專利名稱：用于量化糖化的蛋白質(zhì)的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于定量測定生物樣品中的糖化的蛋白質(zhì)的含量的方法，該生物樣品適合用于比如糖尿病患者用來自行監(jiān)測血糖濃度的反射計。
背景技術(shù)：
控制糖尿病患者的血糖濃度已表明能降低該疾病的慢性的微血管和神經(jīng)性的并發(fā)癥的發(fā)病頻率和嚴(yán)重程度。血液中糖化的血紅蛋白和蛋白質(zhì)的測量可用來測定血糖濃度在一段較長的時間里被控制得如何。
糖化的血紅蛋白的生成速度和血液中葡萄糖的濃度直接相關(guān)。紅血細(xì)胞的平均壽命為120天，因此，血紅蛋白糖化的百分?jǐn)?shù)的定量測定已經(jīng)和前2至3個月的平均葡萄糖濃度的量度相關(guān)聯(lián)，該量度是這一時期血糖控制的量度。(見“糖尿病控制和并發(fā)癥試驗研究組，糖尿病的深度治療對胰島素依賴性糖尿病的慢性并發(fā)癥的發(fā)病進(jìn)程的作用(Diabetes Control andComplications Trial ResearchGroup，The effect of intensive treatment of diabetes on the development ofprogression of long-term complications in insulin-dependent diabetesmellitus)”，New England Jourual of Medicine，329，977-986(1993)，和“美國糖尿病協(xié)會，糖尿病中高血糖癥的試驗(American Diabetes Association，Tests ofGlycemia in Diabees”，Diabetes Care，20(增補(bǔ)本1)，S18-S20(1997))。
葡萄糖也連接到血液中的非血紅蛋白的蛋白質(zhì)上，如白蛋白。因為白蛋白是含量最豐富的血清蛋白質(zhì)，它的循環(huán)壽命是大約20天，所以，糖化的蛋白質(zhì)的濃度是在前2至3周中平均葡萄糖濃度的量度。葡萄糖的量度直接給出測量時的葡萄糖濃度。
已報道一種固定化的二羥基硼基化合物用來與糖化的蛋白質(zhì)的碳水化合物的1，2 順二醇結(jié)合，使它們能與非糖化的蛋白質(zhì)分離。將這一技術(shù)用在柱色譜法中用來測定糖化的百分?jǐn)?shù)已有報道(參見Dean的發(fā)表于1981年5月26日的美國專利號4,269,605和Rosenthal的發(fā)表于1994年2月8日的美國專利號5,284,777)。據(jù)說這些方法使用了固定在柱中的瓊脂糖珠上的硼酸酯衍生物，以將樣品中糖化的蛋白質(zhì)與非糖化的蛋白質(zhì)分離。這些方法需要特殊的稀釋度并將樣品吸移，使得固定在瓊脂糖珠上的親和結(jié)合基的容量不被過載。使用固定在瓊脂糖珠上的硼酸酯衍生物使該技術(shù)不能用于條帶。
Kricka等的在1992年5月5日發(fā)表的美國專利號5,110,745據(jù)說敘述了檢測樣品中的糖化的蛋白質(zhì)的多種方法，其中使樣品與溶液中的確定過量的硼酸酯化合物接觸。據(jù)說未結(jié)合的硼酸酯的測量可通過使其與固定在載體基質(zhì)上的糖化的分子結(jié)合并測量未絡(luò)合的糖化的分子的量而進(jìn)行。該方法看來需要許多步驟，包括在進(jìn)樣到固體載體之前先在溶液中進(jìn)行分開的反應(yīng)，稀釋樣品以確保加入生物樣品中的結(jié)合分子的量是過剩的，進(jìn)行分開的測試以測定蛋白質(zhì)糖化的百分?jǐn)?shù)以及多次結(jié)合和洗滌步驟。
據(jù)說在1989年8月29日授予Waguer的美國專利4,861,728中敘述了一種用于測量糖化的血紅蛋白的尺量法。據(jù)說此方法包括使連接在固體載體上的血紅蛋白結(jié)合劑與事先已和連接有熒光標(biāo)記的二羥基硼基化合物混合的經(jīng)溶解的血液樣品接觸。據(jù)說該載體結(jié)合非糖化的血紅蛋白和熒光標(biāo)記的糖化的血紅蛋白。據(jù)說該熒光標(biāo)記是通過二羥基硼基化合物結(jié)合在糖化的血紅蛋白上的。固相與樣品分離，總血紅蛋白用反射光度學(xué)測量，同時糖化的蛋白質(zhì)用熒光測量。據(jù)說這個方法需要將一定量的熒光標(biāo)記的二羥基硼基試劑加入至樣品中，并且在將它從樣品中分離之后需要一次洗滌步驟。它還需要兩種不同的用來定量的測量方法。
在其它測試中(例如參見日本專利號號6,058,936，歐洲專利號455 255和已出版的PCT申請WO96/03657)，據(jù)說使用了一種偶聯(lián)在可檢測標(biāo)記物(如熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、同位素、酶或其它標(biāo)記物)的硼酸酯衍生物。糖化的和非糖化的蛋白質(zhì)都用一種通用的親和結(jié)合劑(如抗體)結(jié)合在固體載體上。加入硼酸酯一標(biāo)記物絡(luò)合物，測量仍舊與固體載體結(jié)合的標(biāo)記物的量。這些種類的方法每種都需要標(biāo)記糖化的蛋白質(zhì)的額外步驟。此外，為了定量總的和糖化的蛋白質(zhì)，這些測試使用了不同的測量方法。
已出版的PCT申請WO9840750(于1998年9月17日出版)據(jù)說敘述了測定糖化的血紅蛋白的百分?jǐn)?shù)的一種方法，其中用固定化的硼酸酯結(jié)合樣品中糖化的血紅蛋白。據(jù)說結(jié)合的糖苷化的血紅蛋白的量與樣品中糖苷化的血紅蛋白的分?jǐn)?shù)成正比。據(jù)說此方法免除了為了測定糖化的百分?jǐn)?shù)而測量非糖化的血紅蛋白的需要。然而，看來此方法的結(jié)果可能隨因糖苷化的蛋白質(zhì)與硼酸化的載體共溫育的時間而發(fā)生變化。
因此，需要一種簡單、快速并有效的方法來定量測定生物樣品中的糖苷化的蛋白質(zhì)的量，該方法不需要稀釋樣品，只需最少的測定步驟，可以和簡單的檢測儀器(例如手提反射計)聯(lián)合使用，并可用于標(biāo)準(zhǔn)的條帶測試。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于定量測定生物樣品中的糖化的蛋白質(zhì)的方法，使用這些方法的裝置，以及包含這些裝置的試劑盒。
葡萄糖、糖化的蛋白質(zhì)和糖化的血紅蛋白的測量結(jié)果可以提供血糖控制的更完整的圖像。即時葡萄糖濃度的測量可用來調(diào)節(jié)用藥、膳食或鍛煉。對于中期血糖控制的測量，糖化的白蛋白濃度的測量可使人們能夠跟蹤最近的生活方式改變的影響。對于長期的血糖控制的測量，糖化的血紅蛋白濃度的測量使人們能夠監(jiān)測變化的總效果。如果有一種方案一次試驗可以得到所有三個結(jié)果，這將是很方便的。它可被用于醫(yī)生的診室實驗室中，這樣就可以在病人看病的時候和病人討論這些結(jié)果，或者，可由病人在家里使用。目前，血糖可用手提血糖計進(jìn)行日常監(jiān)測且易于使用條帶。但是，類似的用于糖化的蛋白質(zhì)和血紅蛋白的試驗尚不可得。
