專利名稱：半定量快速檢測鹽酸克倫特羅的膠體金試紙條及生產(chǎn)和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬免疫化學(xué)檢測技術(shù)，具體來講，是一種借助膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析反應(yīng)，用以快速檢測動(dòng)物各種組織、尿液、體液及飼料中的鹽酸克倫特羅的殘留物的檢測試紙及其制備使用方法。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅，俗稱“瘦肉精”，商品名為氨哮素，其他的中文名還有鹽酸雙氨醇胺、克喘素、氨哮素、氨必妥、氨雙氯喘通、氨雙氯醇胺，它是腎上腺素類神經(jīng)興奮劑，屬β-興奮劑類激素。豬吃了含有這種藥物的飼料能夠改善養(yǎng)分的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉，特別是骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，抑制脂肪的積累，從而加速動(dòng)物生長速度，提高瘦肉率。一般來說，飼料中添加適量的鹽酸克倫特羅后，可使豬等畜禽生長速度、飼料耗化率、胴體瘦肉率提高10％以上。因此，將這種藥物習(xí)慣上稱作“瘦肉精”。但鹽酸克倫特羅多在動(dòng)物體內(nèi)殘留沉積而不被降解。人吃了含有鹽酸克倫特羅的動(dòng)物產(chǎn)品，往往出現(xiàn)中毒反應(yīng)，出現(xiàn)肌肉震顫、心慌、戰(zhàn)栗、頭疼、惡心、嘔吐等癥狀。特別是對(duì)高血壓、心臟病、甲亢、前列腺肥大等疾病者危險(xiǎn)更大。我國農(nóng)業(yè)部早已明令禁止在飼料和畜牧生產(chǎn)中使用，但由于利益的驅(qū)動(dòng)，鹽酸克倫特羅以致在非法使用。1997年以來，國內(nèi)已發(fā)生百例中毒事件。
目前動(dòng)物防疫、檢疫部門正全力查驗(yàn)該違禁藥物。鹽酸克倫特羅的殘留檢測方法主要有兩種一種是色譜分析，如液相色譜、氣—質(zhì)聯(lián)用色譜等，一種為免疫學(xué)方法，如ELISA。第一種方法需要昂貴的色譜分析儀，并需專業(yè)人士操作，雖然檢測準(zhǔn)確，但檢測周期相當(dāng)長，不能滿足快速檢測需求。ELISA方法也需要采集動(dòng)物組織或尿液送至實(shí)驗(yàn)室，由實(shí)驗(yàn)室操作人員借助酶聯(lián)免疫儀而對(duì)樣品進(jìn)行篩選，從抽樣得到檢測結(jié)果時(shí)間大約為一天。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在建立一種能在現(xiàn)場進(jìn)行快速檢測的試紙條，本方法不僅特異性強(qiáng)，靈敏度高，而且不需要任何的輔助儀器，且檢測時(shí)間僅需5分鐘，滿足了現(xiàn)場快速驗(yàn)放的需求。
本發(fā)明所依據(jù)的原理是通過待檢樣品中的鹽酸克倫特羅與膠體金標(biāo)記的鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶合物和精確定量呈橫條狀分布于免疫層析膜上的鹽酸克倫特羅單克隆抗體發(fā)生競爭性的結(jié)合，通過顯示于免疫層析膜上的條紋數(shù)量，來判定待檢樣品中鹽酸克倫特羅的含量。條紋數(shù)越多，待檢樣品中鹽酸克倫特羅的含量越高。
本檢測試劑條由底板、玻璃纖維紙、免疫層析復(fù)合膜即硝酸纖維膜或醋酸纖維膜、膠體金標(biāo)記的鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶合物、鹽酸克倫特羅克隆抗體及吸水紙組成(見附圖1)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有突出的優(yōu)點(diǎn)和實(shí)用性1.檢測快速檢測時(shí)間只需5分鐘，能夠滿足現(xiàn)場檢測的需要。
2.檢測準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)本反應(yīng)與其他抗生素沒有交叉反應(yīng)，檢測靈敏度能達(dá)到與DLISA基本相同的定量水平。
3.攜帶方便，操作簡便本發(fā)明改變了對(duì)鹽酸克倫特羅殘留的檢測必須由專業(yè)機(jī)構(gòu)的專業(yè)人員才能進(jìn)行檢測的局限性。使各個(gè)豬場、菜市場、各級(jí)檢驗(yàn)檢疫所、出入境檢驗(yàn)以及消費(fèi)者均可即時(shí)進(jìn)行檢驗(yàn)。
4.鹽酸克倫特羅檢測試紙條制備工藝簡單，成本低。
