專利名稱：生長激素結合蛋白活性測定試劑盒及其配制與測定方法
技術領域：
本發(fā)明是一種測定人和動物血清中的生長激素結合蛋白活性的醫(yī)學指標測定試劑盒及其配制與測定方法。
背景技術：
人和動物血清中的生長激素結合蛋白(growth hormone binding protein，GHBP)對生長激素的分布、代謝和生理活動具有重要作用。GHBP是一個由238～246個氨基酸組成的單鏈蛋白，分子量約61kDa，屬于酸性蛋白質，等電點約5.0。GHBP的主要生理作用是結合垂體產生的生長激素在血中將生長激素運輸?shù)饺斫M織細胞，能使生長激素有效儲存并延長生長激素活性，GHBP還能通過與生長激素以及與生長激素受體結合的增減來調節(jié)生長激素的生理功能。GHBP可以作為肝生長激素受體活性的外周監(jiān)測指標。人血中GHBP的來源與生長激素受體密切相關，GHBP的氨基酸序列與生長激素受體的胞外結構域部分是完全一樣的。測定血清的GHBP活性可以間接反映生長激素功能的發(fā)揮情況，并且反映身體內組織器官的生長激素受體的活性在不同生理、病理條件下的變化情況(測定生長激素受體的活性很復雜，并且取組織器官標本損傷身體；而測定GHBP活性只要取少量血相對無損傷)。
目前GHBP測定方法中，早先有的利用凝膠層析法分離GHBP復合物再測定，此法比較費時煩瑣；現(xiàn)在多利用放射免疫分析法，特別是利用利用放射免疫分析法和活性炭吸收方法結合起來測定GHBP活性。由于測定GHBP活性的方法比較復雜，所以國內有關測定GHBP活性的報道很少，經過檢索文獻只有幾篇相關的報道。這些報道中，張宇瑾、王德芬、史愛生、曹畿生血清生長激素結合蛋白測定方法及其臨床意義，中華內分泌代謝雜志，1994第3期，170～174；這篇論文全文只有一句話簡介他們的測定方法，沒有所用試劑的配制和測定步驟等詳細具體內容。邱寧巖、張靜馨、李慧萍、包蔭堂人血清生長激素結合蛋白活性的快速測定法及其初步臨床應用，標記免疫分析與臨床，1998年第2期，93～96；該論文全文有一句話交代“溫育緩沖液”的配方，另一句話介紹“分離劑”的配方，此外沒有有關所用試劑的配制和測定步驟等詳細具體內容。這些少數(shù)論文提到的測定GHBP活性的方法給一般醫(yī)院和研究單位測定GHBP活性有指導和參考意義，但參考這些方法對具體實施測定操作尚有困難?？傊呒壍臋z測技術人員對測定GHBP活性的技術有所了解，而實施檢測還需要做不少實驗摸索，一般的檢測技術人員無法根據(jù)所檢索到的文獻技術內容予以利用或者直接進行檢測。此外，其他少數(shù)文獻中提到測定人GHBP的內容，但沒有介紹具體方法，一般是采用國外試劑或國外測定GHBP的試劑盒。經過檢索國內一些生物技術公司有測定生長激素結合蛋白的試劑盒供應均為國外產品，沒有測定生長激素結合蛋白活性的試劑盒。
本發(fā)明目的是提供一種醫(yī)學指標測定試劑盒包括其配制與測定方法，能夠在具有放射性計數(shù)儀器的醫(yī)院或實驗室，比較方便測定人和動物血清中的生長激素結合蛋白相對結合活性。