本發(fā)明方法提供定量測定生物樣品中的糖化的蛋白質(zhì)的方法。使生物樣品在一定條件下與固體載體基質(zhì)接觸，在該條件下糖化的和非糖化的蛋白質(zhì)都結(jié)合到固體載體基質(zhì)上。加入一定量足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)的第一緩沖液。進(jìn)行第一次結(jié)合蛋白質(zhì)的測量以測定總的(糖化的非糖化的)結(jié)合蛋白質(zhì)。將第二緩沖液加入固體載體基質(zhì)，將條件改變?yōu)樘腔牡鞍踪|(zhì)被結(jié)合而非糖化的蛋白質(zhì)基本上不被結(jié)合，并且加入的量要足以洗去未結(jié)合的(非糖化的)蛋白質(zhì)。進(jìn)行第二次結(jié)合蛋白質(zhì)的測量。用第一次和第二次結(jié)合蛋白質(zhì)的測量定量測定糖化的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明一方面涉及定量測定樣品中的糖化的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)使含有帶負(fù)電荷的基團(tuán)和羥基硼基化合物并具有一定的測量區(qū)域的固體載體基質(zhì)與足以覆蓋所述測量區(qū)域的生物樣品接觸；(b)使所述固體載體基質(zhì)與一份足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)的第一緩沖液接觸，其中所述第一緩沖液具有經(jīng)過選擇以使糖化的和非糖化的蛋白質(zhì)都結(jié)合在所述的固體載體基質(zhì)上的pH值；(c)利用對所述蛋白質(zhì)被選性質(zhì)的測量來量化結(jié)合到所述測量區(qū)域的蛋白質(zhì)以得到第一結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)；(d)使所述固體載體基質(zhì)與一份足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)的第二緩沖液接觸，其中所述的第二緩沖液具有經(jīng)過選擇以使糖化的蛋白質(zhì)結(jié)合在所述固體載體基質(zhì)上，而非糖化的蛋白質(zhì)基本上不結(jié)合在所述固體載體基質(zhì)上的pH值；(e)利用對步驟(c)所測性質(zhì)的測量來量化結(jié)合到所述的測量區(qū)域的蛋白質(zhì)以得到第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)；(f)用所述第一和第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)計算糖化的蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。
本發(fā)明的另一方面涉及定量測定樣品中的糖化的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)使含有帶負(fù)電荷的基團(tuán)和羥基硼基化合物并具有一定的測量區(qū)域的固體載體基質(zhì)與足以覆蓋所述測量區(qū)域的生物樣品接觸；(b)使所述固體載體基質(zhì)與一份足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)的第一緩沖液接觸，其中所述第一緩沖液的pH約為5.0-7.0；(c)量化結(jié)合到所述測量區(qū)域的蛋白質(zhì)以得到第一結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)；(d)使所述固體載體基質(zhì)與一份足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)的第二緩沖液接觸，其中所述的第二緩沖液的pH約為8.0-10.0；(e)量化結(jié)合到所述的測量區(qū)域的蛋白質(zhì)以得到第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)；(f)用所述第一結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)和第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)計算所述樣品中糖化的蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。
優(yōu)選，并為了方便，第一和第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)測量相同的性質(zhì)。較好的是，所測性質(zhì)是光學(xué)讀數(shù)。更優(yōu)選的是，光學(xué)讀數(shù)是特定波長的吸收值或反射值。
按照本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，提供了用于定量測定生物樣品中的糖化的血紅蛋白的方法，它包括(a)使該生物樣品與固體載體基質(zhì)接觸，該固體載體基質(zhì)包含帶負(fù)電荷的基團(tuán)和二羥基硼基化合物，并具有一定的測量區(qū)域，進(jìn)樣點(diǎn)與固體載體基質(zhì)相通；(b)在所述進(jìn)樣點(diǎn)加入一份第一緩沖液，其中所述第一緩沖液的pH約為5.0-7.0；(c)在血紅蛋白吸收光的波長下做出所述測量區(qū)域的第一光學(xué)讀數(shù)；(d)在所述進(jìn)樣點(diǎn)加入一份第二緩沖液，其中所述第二緩沖液的pH約為8.0-10.0；(e)在血紅蛋白吸收光的波長下做出所述測量區(qū)域的第二光學(xué)讀數(shù)；(f)用所述的第一和第二光學(xué)讀數(shù)計算所述血液樣品中的糖化的血紅蛋白的百分?jǐn)?shù)。此處生物樣品是包含紅血細(xì)胞的血液樣品，在進(jìn)行第一光學(xué)讀數(shù)之前該樣品先與紅血細(xì)胞溶解試劑接觸。在與固體載體接觸之前血液樣品可用紅血細(xì)胞溶解試劑預(yù)先處理?；蛘?，第一緩沖液還包含紅血細(xì)胞溶解試劑，或在與生物樣品進(jìn)行接觸之前，固體載體基質(zhì)可用紅細(xì)胞溶解試劑進(jìn)行處理。
按照本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，提供了定量測定糖化的非血紅蛋白的方法，包括(a)使生物樣品與和固體載體基質(zhì)相通的進(jìn)樣點(diǎn)進(jìn)行接觸，固體載體基質(zhì)包含帶負(fù)電荷的基團(tuán)和二羥基硼基化合物，并具有一定的測量區(qū)域；(b)在所述進(jìn)樣點(diǎn)加入一份第一緩沖液，其中所述第一緩沖液的pH約為5.0-7.0；(c)在所述蛋白質(zhì)吸收光的波長下做出所述測量區(qū)域的第一光學(xué)讀數(shù)；(d)在所述進(jìn)樣點(diǎn)加入一份第二緩沖液，其中所述第二緩沖液的pH約為8.0-10.0；(e)在所述蛋白質(zhì)吸收光的波長下做出所述測量區(qū)域的第二光學(xué)讀數(shù)；(f)用所述的第一和第二光學(xué)讀數(shù)計算所述生物樣品中的糖化的蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。適用于本發(fā)明該方面的生物樣品包括血漿和血清樣品。用于本發(fā)明這方面的定量測定的適合的糖化的蛋白質(zhì)是白蛋白。對于某些糖化的蛋白質(zhì)的定量，優(yōu)選的是這些蛋白質(zhì)被合適的蛋白質(zhì)特異性標(biāo)記試劑標(biāo)記。
