專利名稱：異硫氰酸苯酯衍生化法測(cè)定微透析樣品中氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異硫氰酸苯酯衍生化法測(cè)定腦內(nèi)微透析樣品中氨基酸的方法，屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
氨基酸作為腦內(nèi)一種很重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與了腦內(nèi)許多生理和病理過程。因此對(duì)在麻醉和清醒動(dòng)物上，在體監(jiān)測(cè)藥理和病理?xiàng)l件下或行為過程中引起的其釋放變化，具有十分重要的意義。但由于透析得到的樣品量少，含遞質(zhì)氨基酸濃度很低，又難以前處理濃集，且大多數(shù)氨基酸無紫外吸收和熒光發(fā)射，為提高分析的檢測(cè)靈敏度通常將其衍生化。迄今為止，對(duì)于其透析樣品的衍生都是采用熒光試劑主要為鄰苯二甲醛(0PA)與2-巰基乙醇連用，在堿性條件下與氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，然后進(jìn)行HPLC熒光或電化學(xué)檢測(cè)。OPA法的主要缺點(diǎn)是二級(jí)氨基酸不能直接反應(yīng)，須經(jīng)氧化后測(cè)定；另外其衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性較差。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的該方法由樣品的采集(即腦內(nèi)微透析術(shù))、樣品的衍生和干燥以及樣品的洗脫(即HPLC分離)等組成。實(shí)驗(yàn)前一周，在動(dòng)物特定部位埋植透析導(dǎo)管。待恢復(fù)后，安裝透析探針，并以一定流速灌流人工腦脊液。灌流速度為1.5μl/min，灌流液的組分(mmol/L)為NaCl147、KCl2.4、CaCl21.2、MgCl21.0、NaHCO35.0、pH7.4。灌流3小時(shí)平衡后每20分鐘收集樣品一次。然后，在樣品中加入10μl 5pmol/μL蛋氨酸砜溶液作為內(nèi)標(biāo)，再干燥液為甲醇∶水∶三乙胺＝2∶2∶1(體積比)，衍生化試劑為甲醇∶異硫氰酸苯酯∶三乙胺∶水＝7∶1∶1∶1(體積比)。樣品真空干燥后加入再干燥液20μl，混勻，再真空干燥。向再干燥后的樣品中加入衍生化試劑40μl，混勻，室溫下放置20分鐘使充分反應(yīng)后真空干燥，干燥后的樣品放入冰箱-21℃冷凍保存。最后樣品經(jīng)反相HPLC洗脫。洗脫液A為含2％乙腈的70mmol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH＝6.38)、洗脫液B為按乙腈∶甲醇∶重蒸餾水＝45∶15∶40(體積比)的比例配制的溶液；流速為1ml/min；色譜柱溫為35℃；檢測(cè)紫外，254nm；檢測(cè)限為1pmol。
本發(fā)明具有簡(jiǎn)便快速、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、分析時(shí)間短、化學(xué)選擇性和分析靈敏度高(可達(dá)1pmol)、一、二級(jí)氨基酸均可檢測(cè)的分析方法，由此可實(shí)現(xiàn)微透析與反相高壓液色譜紫外檢測(cè)技術(shù)結(jié)合對(duì)腦內(nèi)痕量活性物質(zhì)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
圖2為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液經(jīng)異硫氰酸苯酯衍生并于冰箱-21℃冷凍保存6個(gè)月后的色譜分離圖。
圖3為老年沙土鼠海馬微透析樣品經(jīng)異硫氰酸苯酯衍生后的色譜分離圖。
圖4為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對(duì)短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中Asp釋放的影響。
圖5為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對(duì)短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中Glu釋放的影響。
圖6為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對(duì)短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中Gly釋放的影響圖7為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對(duì)短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中β-Ala釋放的影響圖8為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對(duì)短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中Tau釋放的影響圖9為KMBZ-009(10mg/kg)和Aniracetam(100mg/kg)對(duì)短暫性缺血再灌老年沙土鼠海馬微透析樣品中GABA釋放的影響其中Asp代表天門冬氨酸，Glu代表谷氨酸，Gly代表甘氨酸，β-Ala代表β-丙氨酸，Tau代表?；撬?，GABA代表γ-氨基丁酸，In.S.代表內(nèi)標(biāo)。
缺血組與假手術(shù)組比較，++表示p＜0.01，+表示0.01＜p＜0.05。給藥組(KMBZ-009和Aniracetam)與缺血組比較，**表示p＜0.01，*表示0.01＜p＜0.05。
