以接收到的形式使用。全部的電色譜是通過使用裝有UV吸收率檢測器(Beckman Coutler，Inc.，F(xiàn)ullerton，CA)的Beckman P/ACE 2000毛細管電泳(CE)儀器來獲得。裝有六只365nm低壓汞燈管(SpectronicsCorp.，Westbury，NY)的Spectrolinker X1-1500用于光聚合反應。Philips Model 505掃描電子顯微鏡(SEM)用于分析在毛細管柱中多孔基體的物理結(jié)構(gòu)。為此目的，各柱通過使用Denton Vacuum，LLC DeskII Cold Sputter/Etch裝置和碳蒸發(fā)附件(Moorestown，NJ)涂有10nm厚度的金/鈀。用在室溫下攪拌15分鐘的575μl MPTMOS和100μl0.12M HC1的單體貯備溶液制備金屬有機聚合物。通過將60μl的該單體貯備溶液與溶于240μl甲苯中的30mg光引發(fā)劑混合來制備80/20甲苯前體溶液(v/v)。所獲得的溶液在室溫下和在黑暗中攪拌5分鐘。制備了具有從外部除去的聚酰亞胺的5或10cm細條的毛細管柱。毛細管的總長度是25.6cm(從進口到檢測器窗口為18.8cm)。該檢測器窗口，它位于多孔基體之后，通過用發(fā)煙硫酸燒除聚酰亞胺來產(chǎn)生。在硅烷化反應之前用甲苯漂洗的柱中，在80/20金屬有機聚合物上制備結(jié)合相。漂洗的柱然后用硅烷偶聯(lián)劑來處理，利用在手持夾鉗中的注射器所產(chǎn)生的該試劑的凈溶液的連續(xù)流動。在室溫下讓試劑與聚合物的表面反應15，30，60，70，和90分鐘。通過使用注射器用甲苯?jīng)_洗，任何未反應的硅烷偶聯(lián)試劑從結(jié)合相多孔基體中除去。下列結(jié)合相多孔基體是通過這一程序制得PSG-PFP，PSG-PFPDM，PSG-C8，PSG-C3F3，PSG-CF13，和PSG-NH2。PSG毛細管柱被小心地裝入P/ACE盒中。雖然該柱沒有聚酰亞胺的完整涂層，但是它仍然維持優(yōu)良的機械強度。然而，在轉(zhuǎn)移這些毛細管時必須要小心，以防止在安裝到毛細管盒中時發(fā)生破壞。一旦在盒中，毛細管首先使用注射器用分離溶液調(diào)理。在CE儀器中，該柱在20psi下進一步漂洗約2分鐘，隨后在5kV下動電學調(diào)理10分鐘。該柱然后恒溫在20℃。圖18a和18b是母體(即未衍生的)多孔基體(圖18a)和C8-結(jié)合相多孔基體(圖18b)的截面掃描電子顯微照片。毛細管柱的這些截面掃描圖像揭示了1μm直徑的互聯(lián)球形和幾乎球形結(jié)構(gòu)的多孔網(wǎng)絡。兩種結(jié)構(gòu)對于含有一些區(qū)域的較高整體單段密度的結(jié)合相多孔基體是幾乎相同的(在所使用的放大倍數(shù)下)。
實施例19
如以上在實施例18中所述來制備結(jié)合相多孔基體。該烷基苯基酮樣品溶液是用在50mM乙酸銨(pH 6.5)/水/乙腈(1/3/6)的溶液中的1.42μM乙酰苯，25μM丙酰苯，15μM丁酰苯，20μM戊酰苯，5.5μM己酰苯，16.5μM庚酰苯，15.3μM辛酰苯，和3.5μM癸酰苯制得。使用較低體積的乙腈會導致降低樣品的溶解度。分離溶液是1/5/450mM乙酸銨(pH 6.5)/水/乙腈。注射是在1kV下5秒鐘，和分離電壓是20kV。圖19(a，b，c，d，e，和f)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。電色譜是在未衍生的多孔基體(a)，和用C3F3(b)，CF13(c)，PFP(d)，C8(e)，和PFPDM(f)衍生化的多孔基體的PSG毛細管柱上硫脲和烷基苯基酮類的分離。