用作第一緩沖液的優(yōu)選的緩沖系統(tǒng)包括MES[2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸，MOPS[3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸和HEPES[N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸]。
用作第二緩沖液的較好的緩沖液包括乙酸銨和?；撬峋彌_液。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了利用上述方法進(jìn)行糖化的蛋白質(zhì)的定量測定的診斷裝置。較好的所述蛋白質(zhì)是血紅蛋白或白蛋白。
另一方面，還提供了試劑盒，它包含上述的診斷裝置，第一緩沖液(pH約5.0-.0)；和第二緩沖液(pH約8.0-10.0)。
定義按照本發(fā)明在本文中的使用，除非另有說明，將下列術(shù)語定義為下列含義術(shù)語“烷基”指飽和脂族基團(tuán)，包括直鏈、支鏈和環(huán)狀(包括多環(huán))基團(tuán)。
術(shù)語“羧酸基”或“羥基”指基團(tuán)-COOH。
術(shù)語“磷酸基”指基團(tuán)-PO4。
術(shù)語“硫酸基”指基團(tuán)-SO4。
術(shù)語“亞磺酸基”指基團(tuán)-SH2H。
術(shù)語“磺?；敝富鶊F(tuán)-SO3H。
“Hb”指血紅蛋白。
“HEPES”指[N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸]“K”，當(dāng)用在測量光吸收或反射的場合時，指吸收系數(shù)。
“MES”指[2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸。
“MOPS”指[3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸。
“S”，當(dāng)用在測量吸收或反射的場合時，指散射系數(shù)。
附圖簡述

圖1是在測試中結(jié)合在固體載體上的糖化的血紅蛋白(實心三角形)和總血紅蛋白(空心三角形)的吸收值對浸泡時間的曲線圖和糖化的血紅蛋白與總血紅蛋白之比(空心圓圈)對浸泡時間的曲線圖。使用了不同的載體，已用硼酸酯衍生化以增加時間長度。
圖2是鍵合的血紅蛋白在415nm的光吸收值對一個糖尿病樣品的血液溶解產(chǎn)物的溫育時間的曲線圖，將單一測量測試(*代表糖化的)與本發(fā)明方法(圓圈代表總Hb，空心三角形代表糖化的Hb)作比較。
圖3是糖化的血紅蛋白或糖化的血紅蛋白部分在415nm的光吸收值對一個糖尿病樣品的血液溶解產(chǎn)物的溫育時間的曲線圖，將單一測量測試(采用已發(fā)表的PCT申請WO98/40705“*”的方法)與本發(fā)明方法(空心三角形)作比較。
圖5是在一定pH范圍內(nèi)結(jié)合在硼酸酯化的載體上的血紅蛋白(實心圓圈)和白蛋白(空心三角)的吸收值曲線圖。
圖6A、6B和6C是三種條帶構(gòu)造，可用于本發(fā)明的方法。
圖7是K/S對糖化的血紅蛋白的百分?jǐn)?shù)(*)的曲線圖，表明在使用本發(fā)明方法的一個條帶測試方案中本發(fā)明的測試結(jié)果與樣品中糖化的血紅蛋白的濃度成正比(空心三角表示總血紅蛋白)。
圖8是糖化的血紅蛋白的K/S分?jǐn)?shù)(糖化的血紅蛋白除以總血紅蛋白)對糖化的血紅蛋白百分?jǐn)?shù)的曲線圖，表明在使用本發(fā)明方法的一個條帶測試方案中該分?jǐn)?shù)與樣品中的糖化的血紅蛋白的濃度成正比。
圖9是總白蛋白(空心三角)和糖化的白蛋白(“*”)在280nm的光吸收值對在樣品中的相對果糖胺含量的曲線圖(與糖化的白蛋白的分?jǐn)?shù)量成正比)。
圖10是糖化的白蛋白與總白蛋白之比(在280nm的吸收值)對樣品中的相對果糖胺含量的曲線圖(與糖化的白蛋白的分?jǐn)?shù)量成正比)。
圖11是結(jié)合的總血紅蛋白(實心三角)和糖化的血紅蛋白(空心三角)在415nm的光吸收值對側(cè)向流動裝置中的總血樣體積的曲線圖。(見圖6A)。
圖12是糖化的血紅蛋白與總血紅蛋白之比對側(cè)向流動裝置中總血樣體積的曲線圖。(見圖6A)。
圖13是血紅蛋白(空心三角)和糖化的血紅蛋白(“*”)在415nm的光吸收值對糖尿病血樣溶解物的稀釋度的曲線圖。
圖15是糖化的血紅蛋白除以總血紅蛋白在415nm的光吸收值對正常的(“*”)和糖尿糖的(空心三角)血樣溶解產(chǎn)物的稀釋度的曲線圖。
圖16A和16B是曲線圖，表明使用本發(fā)明的測試和兩種其它可購得的用于血紅蛋白AlC的測試的全血測試結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)。圖16A是用本發(fā)明的測試(見實施例9)所得的結(jié)果對用RocheIntegra 400(Roche Diagnostics)所得的結(jié)果的曲線。
圖16B是用本發(fā)明測試(見實施例9)所得的結(jié)果對用DCA 2000(Bayer)所得的結(jié)果的曲線。
發(fā)明詳敘本發(fā)明的一個方面是提供生物樣品中的糖化的蛋白蛋的量化的方法，其中樣品和試劑都施加到固體載體基質(zhì)上，所述基質(zhì)優(yōu)選包含帶負(fù)電荷的基團(tuán)和羥基硼基化合物。在固體載體的單一位置進(jìn)行總蛋白質(zhì)和糖化的蛋白質(zhì)的商量。該測量可通過測量蛋白質(zhì)的一種選定的性質(zhì)來方便進(jìn)行。有利的是，此方法不需要測量生物樣品的體積。
本發(fā)明的一個方面涉及樣品中的糖化的蛋白質(zhì)的量化的方法，其中固體載體基質(zhì)(包含帶負(fù)電荷的基團(tuán)和羥基硼基化合物并具有一定的測量區(qū)域)與一份足以覆蓋該測量區(qū)域的生物樣品接觸。然后使固體載體基質(zhì)與第一緩沖液接觸，選擇第一緩沖液的pH使得糖化的和非糖化的蛋白質(zhì)都能結(jié)合在固體載體基質(zhì)上，第一緩沖液的量要足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。結(jié)合在測量區(qū)域上的蛋白質(zhì)的量通過測量蛋白質(zhì)的選定的性質(zhì)來量化，得到第一結(jié)合的蛋白質(zhì)讀數(shù)。然后使固體載體基質(zhì)與第二緩沖液接觸，選擇第二緩沖液的pH使得糖化的蛋白質(zhì)能夠結(jié)合在固體載體基質(zhì)上而非糖化的蛋白質(zhì)基本上不能結(jié)合在固體載體基質(zhì)上，第二緩沖液的量要足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。結(jié)合在測量區(qū)域上的蛋白質(zhì)的量通過測量同一個選定的性質(zhì)(如用來獲得第一結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)一樣)來量化，得到第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)。糖化的蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)用第一和第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)計算。