二、樣品的衍生和干燥在收集的樣品中加入10μl 5pmol/μL蛋氨酸砜作內(nèi)標(biāo)，真空冷凍干燥后，加入再干燥液(甲醇∶水∶三乙胺＝2∶2∶1)20μl，混勻，再冷凍干燥。向再干燥后的樣品中加入衍生化試劑(甲醇∶異硫氰酸苯酯∶三乙胺∶水＝7∶1∶1∶1)40μl，混勻，室溫下放置20min使充分反應(yīng)后真空干燥。干燥后的樣品放入冰箱-21℃冷凍保存。樣品測(cè)定時(shí)加入30μl洗脫液A溶解衍生化并干燥后的樣品，取20μl溶液進(jìn)樣。
三、樣品的洗脫色譜柱Hypersil ODS2C18柱[300mm×4.0mm(i.d.)]和保護(hù)柱[20mm×4.0mm(i.d.)]。洗脫液A為含2％乙腈的70mmol/L醋酸鈉緩沖溶液(無水醋酸鈉2.87g溶于500ml重蒸餾水，用冰醋酸調(diào)pH至6.38。經(jīng)孔徑為0.45μm的濾膜過濾后，取濾液490ml，加乙腈10ml，混勻)；洗脫液B為按乙腈∶甲醇∶重蒸餾水＝45∶15∶40(體積比)的比例配制。流速1ml/min。洗脫梯度如下表所示。柱溫35℃，檢測(cè)紫外，254nm。檢測(cè)限為1pmol。
測(cè)定氨基酸含量的洗脫液梯度Time Flow A BCurve(min)(ml/min) (％) (％)0.00 1.00 100 0 69.00 1.00 7525 6
18.00 1.005446 819.00 1.000 100620.00 1.000 100621.00 1.00100 0 630.00 1.00100 0 6結(jié)果由圖可知。采用本法氨基酸的衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，且所需測(cè)定的遞質(zhì)氨基酸和內(nèi)標(biāo)氨基酸在16min內(nèi)基本上都能得到基線分離(見

圖1、圖2和圖3)。對(duì)于短暫性腦缺血再灌沙土鼠海馬遞質(zhì)氨基酸含量的變化及KMBZ-009和Aniracetam的影響，由圖4、圖5、圖6、圖7、圖8和圖9所示，與假手術(shù)組相比，沙土鼠腦缺血再灌10min其海馬部位興奮性和抑制性氨基酸遞質(zhì)均有所升高，其中Asp和Glu的含量升高極顯著(p＜0.01)。再灌30min后各氨基酸基本恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。缺血前1小時(shí)給服KMBZ-009(10mg/kg)或Aniracetam(100mg/kg)后，二者均能顯著地降低由腦缺血再灌所導(dǎo)致的興奮性氨基酸(Glu、Asp)釋放的增加，從而對(duì)缺血再灌所致的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷起保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一種采用異硫氰酸苯酯衍生化法測(cè)定腦內(nèi)微透析樣品中痕量氨基酸的方法，由腦內(nèi)微透析、樣品的衍生和干燥、樣品的洗脫等組成，其特征在于1.1腦內(nèi)微透析過程中灌流液組分為NaCl147、KCl2.4、CaCl21.2、MgCl21.0、NaHCO35.0、pH7.4，組分單位mmol/L，灌流速度為1.5μl/min，灌流3小時(shí)平衡后每20分鐘收集樣品一次；1.2樣品的衍生和干燥過程中向樣品中加入10μl 5pmol/μL蛋氨酸砜溶液作為內(nèi)標(biāo)，再干燥液為甲醇∶水∶三乙胺＝2∶2∶1，衍生化試劑為甲醇∶異硫氰酸苯酯∶三乙胺∶水＝7∶1∶1∶1，樣品真空干燥后加入再干燥液20μl，混勻，再真空干燥，向再干燥后的樣品中加入衍生化試劑40μl，混勻，室溫下放置20分鐘使充分反應(yīng)后真空干燥，干燥后的樣品放入冰箱-21℃冷凍保存；1.3.樣品的洗脫過程中的洗脫液A為含2％乙腈的70mmol/L醋酸鈉緩沖溶液，其pH＝6.38；洗脫液B為乙腈∶甲醇∶重蒸餾水＝45∶15∶40；流速為1ml/min；色譜柱溫為35℃；檢測(cè)紫外，254nm；檢測(cè)限為1pmol。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種異硫氰酸苯酯衍生化法測(cè)定腦內(nèi)透析樣品中氨基酸的方法，屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。該方法由樣品的采集(即腦內(nèi)微透析)、樣品的衍生和干燥以及HPLC分離等組成。實(shí)驗(yàn)前一周，在動(dòng)物特定部位埋植透析導(dǎo)管。待恢復(fù)后，安裝透析探針，并以一定流速灌流人工腦脊液，間隔一定時(shí)間收集一次透析樣品。然后，在樣品中加入一定量的內(nèi)標(biāo)試劑，經(jīng)冷凍干燥、異硫氰酸苯酯衍生、再干燥、稀釋等步驟處理后，樣品經(jīng)反相HPLC洗脫，紫外檢測(cè)。本發(fā)明具有簡(jiǎn)便快速、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、分析時(shí)間短、化學(xué)選擇性和分析靈敏度高(可達(dá)1pmol)、一、二級(jí)氨基酸均可檢測(cè)的分析方法，由此可實(shí)現(xiàn)微透析與反相高壓液色譜紫外檢測(cè)技術(shù)結(jié)合對(duì)腦內(nèi)痕量活性物質(zhì)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1435691SQ0211328
公開日2003年8月13日 申請(qǐng)日期2002年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月26日
發(fā)明者余嗣明, 蔡景霞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所