5.檢測試紙條在常溫下即可保存，無需特殊的設(shè)備和儀器。保存期可達(dá)1年，且檢測重復(fù)性好。


附圖1半定量快速檢測鹽酸克倫特羅膠體金檢測試紙條的結(jié)構(gòu)圖。
其中1為底板；2為樣品吸收區(qū)，由3-6層濾紙組成；3為3層玻璃纖維紙；4為免疫層析膜，可以是硝酸纖維膜或醋酸纖維膜；4a為第一條固相化抗鹽酸克倫特羅抗血清；4b為第二條固相化抗鹽酸克倫特羅抗血清；4c為第三條固相化抗鹽酸克倫特羅抗血清；
4d為第四條固相化抗鹽酸克倫特羅抗血清；5為吸水片區(qū)，由3-6層濾紙組成；以下結(jié)合實(shí)例介紹膠體金試紙條的生產(chǎn)方法和使用方法
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一半定量快速檢測鹽酸克倫特羅膠體金試紙條的生產(chǎn)方法1.鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物的制備鹽酸克倫特羅是小分子的有機(jī)物，為半抗原，在免疫動(dòng)物之前必須與致免疫蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，制備成全抗原，才可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)。進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)采用了較為溫和的重氨法、縮合劑法或戊二醛交聯(lián)法中的任何一種偶聯(lián)鹽酸克倫特羅。載體蛋白為牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或鑰孔(KLH或mcKLH)中和任何一種。各種方法與載體的結(jié)合方式包括縮合劑法CBL+mcKLH，CBL+OVA，CBL+BSA戊二醛法CBL+KLH，CBL+OVA，CBL+BSA重氨法CBL+KLH，CBL+OVA，CBL+BSA制備好的偶聯(lián)物必須經(jīng)過嚴(yán)格的純化，以去除游離的鹽酸克倫特羅、游離的致免疫蛋白及其他雜質(zhì)才能使用。以Sephdex G-25柱層析紫外檢測儀檢測，收集第一峰即可。
2.抗鹽酸克倫特羅抗血清的制備取健康的動(dòng)物(羊、兔、豚鼠小白鼠等)作為免疫對(duì)象，將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物和弗氏完全佐劑等體積混合，制成乳化的疫苗，在動(dòng)物的頸、背和足掌等部位多點(diǎn)皮下注射進(jìn)行初次免疫。10-30天后，用弗氏不完全佐劑和所制備的疫苗進(jìn)行等體積混合，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行二次免疫，同時(shí)免疫劑量加大一倍。10-30天后，再用弗氏不完全佐劑制備的疫苗加強(qiáng)免疫后測定血清的效價(jià)，第三次免疫后的第七天用瓊脂雙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)進(jìn)行血清效價(jià)測定，當(dāng)抗原量在0.5-1mg/ml時(shí)，血清效價(jià)≥1∶4-1∶8時(shí)采集動(dòng)物的血液，4℃冰箱過夜，分離血清。血清用40％的飽和硫酸銨沉淀，離心除去上清。用盡可能少的磷酸緩沖液進(jìn)行溶解，透析后用DE-52離子交換樹脂層析分離除去其他血清蛋白而免疫球蛋白IgG，毛細(xì)管電泳顯示為均一產(chǎn)物。
3.鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備將鹽酸克倫特羅—載體蛋白制備完全抗原，免疫小白鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與小白鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交融合，制備雜交瘤細(xì)胞，篩選能夠穩(wěn)定分泌鹽酸克倫特羅單克隆抗體的細(xì)胞株制備抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體并測定單抗的效價(jià)。
4.膠體金標(biāo)記鹽酸克倫特羅—載體偶聯(lián)物的方法分別取半徑為15mm-40mm的膠體金及其相應(yīng)量的鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物，在PH7.2的條件下通過攪拌振蕩使其結(jié)合，加10％的BSA作為穩(wěn)定劑。采用高速離心法除去游離未結(jié)合的鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物及未充分穩(wěn)定的膠體顆粒和其它凝聚物。在離心管底部深紅色沉淀即為膠體金—鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物的復(fù)合物。