另一方面，本發(fā)明涉及樣品中的糖化的蛋白質(zhì)的量化的方法，其中固體載體基質(zhì)(包含帶負(fù)電荷的基團(tuán)和羥基硼基化合物，并具有一定的測量區(qū)域)與一份足以覆蓋該測量區(qū)域的生物樣品接觸。然后使固體載體基質(zhì)與第一緩沖液(pH約5.0-7.0)接觸，緩沖液的量要足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。結(jié)合在測量區(qū)域上的蛋白質(zhì)的量被量化，得到第一結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)。然后使固體載體基質(zhì)與第二緩沖液(pH約8.0-10.0)接觸，第二緩沖液的量要足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。將結(jié)合在測量區(qū)域上的蛋白質(zhì)的量量化，得到第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)。生物樣品中的糖化的蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)用第一結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)和第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)計算。
本發(fā)明方法可方便地用來量化糖化的血紅蛋白或糖化的非血紅蛋白(如百蛋白)的量。
在糖化的血紅蛋白的量化中，一般使用血液樣品。在進(jìn)行第一結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)之前，血液樣品先與紅血細(xì)胞溶解試劑接觸?？稍诩拥焦腆w載體上之前使樣品與紅血細(xì)胞溶解試劑接觸(如通過樣品的預(yù)處理)。紅血細(xì)胞溶解試劑也可以通過預(yù)淋洗被加到固體載體上，然后把樣品加入載體?；蛘?，第一緩沖液可以包括紅血細(xì)胞溶解試劑。適合的紅血細(xì)胞溶解試劑在本領(lǐng)域技術(shù)人員中是已知的，包括Triton X-100和Igepal CA-630。
較準(zhǔn)的是，第一和第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)是光學(xué)讀數(shù)。更佳的是，所選擇的被測量性質(zhì)是在特定波長的吸收值或反射值。
按照本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述的固體載體基質(zhì)的二羥基硼基化合物具有下列結(jié)構(gòu) 其中，R選自苯基、取代的苯基、氫和1-6個碳原子的烷基。當(dāng)R為烷基時，合適的烷基包括乙基、1-丙基、和3-甲基-1-丁基。優(yōu)選的R是間氨基苯基。
合適的固體載體基質(zhì)包括選自纖維素、硝基纖維素、乙酸纖繼素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和聚丙烯酰胺的共聚物、瓊脂糖、淀粉、尼龍、尼龍聚酯、葡聚糖、交聯(lián)的葡聚糖、葡聚糖-丙烯酰胺共聚物、交聯(lián)的甲基丙烯酸羥乙酯取代的交聯(lián)聚苯乙烯、聚乙烯醇、羊毛、金屬氧化物、用親水有機(jī)聚合物涂布的多孔陶瓷和玻璃。較佳的是，固體載體基質(zhì)包含帶負(fù)電荷的基團(tuán)。優(yōu)選的固體載體基質(zhì)是纖維素。較佳地，帶負(fù)電荷的基團(tuán)包括磷酸基、硫酸基、磺酸基、亞磺酸基和羧酸基(或羧基)。優(yōu)選的帶負(fù)電荷的基團(tuán)是羧酸基。
I測試按照本發(fā)明方法的一個方面，在一種pH條件下將糖化的和非糖化的蛋白質(zhì)結(jié)合到包含帶負(fù)電荷的基團(tuán)和固定化聽含二羥基硼基化合物的固體載體基質(zhì)上。在結(jié)合之后在第一pH條件下進(jìn)行總蛋白質(zhì)的測量。在第二pH條件下淋洗載體結(jié)合的蛋白質(zhì)絡(luò)合物以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)之后，進(jìn)行糖化的蛋白質(zhì)的測量。從第二次測量相對于第一次測量的百分?jǐn)?shù)計算百分糖化作用。這個測試對于測量血液、血清和血漿樣品中的糖化的血紅蛋白和糖化的蛋白質(zhì)特別有用。
本方法可用于諸如毛細(xì)管血、全血、血清或血漿等生物樣品。按照一個優(yōu)選的方面，可用一個波長進(jìn)行兩個測量(總的和糖化的)。本測試很容易適應(yīng)使用與糖尿病用來自行監(jiān)測血糖相同的血糖計。因為可以在固體載體的同一個位置進(jìn)行兩種測量(見實施例5)，所以載體上不同位置之間的差異不會影響測量結(jié)果。
II固體載體基質(zhì)和固定化的結(jié)合劑固體載體基質(zhì)可以是天然的或合成的聚合物材料之一種，在它們上面可連接帶負(fù)電荷的基團(tuán)和二羥基硼基化合物，樣品和試劑流過該固體載體基質(zhì)。適合的載體基質(zhì)包括，例如，纖維素、尼龍、硝基纖維素、乙酸纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖聚丙烯酰胺共聚物、瓊脂糖、淀粉、尼龍聚酯、葡聚糖、交聯(lián)的葡聚糖、葡聚糖丙烯酰胺共聚物、交聯(lián)的甲基丙烯酸羥乙酯取代的交聯(lián)聚苯乙烯和聚乙烯醇。其它可用于本發(fā)明的載體包括在美國專利號4,269,605中所列出的那些。此外，其它適合的載體在本領(lǐng)域中是已知的。優(yōu)選的固體載體基質(zhì)是纖維素紙。
二羥基硼基化合物(優(yōu)選苯基硼酸、硼酸或其它有機(jī)硼酸，更優(yōu)選間氨基苯基硼酸)可通過機(jī)械的、物理的或化學(xué)的方法，優(yōu)選通過共價化學(xué)鍵與固體載體結(jié)合?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行對固體載體的連接。這種方法包括，例如，列舉在美國專利號4,269,605(授予Dean等，1989年5月26日)中的那些。
在將二羥基硼基化合物連接在載體上之后，載體可用緩沖液或水淋洗。如果待測試的生物樣品含有紅血細(xì)胞，如果該測試是要測量糖化的血紅蛋白，可將洗滌劑或其它紅血細(xì)胞溶解劑包括在淋洗液中。(可用作紅血細(xì)胞溶解劑的)合適的洗滌劑包括T riton X-100。在載體中存在溶解劑可幫助紅血細(xì)胞從全血樣品中溶解出來?；蛘?，樣品可用紅血細(xì)胞溶解劑進(jìn)行預(yù)處理，或者可將紅血細(xì)胞溶解劑包含在第一緩沖液中。
III固體載體基質(zhì)的構(gòu)造按照本發(fā)明的一個方面，固體載體基質(zhì)與其它組件一起被置成條帶狀構(gòu)造以便操作樣品和緩沖液的流動。樣品和緩沖液流過固體載體基質(zhì)，在此發(fā)生結(jié)合，然后流入吸收材料，吸入過剩聽溶液，使適當(dāng)體積的緩沖液流過。溶液流過條帶可延著固體載體基質(zhì)的長度進(jìn)行，如在側(cè)向流動裝置中的那樣，或者通過固體載體的厚度進(jìn)行，如在垂直流動裝置中的那樣(這些條帶的構(gòu)造示于圖6A，6B和6C)。
在固體載體中適用的材料包括，例如，纖維素(包括纖維素紙)，硝基纖維素、乙酸纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖聚丙烯酰胺共聚物、瓊脂糖、淀粉、尼龍、尼龍聚酯、葡聚糖、交聯(lián)的葡聚糖、葡聚糖丙烯酰胺共聚物、交聯(lián)的甲基丙烯酸羥乙酯取代的交聯(lián)的聚苯乙烯、聚乙烯醇、羊毛金屬氧化物、用親水有機(jī)聚合物涂布的多孔陶瓷和玻璃。