發(fā)明內容
生長激素結合蛋白活性放射免疫分析試劑盒及其配制與測定方法，試劑盒由5份溶劑和一份使用說明書構成。其溶劑分別是標記生長激素(125I-hGH)，未標記生長激素(hGH)，葡聚糖包膜炭(Dextran charcoal)，通用緩沖液(general buffer)，分析緩沖液(testbuffer)。試劑盒也可由3份溶劑和一份使用說明書構成，其溶劑分別是標記生長激素(125I-hGH)，未標記生長激素(hGH)，葡聚糖包膜炭(Dextran charcoal)；而通用緩沖液和分析緩沖液則以使用說明書中列出配方由用戶自己配制。
試劑盒的規(guī)格一般以可測定50個血清樣本為一個包裝，也可以將測定100～200個樣本的規(guī)格為一個包裝。
原理是血清樣品與標記生長激素(125I-hGH)在室溫下共同孵育一段時間，分離出與GHBP結合的125I-hGH和沒有結合的125I-hGH。結合的125I-hGH與總125I-hGH放射性強度比即可反映GHBP的相對值。
5瓶試劑的制造方法如下(1)標記生長激素(125I-hGH)標記方法因氯胺T方法(可參照有關文獻如Davis S.L.Plasma levels of prolactin，growth hormone and insul in in sheep following the infusion of arginine，leucine andphenylalanine.Endocrinology.1972，91773～780)以125I標記人重組生長激素約15秒，特異活性范圍在從90至120μCi/μg。
純化方法采用Biorad AG1×8樹脂(50～100目)層析，除去游離125I。再以1×50cm BiogelP100層析過柱，以PBS(含0.5％BSA)在4℃條件下洗脫，除去凝聚的125I-hGH，得到單體125I-hGH。標記生長激素(125I-hGH)可直接向美國杜邦公司購買，國內有關公司也有供應。一般要求保證送到用戶使用時125I-hGH的比放射性約有60μCi/μg。
(2)未標記生長激素(hGH)沒有標記過的重組人生長激素。技術要求是該未標記生長激素以通用緩沖液稀釋后分加到每個非特異性結合(NSB)試管中時，保持hGH在試管孵育反應溶液中濃度為2μg/ml。一般每個非特異性結合試管中孵育反應溶液總體積為500μl，因此加入每個非特異性結合試管中為1μg的hGH。
(3)葡聚糖包膜炭(Dextran charcoal)2％葡聚糖和2％活性炭溶于PBS。制法先將2％葡聚糖(Dextran)在40～70℃溫度條件下攪拌溶解，待葡聚糖溶解后，加入活性炭(charcoal，50～200目)，室溫下攪拌1～5小時。葡聚糖包膜炭的配制的方法、要求與質量也是分析準確的必要條件。
(4)通用緩沖液(general buffer)PBS(pH 7～7.5)
(5)分析緩沖液(test buffer)PBS含0.5％BSA和75mMgCl2。
該試劑盒要求在4℃條件下保存。
本試劑盒的測定方法設置4～8個總“非特異性結合”(NSB)測定管，目的為使非特異性結合測定計數(shù)平均放射性計數(shù)準確，并且考察加樣操作的準確性；除此總NSB外，每個測定血樣另外特地設置2個對應的“非特異性結合(NSB)”測定管，使測定結果更精確。
該試劑盒組成結構簡單，按照其使用說明書進行操作測定，步驟分明，使用方便，測定結果準確可靠。一般具有放射性計數(shù)儀器的醫(yī)院或實驗室，測定技術人員都可進行測定。
具體實施例方式
下面結合表1和表2與實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明，其中表1是本發(fā)明實施方式步驟的示意，表2是試劑盒使用說明書中必須列出的測定加樣次序和數(shù)量的清單。
測定操作時先用通用buffer稀釋125I-hGH，一邊稀釋一邊取100μl的125I-hGH到放射性計數(shù)儀上測試，直到所稀釋的125I-hGH達到每100μl的計數(shù)約20000cpm為止。
所有各個試管中均加入100μl的125I-hGH。
設置6個總計數(shù)管，目的為使總計數(shù)管平均放射性計數(shù)準確，并且考察加樣操作的準確性。各總計數(shù)管除加100μl125I-hGH外，再加400μl分析buffer，總孵育反應溶液總體積為500μl。
設置6個總“非特異性結合”(NSB)測定管，目的為使非特異性結合測定計數(shù)平均放射性計數(shù)準確，并且考察加樣操作的準確性；這6個非特異性結合測定管各管除加100μl125I-hGH外，加入混合血清(即取自各測定血清等量混合物稱為混合血清)50μl，再加50μl未標記生長激素，加入300μl通用buffer，總孵育反應溶液總體積為500μl。此外，為確保測定的精確性，對每個血清測定樣本還設置2個“非特異性結合”(NSB)測定管，這些對應血清樣本的血清測定樣本NSB各管除加100μl125I-hGH外，加入所測血清50μl，再加50μl未標記生長激素，加入300μl通用buffer，總孵育反應溶液總體積為500μl。具體計算結合活性時，以該2個對應于所測血清樣本的NSB的平均數(shù)為準。
對每個樣品測定管設置為2個同樣的試管(平行管)，以減少加樣和測定的誤差。每測定管中除125I-hGH外，加入所要測定的血清50μl，再加350μl分析buffer，孵育反應溶液總體積為500μl。
所有試管按照加樣清單的程序加完125I-hGH、未標記GH、測試樣本血清、通用buffer或分析buffer等試劑后，各管都要經過強烈混懸，氣溫高時室溫下孵育8小時，氣溫低時室溫下孵育過夜。
將葡聚糖包膜炭(Dextran charcoal)放置在4℃條件下預冷。該懸浮液極容易發(fā)生沉淀，為保證加入到各管中葡聚糖包膜炭的數(shù)量均勻，需要在其加滴到各管的過程中保持該溶液處于不停地搖蕩混懸狀態(tài)。各管加葡聚糖包膜炭溶液500μl。
所有試管加完葡聚糖包膜炭后，經過強烈混懸，進行2000g和4℃條件下離心分離。
對各總計數(shù)管除去上清液，回收沉淀；對各樣品測定管和各非特異性結合測定管回收各自的上清液，除去沉淀。
對總計數(shù)管的沉淀以及各樣品測定管和各非特異性結合測定管各自的上清液進行放射性計數(shù)，每管計數(shù)1分鐘。按照記錄的各管計數(shù)cpm，以下列公式計算各血清樣本的特異性結合活性SB(％)＝[(TB-NSB)/TC]×100％公式中SB＝特異性結合活性TB＝樣品測定管的cpmNSB＝非特異性結合測定管的cpmTC＝總計數(shù)管的cpm
表1 “生長激素結合蛋白活性放射免疫分析試劑盒”實施方式步驟原理