5.將金標(biāo)物噴涂于玻璃纖維層用聚乙二醇洗滌膠體金—鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物的復(fù)合物，離心除去上清液，得深紅色沉淀。純化后的沉淀用緩沖液溶解，用噴涂設(shè)備涂于玻璃纖維紙上，真空抽干。
6.免疫層析膜的包被用純化后制備成精確濃度的鹽酸克倫特羅抗體溶液用特制得噴涂設(shè)備于硝酸纖維膜上劃線，線的寬度為1-1.5mm，每條線在0.5cm寬的硝酸纖維膜上的滴加量為20μl。三條抗體線中的抗體溶液濃度按照由下至上的次序依次遞增。第一條包被的抗體剛好與下面的膠體金—鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物的復(fù)合物完全發(fā)生中和。包被好的免疫層析膜用10％BSA溶液噴涂進(jìn)行封閉。
7.試紙條裝備塑料聚乙烯板作為支撐載體，由下及上是由3-5層濾紙組成的樣品吸收區(qū)，其還具有過濾其他大分子雜質(zhì)的作用。然后是由二層玻璃纖維層中間夾有一層吸附了膠體金所標(biāo)記的鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物的玻璃纖維層。其次是硝酸纖維膜，在硝酸纖維膜與塑料聚乙烯板之間為一高分子材料制成的背襯膜，來阻止粘合劑中的有機(jī)溶劑對(duì)硝酸纖維膜上所包被抗體的破壞。最上一層是吸水層，由3-5層濾紙組成，外面用膠帶封住，成為手持部分。各層之間均有1.5mm左右的重疊交叉。
實(shí)施例二膠體金試紙條的使用方法1.對(duì)組織樣品的檢測用A液滴加于少量的瘦肉、肝臟或腎臟上，2分鐘后將檢測試紙插入待檢樣品中，5分鐘后觀察結(jié)果有兩條帶以上者為鹽酸克倫特羅含量陽性既含量＞1ppb，三條帶者含量為1-10ppb，四條色帶者含量為＞200ppb。只有一條帶者為陰性。
2.對(duì)飼料樣品的檢測取少量的飼料，加入裝B液的瓶中，劇烈振蕩后靜置5分鐘，直接用試紙條進(jìn)行檢測，5分鐘后觀測結(jié)果，判斷標(biāo)準(zhǔn)同1。
3.對(duì)尿液樣品的檢測將檢測試紙條插入待檢尿液中，5分鐘后觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)同1。
4.對(duì)陰性樣品的檢測將檢測試紙條插入待檢樣品中，平均5分鐘后觀察結(jié)果，只有一條帶者為陰性。
權(quán)利要求
1.一種半定量快速檢測鹽酸克倫特羅的膠體金試紙條，其特征在于它是由底板、玻璃纖維紙、免疫層析復(fù)合膜，抗原標(biāo)記的膠體金、抗鹽酸克倫特羅血清及吸水紙組成。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于其免疫層析膜為硝酸纖維膜或醋酸纖維膜。
3.半定量快速檢測鹽酸克倫特羅膠體金試紙條的生產(chǎn)方法，其特征在于由下列過程與步驟組成(1)重氮法、縮合劑法或戊二醛交聯(lián)法中的任何一種偶聯(lián)鹽酸克倫特羅與載體蛋白，形成偶聯(lián)物做抗原用；(2)用抗原免疫的小白鼠脾細(xì)胞與小白鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交融合，制備雜交瘤細(xì)胞，篩選能夠穩(wěn)定分泌抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的細(xì)胞株，制備抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體；(3)將膠體金標(biāo)記的鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物均勻噴涂于單位面積的玻璃纖維膜上；(4)將(2)中所述的單克隆抗體固定在單位面積的層析膜上；(5)組裝鹽酸克倫特羅一步法半定量快速檢測試紙條，該檢測試紙自下而上依次包括樣品吸收區(qū)，可溶解的金標(biāo)鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物區(qū)、三條固相化抗鹽酸克倫特羅抗血清區(qū)、吸水片區(qū)等四個(gè)區(qū)。
4.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于半定量一步法膠體金試紙條中鹽酸克倫特羅與載體蛋白偶聯(lián)的方法為縮合劑法CBL+mcKLH，CBL+OVA，CBL+BSA戊二醛法CBL+KLH，CBL+OVA，CBL+BSA重氮法CBL+KLH，CBL+OVA，CBL+BSA