IV樣品和優(yōu)選的緩沖液適用于本發(fā)明方法的生物樣品包括全血、血清、和血漿。如果需要，可用本領(lǐng)域已知的方法除去紅血細(xì)胞。方法包括用玻璃纖維(美國專利號4,477,575授予Vogel等，10/16/84)，含碳水化合物的載體(美國專利號4,678,757，授予Rapkin，7/7/87)或含多元醇的基質(zhì)(美國專利號5,725,774，授予Neyer，3/10/98)。
按照一個優(yōu)選的方面(特別是用于非血紅蛋白的糖化的蛋白質(zhì)的量化)，樣品可用蛋白質(zhì)特異性結(jié)合劑(如“染料”)預(yù)處理以標(biāo)記蛋白質(zhì)，這可以幫助它們的濃度的測量。本發(fā)明可以使用各種本領(lǐng)域已知的這種染料。例如，可使用熒光染料如熒光素異硫氰酸酯(“FITC”)。
將樣品加到固體載體上并讓它流過載體。流動可以是通過載體的長度或通過其厚度。加入的樣品的體積可有一定的范圍，即從剛好足夠勻覆蓋測量區(qū)域的體積(如約3-5微升)至在合理的時間內(nèi)會流過載體的體積(約40微升)。實際體積限度取決于固體載體和其它條帶組件的尺寸。較大的(較寬的或較長的)條帶能夠處理較大體積的樣品，但需要較大的最小體積去覆蓋測量區(qū)域。較小的條帶只需小體積，但不能夠處理大體積。
在樣品已被吸收入條帶之后，加入第一緩沖液。第一緩沖液的pH優(yōu)選在約5.0至約7.0之間。更優(yōu)選的，第一緩沖液的pH為約5.5-約7.0(用來糖化的血紅蛋白的量化)和約5.0-約6.5(用于糖化的血紅蛋白的量化)。緩沖液含有適當(dāng)?shù)木彌_劑，它具有合適的PKa用于把PH控制在給定的范圍，但它不會影響蛋白質(zhì)的結(jié)合。適用于第一緩沖液的緩沖劑是本領(lǐng)域已知的。用于第一緩沖液的優(yōu)選的緩沖劑包括MES、MOPS和HEPES。緩沖劑的存在濃度要足以將PH保持在需要的范圍內(nèi)。緩沖劑的適當(dāng)?shù)臐舛葹?mM-500mM。如果生物樣品包括紅血細(xì)胞，緩沖液可還包含細(xì)胞溶解劑，例如Triton X-100或Igepal CA-630。加入的緩沖液的體積可標(biāo)準(zhǔn)化為特定的滴數(shù)，適于洗出過剩的非結(jié)合的樣品。也可以通過反射計來監(jiān)測淋洗是否充分，辦法是進(jìn)行多次測量，最后的一次測量的改變基本上為零。
第二緩沖液優(yōu)選的pH為約8.0-約10.0。第二緩沖液含有適當(dāng)?shù)木彌_劑，其PK適于將pH控制在給定的范圍內(nèi)，但又不影響糖化的蛋白質(zhì)結(jié)合在固定化的二羥基硼酸酯化合物上。適用于第二緩沖液的緩沖劑在本領(lǐng)域是已知的。適用于第二緩沖液的優(yōu)選的緩沖劑包括乙酸銨和?；撬帷＞彌_劑的存在濃度要足以將pH保持在所需的范圍內(nèi)。緩沖劑的適當(dāng)?shù)臐舛葹榧s5mM-500mM，或者，高至緩沖劑的溶解度極限?？扇绲谝痪彌_液一樣監(jiān)測淋洗是否充分。任選地，緩沖液可含有二價金屬離子(如Mg++)，以幫助使蛋白質(zhì)結(jié)合到硼酸酯上穩(wěn)定化。
V.量化在各次淋洗之后結(jié)合在載體上的蛋白質(zhì)的量可用本領(lǐng)域已知的測量方法量化，包括測量在一定波長的光吸收或反射。
按照本方法的優(yōu)選方面，在加入樣品并且過量樣品用第一緩沖液淋洗去之后，進(jìn)行固體載體的第一次反射值測量。該反射值測量用于計算總蛋白質(zhì)濃度，使用從校正的數(shù)據(jù)得到的計算方法，或使用“K/S”值作為與濃度成正比的值。在用第二緩沖液從固體載體洗去非糖化的蛋白質(zhì)之后，進(jìn)行第二反射值測量。該測量和與第一測量相同的方法用來計算糖化的蛋白質(zhì)的濃度。百分糖化的蛋白質(zhì)是作為糖化的蛋白質(zhì)濃度對總蛋白質(zhì)濃度之比×100計算的。
當(dāng)光線進(jìn)入透明的介質(zhì)時，一部份被吸收一部分通過介質(zhì)。比爾定律告訴我們，光線被吸收的量(“A”)是吸收光線的材料的濃度(“c”)和光線通過介質(zhì)的路程(“d”)的乘積(即，A＝ecd，其中e是吸光材料的消光系數(shù))。當(dāng)光進(jìn)入固體時，反射出固體的量是由被固體所吸收的部份和被固體所散射的部份決定的。用來定義這一關(guān)系的模型是KubelKa-Munk理論。該模型定義了二個微分方程來表示當(dāng)光通過固體后光強(qiáng)度的變化和光從固體散射回來后光強(qiáng)度的變化。議程式包括符號“K”(它是在固體中的吸收系數(shù))和符號“S”(它是散射系數(shù))。在簡化的形式中，方程式簡化為下列K/S＝[(1-R)^2]/(2R)，其中R是測得的反射值，K/S正比于吸收/散射材料的濃度。在一些圖中(例如見圖7和8)，用反射計取得的數(shù)據(jù)作為K/S的Y值作圖，它與分析物的濃度成正比。
在本測試中使用的方法學(xué)可改造為用于與葡萄糖測試的手持反射計一起使用的條帶中。
結(jié)合到固體載體上的蛋白質(zhì)的總量是由固定在載體上的帶負(fù)電荷的基團(tuán)的結(jié)合容量控制的。我們觀察到，糖化的和非糖化的蛋白質(zhì)以與在樣品中相同的比例迅速結(jié)合到衍生化的載體上。因為任何過量的樣品都要被淋洗出去，所以無需測量加至載體上的樣品的體積。
報告的百分糖化作用是從在條帶中的固體載體上同一個位置所作的二次測量之比計算的。因此，由不同的條帶結(jié)合的蛋白質(zhì)總量的變化不會影響報告的結(jié)果。因為總的和糖化的蛋白質(zhì)是同相同的方法在固體載體上的相同的位置上測量的，所以影響測量的變量對二次測量有相同的影響，從而使“噪音”最小化。
為了幫助理解，本發(fā)明進(jìn)一步用下列實施例加以說明。這些實施例，由于它們和本發(fā)明有關(guān)，當(dāng)然不應(yīng)被看作具體地限制本發(fā)明。同樣，本發(fā)明的變體，無論是現(xiàn)在已知的或后來發(fā)展的(它們可能在本領(lǐng)域技術(shù)人員的視野范圍之內(nèi))，都認(rèn)為是處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，如在此或在此后所要求的。
實施例實施例1硼酸酯化的固體載體基質(zhì)的制備按照本發(fā)明檢測方法的優(yōu)選方面，適用于條帶構(gòu)造的固體載體基質(zhì)可通過將硼酸酯衍生物，間氨基苯基硼酸酯用常規(guī)的連接化學(xué)共價連接到羧基纖維素基的材料上。
材料1、固體載體基質(zhì)共價連接羧酸基團(tuán)的纖維素基的固體(Sartobind C膜Sartoricus)。
2、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)(Pierce)3、硼酸酯衍生物間氨基硼酸(Sigma-Aldrich)4、緩沖液0.1M MES緩沖液，pH6.5方法將46.7mg間氨基苯基硼酸溶于25ml 100mM MES緩沖液中。在硼酸溶解后鈄pH重新調(diào)節(jié)至6.5。將28.9mg EDC溶于MES-硼酸溶液中。在固體載體基質(zhì)浸在該溶液中一段需要的時間(25ml溶液足夠處理一塊30cm2的基質(zhì))。將基質(zhì)從溶液中取出并在MES緩沖液中漂洗，風(fēng)干。