以上各管強烈混懸，氣溫高時室溫下孵育8小時，氣溫低時室溫下孵育過夜

以上各管強烈混懸，2000g 4℃條件下離心

表2 “生長激素結合蛋白活性放射免疫分析試劑盒”操作加樣清單

權利要求
1.一種用于人和動物生長激素結合蛋白活性測定試劑盒，其特征在于，試劑盒構成包括5種配制的溶劑和一份使用說明書，5種特定配制的溶劑是(1)標記生長激素，(2)未標記生長激素，(3)葡聚糖包膜活性炭，(4)分析緩沖液，(5)通用緩沖液。
2.一種用本權利要求1所述的試劑盒測定人和動物生長激素結合蛋白活性的方法，其特征在于除設置4～8個總“非特異性結合”(NSB)測定管外，每個測定血樣另外特地設置2個對應的“非特異性結合(NSB)”測定管。
3.一種對本權利要求1所述的試劑盒中試劑的配制方法，其特征在于“葡聚糖包膜活性炭”溶劑的配制，先將2％葡聚糖(Dextran)在30～70℃條件下攪拌溶解，待葡聚糖溶解后，加入活性炭(charcoal，50～100目)，室溫下攪拌1～5小時。
4.根據(jù)本權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒也可由3份溶劑和一份使用說明書構成。其溶劑分別是標記生長激素、未標記生長激素、葡聚糖包膜炭；而通用緩沖液和分析緩沖液則以使用說明書中列出配方由用戶自己配制。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于人和動物血清中的生長激素結合蛋白活性測定試劑盒及其配制與測定方法。其特征是試劑盒由標記生長激素、未標記生長激素、葡聚糖包膜炭、通用緩沖液和分析緩沖液等5種配制的溶劑和一份使用說明書組成。測定血清中生長激素結合蛋白活性的方法，除設置4～8個總“非特異性結合”(NSB)測定管外，每個測定血樣另外特地設置2個對應的“非特異性結合(NSB)”測定管，使測定結果更精確。葡聚糖包膜炭的配制方法與要求及其質量也是測定準確的必要條件。該試劑盒能夠在具有放射性計數(shù)儀器的醫(yī)院或實驗室，比較方便地測定人和動物血清中的生長激素結合蛋白相對結合活性。
文檔編號G01N33/60GK1502992SQ02154619
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月26日 優(yōu)先權日2002年11月26日
發(fā)明者賀淹才 申請人:華僑大學