峰是硫脲(峰T)，乙酰苯(峰1)，丙酰苯(峰2)，丁酰苯(峰3)，戊酰苯(峰4)，己酰苯(峰5)，庚酰苯(峰6)，辛酰苯(峰7)，和癸酰苯(峰8)。五種結(jié)合相PSG柱，即PSG-C3F3(b)，PSG-CF13(c)，PSG-PFP(d)，PSG-C8(e)，和PSG-PFPDM(f)，與母體PSG柱(a)的對比揭示了試驗被分析物的增強的拆分，特別地對于更加疏水性的被分析物，其中PSG-PFPDM有最高的增強。拆分能力是從以下表達式確定Rs=N4(α-1)αk(k+1)]]>其中N是效率(理論塔板數(shù))，α是分離系數(shù)，和k是具體的被分析物的保留系數(shù)。該分離系數(shù)α是由k2/k1給出。保留系數(shù)k＝(tR-t0)/t0是按通常方式測定的，其中tR是被分析物保留時間和t0是未保留的標記物的保留時間(對于標記物我們使用硫脲)。乙酰苯(峰1)和己酰苯(峰5)的拆分對于PSG-C3F3，PSG-CF13，PSG-PFP，PSG-C8，和PSG-PFPDM分別地是2.02，2.15，2.64，3.13，和3.71。這一性能是與母體PSG(Rs＝1.86)相比有高達50％的提高。在全部情況下，烷基苯基酮按照增加疏水性的順序被洗脫乙酰苯(峰1)，丙酰苯(峰2)，丁酰苯(峰3)，戊酰苯(峰4)，己酰苯(峰5)，庚酰苯(峰6)，辛酰苯(峰7)，和癸酰苯(峰8)。全部的烷基苯基酮是在較高電場強度(＞1000V/cm)下在30分鐘內(nèi)從結(jié)合相PSG毛細管柱中洗脫。對于母體PSG柱(a)觀察到烷基苯基酮類的最低拆分，而在PSG-PFPDM上對于辛酰苯(在13分鐘之后洗脫)(f)和癸酰苯(在25分鐘之后洗脫)(未顯示)實現(xiàn)了烷基苯基酮類的最高拆分。已經(jīng)報道，以在芳族環(huán)的π電子和在結(jié)合相的氟原子上的孤對電子(在2p軌道中)之間的庫倫相互作用為基礎，氟化的結(jié)合相與芳族化合物相互作用。這一行為不是氟化結(jié)合相，PFP和PFPDM的情況。烷基苯基酮的分離是隨著烷基官能團的碳數(shù)目增加而提高化合物的疏水性所引起的。洗脫順序是按照在這些化合物的疏水性上的這一提高順序。PSG-C8顯示了烷基苯基酮的良好拆分以及全部八種烷基苯基酮的較短分析時間，其中癸酰苯在20分鐘內(nèi)洗脫(e)。PSG-C8對于烷基苯基酮將高拆分與快速洗脫時間相結(jié)合并具有1.76×10-4cm2/Vs的EOF，該值比其它結(jié)合相多孔基體的EOF值高15％，但是與未衍生的多孔基體的EOF值相同。我們沒有觀察該PSG柱的氣泡或干燥，甚至在用于烷基苯基酮的分離中的高電場強度下。該結(jié)合相多孔基體對于高酸性的條件(pH 2-4)比未衍生的多孔基體更加穩(wěn)定。對于結(jié)合相多孔基體中的每一種的電流/電場強度的曲線是直線的(數(shù)據(jù)未顯示)。這一線性提示了焦耳加熱(Joule heating)的不存在，它能夠?qū)е路寮訉?。在每一個分離中，隨著提高k值，烷基苯基酮的效率會下降。引起被分析物慢慢地從多孔基體中洗脫出來的擴散效應可以解釋該低效率。對于15cm長度的結(jié)合相多孔基體能夠?qū)崿F(xiàn)高拆分率，但是需要較長的洗脫時間。在多孔基體的長度和k之間存在線性關系。具有15cm，10cm，和5cm長度的結(jié)合相多孔基體的分離系數(shù)分別地是2.55，2.52和2.40。
實施例20
表4給出了硅烷化反應時間對于保留系數(shù)k，分離系數(shù)α，以及PSG-C8對乙酰苯(1)和己酰苯(5)在5cm PSG-C8整體單段上的拆分率Rs的影響。
表4