用在實施例2中敘述的洗脫試驗來測定上述的用不同的浸泡時間制備的硼酸化的固體載體基質(zhì)的結(jié)合特性。所得的總的(空心三角)和糖化的血紅蛋白(實心三角)的結(jié)合表示在圖1?？招膱A圈表示糖化的對總的血紅蛋白的比。
隨著更多的硼酸基團(tuán)被加到固體載體基質(zhì)上，越來越少的羧基留下來用于離子心結(jié)合。糖化的血紅蛋白對總血紅蛋白之比增加，直到存在足夠的硼酸基團(tuán)，這時即使總結(jié)合量降低了，但比值保持不變。
實施例2可變的溫育時間的作用將用實施例1的硼酸化的載體進(jìn)行的單一測量測試(“單一測量法”)與本發(fā)明方法進(jìn)行比較，以確定可變的溫育時間對各方法所得的濃度結(jié)果的影響。
進(jìn)行下列的測試以比較這兩種方法。在單一量法測試中，從非糖尿病個體和糖尿病個體得到的血液溶解樣品用含50mM Mg++的500mM乙酸銨緩沖液(pH＝9.5)作1∶1的稀釋，然后讓樣品與在實施中例1中制備的硼酸化的固體載體基質(zhì)接觸不同的時間段。溫育之后，硼酸化的固體載體用乙酸銨緩沖液(pH＝9)淋洗。糖化的血紅蛋白用含200mM山梨醇的tris緩沖液(pH＝8.0)洗脫。洗脫液的吸收值在415nm測定。
在相應(yīng)于本發(fā)明方法的第二測試中，從非糖尿病個體和糖尿病個體得到的血液溶解樣品用mM MES緩沖液(pH6.5)1∶1稀釋。使樣品與硼酸化的固體載體基質(zhì)以與用于第一測試相同的時間段接觸，并保溫與第一測試相似的時間段。溫育后，棄去稀釋的樣品，用MES緩沖液(pH＝6.5)淋洗硼酸化的固體載體基質(zhì)。然后用500mM含50mM Mg++的乙酸銨緩沖液(pH9.5)第二次淋洗固體載體基質(zhì)。相應(yīng)于非糖化的血紅蛋白，在415nm測量淋洗液的吸收值。從糖尿病患者樣品得到的數(shù)據(jù)提供在表I表I糖尿病血液溶解產(chǎn)物樣品
該數(shù)據(jù)的線性回歸分析清楚地表明，用單一測量法所得的結(jié)果強(qiáng)烈地依賴于溫育時間。然而，當(dāng)使用本發(fā)明方法時，所得結(jié)果與溫育時間無關(guān)，相信這可提供更加可靠的結(jié)果，使得測試更加堅實可靠并適合于經(jīng)訓(xùn)練的使用者。
實施例3pH對結(jié)合的影響緩沖液的pH影響血紅蛋白結(jié)合到硼酸化的載體的量。如果pH低，則糖化的和非糖化的血紅蛋白都被結(jié)合，如果pH高，只有糖化的血紅蛋白會被結(jié)合。圖4表明按照在實施例2所述的測試程序血紅蛋白結(jié)合到羧基纖維素膜上(不存在硼酸基團(tuán))。當(dāng)不存在硼酸時，膜在pH6和7之間失去它的血紅蛋白的離子結(jié)合能力。
圖5表明按實施1所述制備的帶有加入的硼酸基團(tuán)的羧基纖維素載體的血紅蛋白和人血清白蛋白結(jié)合性質(zhì)。由于帶負(fù)電荷的羧基基團(tuán)，蛋白質(zhì)的結(jié)合在較低的pH發(fā)生。由于苯基硼酸而在較高pH結(jié)合的蛋白質(zhì)是樣品中的糖化的蛋白質(zhì)。
實施例4示例性的條帶設(shè)計構(gòu)造的敘述含帶負(fù)電荷的基團(tuán)的硼酸化的固體載體基質(zhì)可被用于任何需要將糖化的蛋白質(zhì)與非糖化的蛋白質(zhì)分離的測試場合。按照本發(fā)明優(yōu)選的測試方法，硼酸化的固體載體基質(zhì)與其它組件結(jié)合使用以定向樣品和緩沖液的流動。這些組件可以是條帶的形狀，可以放入小的手持的反射計用來量化。用于條帶的合適的其它構(gòu)造表示在圖6A、6B和6C。
在側(cè)向流動條帶構(gòu)造中(圖6A)，液體通過硼酸化的載體的長度運(yùn)動(與載體的表面平行)。在垂直流動(圖6B)和組合的條帶構(gòu)造(圖6C)中，液中的運(yùn)動更多是通過固體載體基質(zhì)的厚度(垂直于表面)。
所表示的每種構(gòu)造都有進(jìn)樣位置(1、11或21)，那是在一塊塑料中的一個孔(該塑料為了清楚超見通常是白色的)，(4、14或24)。硼酸化的固體載體(2、12或22)與芯給材料(6、16或26)接觸。在圖6A所示的構(gòu)造中，液體從進(jìn)樣區(qū)(1)流過芯給材料(6)到達(dá)載體(2)，再通過載體流至貯槽(3)。在圖6B和6C所示的構(gòu)造中，液體從進(jìn)樣區(qū)(11或21)和硼酸化的載體(12或22)流至芯給材料(16或26)和貯槽(13或23)。所有的組件都放在底部的一塊塑料的頂部，白色的(15)或透明的(5或25)，取決于構(gòu)造。硼酸化的載體的反射值是通過將一束選定波長的光照射到載體表面上然后測定其強(qiáng)度(7，17或27)。在圖6B和6C表示的構(gòu)造中，有一塊白色的反射材料(18或28)放在載體的后面，將穿過載體的光反射回載體以減少強(qiáng)度的損失。
實施例5測試比例糖化的血紅蛋白測實施例4敘述的和圖6B所示的垂直流動條帶設(shè)計用于正常的和糖尿病的血液樣品的血液溶解物的混合物的測試。將大約8微升血液溶解物放置在按實施例1制備的硼酸化的固體載體基質(zhì)上。然后用約50微升MES緩沖液(pH＝6.5，100mM)淋洗進(jìn)樣點(diǎn)，記錄在430nm的反射值。然后進(jìn)樣點(diǎn)用約50微升乙酸銨緩沖液(500mM，pH＝9.5，含50mM Mg++)淋洗，在進(jìn)樣點(diǎn)在430nm記錄第二反射值。將反射值轉(zhuǎn)換成K/S值，它是與被測量的血紅蛋白的濃度成比例的。數(shù)據(jù)示于下表II(見圖7和8)。
表II
數(shù)據(jù)作用的回歸統(tǒng)計示于下表III。
表III
曲線、Sy.x和得到的C.V.’表明，所測總的和糖化的值各個條帶都不相同。然而，當(dāng)取二個值的比值時，大的偏離降低了，證明使用本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果顯示，計算的糖化的分?jǐn)?shù)值是與樣品中的百分糖化的血紅蛋白或正比的。
術(shù)語CV是偏離系數(shù)，是圍繞平均值的重復(fù)測量的分散性的量度。該系數(shù)是從重復(fù)測量的標(biāo)準(zhǔn)差(“SD”)和平均值(“M”)計算的(即，CV＝100×SD/M)。使用該值的好處是，因為它是以百分?jǐn)?shù)表示的，它可和其它CV值比較而無需知道平均值。
術(shù)語Sy.x是用于線性回歸計算中的變化性的量度。它是在除去“X”的影響之后“Y”的變化性的量度(即，它量度數(shù)據(jù)圍繞回歸線的變化性)。
實施例6測試的比例性糖化的蛋白質(zhì)從非糖尿病個體的血清獲得一份正常的白蛋白樣品。從體外糖化的人血清白蛋白制備高糖化的白蛋白樣品(見美國專利5,589,393，授予Michael D.Fiechtner等，1996年12月31日)。
基于Tietz，Textbook of Clinical Chemistry(臨床化學(xué)教科書)，2ndED.(W.B.Saunders Co.，Carl A.Burtis，Edward Ashwood，編，1994)，986-988頁，用手工的果糖胺測試法測試二個樣品的果糖胺量。發(fā)現(xiàn)高糖化的白蛋白樣品所含的果糖胺濃度為正常白蛋白樣品的5.5倍。按表IV所示的比例將樣品混合在一起(見圖9和10)。得到的樣品按實施例2所述測試，如上記錄A280吸收值。
表IV
以上曲線的回歸統(tǒng)計表示在下表V中。
表V
觀察計算的糖化的白蛋白分?jǐn)?shù)是與果糖胺含量成正比的。如R^2的回歸統(tǒng)計所示的，從低樣品濃度到5.5倍該低濃度，該結(jié)果是成比例的。因此，用來測量糖化的血紅蛋白的測試方法也適用于糖化的白蛋白的測量。