5.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于與鹽酸克倫特羅偶聯(lián)的載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或鑰孔(KLH或mcKLH)。
6.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于金標(biāo)鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物的制備方法為分別取半徑為15nm-40nm的膠體金及相應(yīng)量的鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物，在PH7.2的條件下通過攪拌振蕩使其結(jié)合，加10％的BSA作為穩(wěn)定劑，采用高速離心法除去游離未結(jié)合的鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物及未充分穩(wěn)定的膠體金顆粒和其的凝集物，在離心管底部深紅色沉淀即為膠體金—鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物的復(fù)合物。
7.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于用于半定量一步法膠體金試紙條中抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體在膠體金檢測試紙條的布陣方案固相化抗鹽酸克倫特羅抗血清區(qū)的第一條血清抗體帶與金標(biāo)鹽酸克倫特羅—載體蛋白呈一定的比例關(guān)系，既第一條帶中的抗體剛好與金標(biāo)鹽酸克倫特羅—載體蛋白完全中和，若為陰性樣品，則呈現(xiàn)一條有顏色的條帶，同時(shí)本帶還可作為檢測對(duì)照帶，若沒有一條顏色條帶出現(xiàn)，則說明本檢測試紙條過期而不能用，固相化抗鹽酸克倫特羅抗血清區(qū)的第二、三條血清抗體帶可檢測范圍依次為1ppb、10ppb、200ppb，各血清帶之間間隔為2mm。
8.半定量快速檢測鹽酸克倫特羅膠體金試紙條的使用方法，其特征在于將膠體金試紙條插入檢測樣品中5分鐘后，根據(jù)檢測試紙條上顯示的條帶數(shù)目來判定待檢樣品中鹽酸克倫特羅的含量，兩條帶以上為陽性既含量＞1ppb，三條帶者含量為1-10ppb，四條色帶者含量為＞200ppb，只有一條帶者含量為陰性。
9.據(jù)權(quán)利要求8所述的使用方法，其特征在于檢測組織樣品時(shí)，需用A溶液處理，既將A溶液滴加于少量的瘦肉、肝臟或腎臟上，2分鐘后將檢測試紙插入待檢樣品中檢測，5分鐘后觀測結(jié)果，A溶液含有SDS成份，可充分裂解待檢組織樣品細(xì)胞，使組織中可能殘留的鹽酸克倫特羅充分釋放。
10.據(jù)權(quán)利要求8所述的使用方法，其特征在于檢測飼料樣品時(shí)，需加入裝有B溶液的瓶中，劇烈振蕩后靜置5分鐘，將試紙條插入溶液中進(jìn)行檢測，5分鐘后觀測結(jié)果，B溶液含有吐溫成份，可充分溶解待檢飼料樣品中可能存在的鹽酸克倫特羅。
全文摘要
本發(fā)明涉及一步法半定量快速檢測動(dòng)物產(chǎn)品或飼料中鹽酸克倫特羅的膠體金試紙條及其生產(chǎn)、使用方法。用膠體金標(biāo)記鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶聯(lián)物，均勻噴灑在玻璃纖維紙上，將抗鹽酸克倫特羅—載體蛋白抗血清呈橫條狀多層次固定于層析膜上，使第一條抗體濃度剛好與膠體金所標(biāo)記的載體蛋白偶聯(lián)物完全中和。當(dāng)檢測樣品為陰性時(shí)，檢測試紙條只顯示一條帶，當(dāng)檢測樣品中含有鹽酸克倫特羅時(shí)，顯示出多條帶，條帶越多，則樣品中的鹽酸克倫特羅濃度越高，因此根據(jù)條帶的多少可判定待檢樣品中鹽酸克倫特羅的含量。整個(gè)檢測過程只需5分鐘，準(zhǔn)確率高，抗干擾性強(qiáng)，檢測靈敏度和特異性均達(dá)99％以上。檢測試劑條由底板、濾紙、玻璃纖維紙、硝酸纖維膜等制成。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1403818SQ0213970
公開日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2002年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月22日
發(fā)明者李文平, 何湘蓉 申請(qǐng)人:李文平, 何湘蓉