該分離系數(shù)作為至多60分鐘的反應時間的函數(shù)來提高，其中0和15分鐘的分離系數(shù)僅僅稍微地不同。大于1的分離系數(shù)預示著被分析物的成功分離。對于70和90分鐘的較長反應時間，該分離系數(shù)會減少。對于增加的反應時間觀察到在乙酰苯和己酰苯的拆分上的相同趨勢。兩種被分析物的拆分率隨著在0-60分鐘范圍的反應時間線性地提高(r＝0.974)。對于以15，30和60分鐘反應時間制備的結(jié)合相PSG柱的柱-到-柱可再現(xiàn)性(n＝3或4)是好于3％RSD。對于70和90分鐘的反應時間減少拆分率。結(jié)合相的塌陷可以解釋對于70和90分鐘的反應時間在拆分率上的下降。隨著硅烷化反應時間增加，使得更多的正辛基二甲基硅烷鍵接于金屬有機聚合物的羥基上，從而增加在聚合物表面上正辛基二甲基基團的數(shù)目。隨著更多的結(jié)合相鍵接于聚合物表面上，配位體彼此更接近。從0到60分鐘反應時間k1和k5值分別地提高了17％和58％的事實顯示聚合物表面變得更加疏水性，即對于烷基苯基酮更加有保持性。
實施例21
圖20(a和b)是使用本發(fā)明的實施方案的顯示吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜。該電色譜是對于30分鐘(a)和90分鐘(b)，在5cm PSG-C8整體單段上五到七種烷基苯基酮的分離。分離條件和峰歸屬與在實施例19中相同。圖20說明了PSG-C8整體單段的0分鐘反應時間(圖20，a)和60分鐘反應時間(圖20，b)對于烷基苯基酮混合物的分離的影響。具有10碳鏈的癸酰苯的k值是極高的。對于30分鐘反應時間k值是23.0而對于60分鐘反應時間k值是28.6，有20％的提高。進行空載測量以分析結(jié)合相在多孔基體上的表面覆蓋度，但是從色譜分析數(shù)據(jù)能夠推斷結(jié)合相在多孔基體上應該有較高的覆蓋度，特別對于反應時間15-60分鐘，和因此有更多數(shù)量的色譜分析位點用于試驗化合物的分離。
實施例22
該核苷樣品混合物由黃嘌呤核苷，尿嘧啶核苷，鳥嘌呤核苷，和胞嘧啶核苷組成，各自在水中的濃度1mg/mL。分離溶液是50mM磷酸鹽(pH8)/水/乙腈(0.5/3.5/6)。注射栓塞長度是0.1mm，和外加電壓是-15kV。按照以上在實施例18中所述來制備10cm PSG-NH2整體單段。10cm長的多孔基體用正丙基氨基三乙氧基硅烷來衍生化。所獲得的整體單段，PSG-NH2，具有胺結(jié)合相(pH 9-10)，它在我們的實驗條件下帶正電荷。正電荷使得EOF發(fā)生反轉(zhuǎn)。雖然具有胺基官能團的色譜分析材料已在正常相和離子交換色譜法找到一些用途，在我們的條件下的PSG-NH2用作反相材料。該烷基苯基酮按照相同的順序洗脫(數(shù)據(jù)未顯示)，與上面描述的其它結(jié)合相多孔基體相比。圖21是顯示了使用本發(fā)明的實施方案的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜圖。這些峰屬于四種核苷，次黃嘌呤核苷(峰1)，尿嘧啶核苷(峰2)，鳥嘌呤核苷(峰3)，和胞嘧啶核苷(峰4)。圖21顯示了四種核苷的混合物用反轉(zhuǎn)EO的分離F。這些混合物的分離在相同的分離溶液中的毛細管區(qū)帶電泳中是不可能的。
實施例23