實施例7樣品體積的影響按照實施例5所述的方法，用實施例4所述，圖6A所示的側(cè)向流動條帶模式以不同的樣品體積測試非糖尿病和糖尿病全血，以確定樣品體積對測試的影響。測得的吸收值(415nm)示于表VI中(見圖11和12)。
表VI吸收值(415)
回歸統(tǒng)計示于表VII。
表VII
結(jié)果證明在全血測試中，當(dāng)樣品體積的范圍為約10微升至40微升時，在測試中總血紅蛋白和糖化的血紅蛋白的結(jié)合與樣品的體積無關(guān)。
實施例8總血紅蛋白濃度的變化的影響測試中變化總血紅蛋白量的影響用實施例2所述的測程序測試稀釋的血液樣品來確定。表VIII列出了非糖尿病和糖尿病血液溶解物以2、4、8和16的因子稀釋的測試所得的吸收值(415nm)(見圖13-15)。
表VIII
曲線的回歸統(tǒng)計列于下表區(qū)。
表VIII
結(jié)合在固體載體基質(zhì)上的總血紅蛋白和糖化的血紅蛋白的量隨著總血紅蛋白濃度的降低而減少，然而，如在回歸統(tǒng)中看到的，計算的糖化的血紅蛋白/總血紅蛋白在所有測試的稀釋中是恒定的(即，斜率實際上為零)。這證明了本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)(即，使用二個測定的比來得到與樣品稀釋度或血紅蛋白濃度無關(guān)的結(jié)果。
實施例9與其它商業(yè)測試的比較用示于圖6C，描述于實施例4，并按照實施例5所述的測試方法，測試了二十五個全血樣品。這些樣品也用二種商購的用于血紅蛋白Alc的試驗。
與本發(fā)明方法作比較的商購試驗是1、Roche Integra 400(Roche Diagnostics)按照制造商的說明書，用臺式的多樣品分析儀使用血紅蛋白的B-鏈的糖化的N-端纈氨酸或HbAlc的免疫度計測定進(jìn)行測試。用此方法每個樣品測試一次。
2、DCA 2000(Bayer)按照制造商的說明書，用臺式的單測試分析儀使用HbAlc的免疫濁度計測定進(jìn)行測試。用此測試方法每個樣品測試一次。
結(jié)果作圖在圖16A和16B。結(jié)果顯示，從用來作比較的方法和本發(fā)明的方法所得的結(jié)果是關(guān)聯(lián)的。
權(quán)利要求
1.一種量化樣品中糖化的蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括(a)使含有帶負(fù)電荷的基團(tuán)和羥基硼基化合物并具有一定的測量區(qū)域的固體載體基質(zhì)與足以覆蓋所述測量區(qū)域的生物樣品接觸；(b)使所述固體載體基質(zhì)與一份足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)的第一緩沖液接觸，其中所述第一緩沖液具有經(jīng)過選擇以使糖化的和非糖化的蛋白質(zhì)都結(jié)合在所述的固體載體基質(zhì)上的pH值；(c)利用對所述蛋白質(zhì)被選性質(zhì)的測量來量化結(jié)合到所述測量區(qū)域的蛋白質(zhì)以得到第一結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)；(d)使所述固體載體基質(zhì)與一份足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)的第二緩沖液接觸，其中所述的第二緩沖液具有經(jīng)過選擇以使糖化的蛋白質(zhì)結(jié)合在所述固體載體基質(zhì)上，而非糖化的蛋白質(zhì)基本上不結(jié)合在所述固體載體基質(zhì)上的pH值；(e)利用對步驟(c)所測性質(zhì)的測量來量化結(jié)合到所述的測量區(qū)域的蛋白質(zhì)以得到第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)；(f)用所述第一和第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)計算糖化的蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述被測性質(zhì)是光學(xué)讀數(shù)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述光學(xué)讀數(shù)是特定波長下的吸光度或反光度。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述糖化的蛋白質(zhì)是糖化的血紅蛋白。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述糖化的蛋白質(zhì)是糖化的白蛋白。
6.一種量化生物樣品中糖化的蛋白質(zhì)的量的方法，其特征在于，所述方法包括(a)使含有帶負(fù)電荷的基團(tuán)和羥基硼基化合物并具有一定的測量區(qū)域的固體載體基質(zhì)與足以覆蓋所述測量區(qū)域的生物樣品接觸；(b)使所述固體載體基質(zhì)與一份足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)的第一緩沖液接觸，其中所述第一緩沖液的pH值為5.0-7.0；(c)量化結(jié)合到所述測量區(qū)域的蛋白質(zhì)以得到第一結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)；(d)使所述固體載體基質(zhì)與一份足以洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)的第二緩沖液接觸，其中所述的第二緩沖液的pH值為8.0-10.0；(e)量化結(jié)合到所述的測量區(qū)域的蛋白質(zhì)以得到第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)；(f)用所述第一結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)和第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)計算所述樣品中糖化的蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一和第二結(jié)合蛋白質(zhì)讀數(shù)測量相同的性質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所測性質(zhì)是光學(xué)讀數(shù)
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述光學(xué)讀數(shù)是特定波長下的吸光度或反光度。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述糖化的蛋白質(zhì)是糖化的血紅蛋白。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述糖化的蛋白質(zhì)是糖化的白蛋白。
12.一種量化生物樣品中糖化的血紅蛋白方法，其特征在于，所述方法包括(a)將所述樣品加入與固體載體基質(zhì)相通的進(jìn)樣點(diǎn)，所述固體載體基質(zhì)含有帶負(fù)電荷的基團(tuán)和二羥基硼基化合物并具有一定的測量區(qū)域；(b)在所述進(jìn)樣點(diǎn)加入一份第一緩沖液，其中所述第一緩沖液的pH為5.0-7.0；(c)在血紅蛋白吸收光的波長下做出所述測量區(qū)域的第一光學(xué)讀數(shù)；(d)在所述進(jìn)樣點(diǎn)加入一份第二緩沖液，其中所述第二緩沖液的pH為8.0-10.0；(e)在血紅蛋白吸收光的波長下做出所述測量區(qū)域的第二光學(xué)讀數(shù)；(f)用所述的第一和第二光學(xué)讀數(shù)計算所述血液樣品中的糖化的血紅蛋白的百分?jǐn)?shù)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述二羥基硼基化合物的結(jié)合式為 其中R選自苯基、取代的氫和1-6個碳原子的烷基。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，R選自苯基、間氨基苯基、氫、乙基、1-丙基和2-甲基-1-丁基。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，R是間氨基苯基。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述帶負(fù)電荷的基團(tuán)選自羧酸基、硫酸基、磺酸基、亞磺酸基和磷酸基。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述帶負(fù)電荷的基團(tuán)是羧酸基。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述固體載體基質(zhì)選自纖維素、硝基纖維素、乙酸纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖聚丙烯酰胺共聚物、瓊脂糖、淀粉、尼龍、尼龍聚酯、葡聚糖、交聯(lián)的葡聚糖、葡聚糖丙烯酰胺共聚物、交聯(lián)的甲基丙烯酸羥乙酯取代的交聯(lián)的聚苯乙烯，和聚乙烯醇。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述固體載體基質(zhì)是羧基纖維素。
20.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖液選自MES、MOPS和HEPES。
21.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二緩沖液選自乙酸銨或?；撬帷?br> 22.一種量化生物樣品中非血紅蛋白的糖化的蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括(a)將所述樣品加入與固體載體基質(zhì)相通的進(jìn)樣點(diǎn)，所述固體載體基質(zhì)含有帶負(fù)電荷的基團(tuán)和二羥基硼基化合物并具有一定的測量區(qū)域；(b)在所述進(jìn)樣點(diǎn)加入一份第一緩沖液，其中所述第一緩沖液的pH為5.0-7.0；(c)在所述標(biāo)記試劑吸收光的波長下做出所述測量區(qū)域的第一光學(xué)讀數(shù)；(d)在所述進(jìn)樣點(diǎn)加入一份第二緩沖液，其中所述第二緩沖液的pH為8.0-10.0；(e)在所述標(biāo)記試劑吸收光的波長下做出所述測量區(qū)域的第二光學(xué)讀數(shù)；(f)用所述的第一和第二光學(xué)讀數(shù)計算所述樣品中的糖化的血紅蛋白的百分?jǐn)?shù)。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述二羥基硼基化合物的結(jié)構(gòu)式為 其中R選自苯基、取代的苯基、氫和1-6個碳原子的烷基。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，R選自苯基、間氨基苯基、氫、乙基、1-丙基和2-甲基-1-丁基。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，R是間氨基苯基。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述帶負(fù)電荷的基團(tuán)選自羧酸基、硫酸基、磺酸基、亞磺酸基和磷酸基。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述帶負(fù)電荷的基團(tuán)是羧酸基。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述固體載體基質(zhì)選自纖維素、硝基纖維素、乙酸纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖聚丙烯酰胺共聚物、瓊脂糖、淀粉、尼龍、尼龍聚酯、葡聚糖、交聯(lián)的葡聚糖、葡聚糖丙烯酰胺共聚物、交聯(lián)的甲基丙烯酸羥乙酯取代的交聯(lián)的聚苯乙烯，和聚乙烯醇。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述固體載體基質(zhì)是羧基纖維素。
30.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述第一緩沖液選自MES、MOPS和HEPES。
31.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述第二緩沖液選自乙酸銨或?；撬帷?br> 32.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述樣品被蛋白質(zhì)特異性標(biāo)記試劑標(biāo)記。
33.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述樣品是血清或血漿。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述非血紅蛋白的糖化的蛋白質(zhì)是糖化的白蛋白。
35.用權(quán)利要求1的方法來量化糖化的血紅蛋白的診斷裝置。
36.用權(quán)利要求6的方法來量化糖化的蛋白質(zhì)的診斷裝置。
37.用權(quán)利要求12的方法來量化糖化的蛋白質(zhì)的診斷裝置。
38.用權(quán)利要求22的方法來量化糖化的蛋白質(zhì)的診斷裝置。
39.如權(quán)利要求22所述的診斷裝置，其特征在于，所述糖化的非血紅蛋白的蛋白質(zhì)是白蛋白。
40.一種試劑盒，其特征在于，它含有如權(quán)利要求34-39中任一項所述的診斷裝置、pH為5.0-7.0的第一緩沖液和pH為8.0-10.0的第二緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于量化生物樣品中糖化的蛋白質(zhì)定的方法，所述方法使用固體載體基質(zhì)，在糖化的和非糖化的蛋白質(zhì)都結(jié)合在該載體上的條件下進(jìn)行第一結(jié)合蛋白質(zhì)測量，在糖化的蛋白質(zhì)結(jié)合在該載體上而非糖化的蛋白質(zhì)基本上不結(jié)合的條件下進(jìn)行第二結(jié)合蛋白質(zhì)測量。還提供了包含本發(fā)明方法的診斷裝置和試劑盒。
文檔編號G01N21/25GK1489693SQ02804372
公開日2004年4月14日 申請日期2002年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月31日
發(fā)明者C·E·梅爾頓, R·P·邁克克羅斯基, C E 梅爾頓, 邁克克羅斯基 申請人:斯克利普斯實驗室