按照以上在實施例18中所述來制備15cm PSG-PFP整體單段。短鏈肽，血管緊張素，血管舒緩激肽，血管緊張素II，gly-gly-gly，valtyr-val，和蛋氨酸腦啡肽，用作陽離子被分析物。每一種肽的濃度是16g/mL。分離溶液是50mM乙酸銨(pH 4.3)/水/乙腈(1/4/5)。注射是在0.5psi下30秒，和外加電壓是10kV。圖22是顯示了使用本發(fā)明的實施方案的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜圖。這些峰歸屬于五種陽離子肽的分離，血管緊張素(峰1)，血管舒緩激肽(峰2)，血管緊張素II(峰3)，gly-gly-gly(峰4)，val-tyr-val(峰5)，和蛋氨酸腦啡肽(峰6)。圖22說明了PSG-PFPDM柱對于四種帶正電荷的肽的分離的用途，該分離是在低于15分鐘中實現(xiàn)。該陽離子肽是從該柱中洗脫，盡管有整體單段的陰離子屬性。結(jié)合相基本上在整體單段上產(chǎn)生一層以屏蔽該肽中的離子化羥基的負電荷。因此，在陽離子肽和陰離子的整體單段之間電荷相互作用已經(jīng)減弱。
實施例24
按照以上在實施例18中所述來制備15cm PSG-C3Fc整體單段。紫杉酚，漿果赤霉素III，和乙酰基漿果赤霉素各自作為在乙腈中的1mg/mL溶液來制備。分離溶液是50mM乙酸銨(pH 6.5)/水/乙腈(1/4/5)。注射是在0.5psi下5秒，和外加電壓是10kV。圖23是顯示了使用本發(fā)明的實施方案的吸收率/保留時間的曲線的代表性電色譜圖。這些峰是漿果赤霉素III(峰1)，紫杉酚(峰2)，和乙?；鶟{果赤霉素(峰3)。圖23說明這一混合物的完全分離，它是在8分鐘內(nèi)完成。這一分離說明了結(jié)合相PSG柱用于藥物的分析的潛力。盡管上面已經(jīng)參考各種實施方案描述了本發(fā)明，但應該理解的是在不脫離本發(fā)明的范圍的前提下可以作一些變化和改進。以上引用的全部參考文獻以它們的全部內(nèi)容被引入這里供參考。
權(quán)利要求
1.分離柱，包括分離通道；和在通道內(nèi)的分離介質(zhì)，介質(zhì)包括多孔基體，該多孔基體包括載體和靜止相，該載體包括金屬有機光聚合物和該靜止相包括結(jié)合相。
2.權(quán)利要求1的柱，其中該分離介質(zhì)是非熔結(jié)玻璃料。
3.權(quán)利要求1的柱，其中該結(jié)合相包括有機官能團。
4.權(quán)利要求1的柱，其中分離通道具有通道壁，和介質(zhì)附著于通道壁上和并填充該通道的至少一個區(qū)段。
5.權(quán)利要求1的柱，其中多孔基體是均勻的和不包含色譜分析顆粒。
6.權(quán)利要求1的柱，其中光聚合物的前體包括金屬醇鹽。
7.權(quán)利要求6的柱，其中金屬醇鹽包括金屬，和該金屬選自鋁，鋇，銻，鈣，鉻，銅，鉺，鍺，鐵，鉛，鋰，磷，鉀，硅，鉭，錫，鈦，釩，鋅和鋯。
8.權(quán)利要求6的柱，其中金屬醇鹽包括至少一種光活性基團。
9.權(quán)利要求1的柱，其中多孔基體對被分析物有親和性。
10.權(quán)利要求1的柱，其中該分離介質(zhì)包括均勻相。
11.權(quán)利要求1的柱，其中該分離通道是毛細管分離通道或平面結(jié)構(gòu)。
12.在分離柱中制備整體單段的方法，包括提供分離柱；將混合物引入到該柱中，混合物包括金屬有機化合物；輻射該混合物，利用光引發(fā)的聚合反應引起混合物形成固體多孔基體，因此在柱中形成載體；和將偶聯(lián)劑引入到該柱中，因此在柱中形成結(jié)合相多孔基體。
13.權(quán)利要求12的方法，其中引入偶聯(lián)劑包括引入包含官能團的偶聯(lián)劑和金屬。
14.權(quán)利要求13的方法，其中該金屬選自鋁，鋇，銻，鈣，鉻，銅，鉺，鍺，鐵，鉛，鋰，磷，鉀，硅，鉭，錫，鈦，釩，鋅和鋯。
15.權(quán)利要求12的方法，其中引入偶聯(lián)劑包括引入有機偶聯(lián)劑。
16.權(quán)利要求12的方法，其中引入偶聯(lián)劑包括引入選自有機氯硅烷，有機烷氧基硅烷和有機氨基硅烷中的試劑。
17.權(quán)利要求12的方法，其中引入偶聯(lián)劑包括引入具有單官能團，雙官能團或三官能團的試劑。
18.權(quán)利要求12的方法，進一步包括將有機溶劑引入到包含結(jié)合相多孔基體的柱中。
19.權(quán)利要求12的方法，其中多孔基體不包含色譜分析顆粒。
20.權(quán)利要求12的方法，其中分離介質(zhì)是非熔結(jié)玻璃料。
21.權(quán)利要求12的方法，其中混合物包括至少一種金屬有機單體，至少一種孔隙產(chǎn)生劑，和光引發(fā)劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中可控地選擇孔隙產(chǎn)生劑以在基體中形成孔隙。
23.權(quán)利要求22的方法，進一步包括選擇單體與孔隙產(chǎn)生劑的摩爾比率以便在基體中形成孔隙。
24.權(quán)利要求12的方法，其中輻射包括用可見光或紫外光輻射混合物。
25.權(quán)利要求12的方法，進一步包括將有機溶劑引入到柱中，該柱包括固體多孔基體。
26.權(quán)利要求12的方法，其中該提供包括提供毛細管或平面結(jié)構(gòu)。
27.分離被分析物的樣品的方法，包括提供包括分離通道和在該通道內(nèi)的分離介質(zhì)的分離柱，該介質(zhì)包括多孔基體，該多孔基體包括載體和靜止相，該載體包括金屬有機光聚合物和該靜止相包括結(jié)合相；將在溶液中攜帶的被分析物樣品引入通過該柱，其中該介質(zhì)將被分析物濃縮在柱上；和引起該溶液流過該柱，因此分離并洗脫該被分析物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中該引入包括對柱施加電壓或壓力。
29.權(quán)利要求27的方法，其中該引入包括將在第一種溶液中攜帶的被分析物樣品引入通過該柱，和該引起包括引起第二種溶液流過該柱，其中第一種溶液是與第二種溶液相同的溶液。
30.權(quán)利要求27的方法，其中該引入包括將在第一種溶液中攜帶的被分析物樣品引入通過該柱，其中第一種溶液包括洗脫溶劑，和該引起包括引起第二種溶液流過該柱，其中第二種溶液包括洗脫溶劑，和在第一種溶液中的洗脫溶劑的濃度低于在第二種溶液中的洗脫溶劑的濃度。
31.權(quán)利要求30的方法，其中該引入包括引入具有大于柱長度的注射栓塞長度的被分析物樣品。
32.權(quán)利要求27的方法，其中該引入包括引起樣品堆積。
33.權(quán)利要求27的方法，其中該提供包括提供分離介質(zhì)，后者包括沒有色譜分析顆粒的多孔基體。
34.權(quán)利要求27的方法，其中該提供包括提供包括毛細管或平面結(jié)構(gòu)的分離柱。
35.權(quán)利要求27的方法，其中該提供包括提供非熔結(jié)玻璃料型分離介質(zhì)。
全文摘要
提供了分離柱(11)和制造分離柱(11)的方法。該分離柱(11)包括分離通道(13)和在通道(13)中的分離介質(zhì)(15)。分離介質(zhì)(13)包括多孔基體，和多孔基體包括載體和靜止相。該載體包括金屬有機聚合物，如光聚合物，和靜止相包括結(jié)合相。分離介質(zhì)(15)能夠用于分離被分析物的樣品。
文檔編號G01N30/52GK1556729SQ02818548
公開日2004年12月22日 申請日期2002年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月13日
發(fā)明者R·N·扎雷, M·T·杜萊, J·P·奎里諾, B·D·貝內(nèi)特, R N 扎雷, 奎里諾, 杜萊, 貝內(nèi)特 申請人:萊蘭德斯坦福初級大學理事會