專利名稱：保護(hù)脫氧核苷-3′-氰乙基-n，n-二異丙基亞磷酰胺的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種保護(hù)脫氧核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺的制備方法。
保護(hù)脫氧核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺(以下簡(jiǎn)稱β-氰乙基亞磷酰胺)是80年代出現(xiàn)的一種新型DNA合成試劑，廣泛用于自動(dòng)或半自動(dòng)的固相法合成寡核苷酸引物、探針或基因。由于β-氰乙基亞磷酰胺在活化劑作用下，反應(yīng)活性和甲基亞磷酰胺幾乎相等，而在DNA合成完畢最終脫保護(hù)基時(shí)前者可以和其它保護(hù)基一起用濃氨水處理脫去，后者則首先需用氣味難聞的硫酚除去。
關(guān)于β-氰乙基亞磷酰胺的制備方法已有文獻(xiàn)報(bào)道，如在期刊Nucleic Acids Research 12(11)，4539，1984，中報(bào)道采用β-氰乙基二異丙胺基亞磷酰氯為磷酰化試劑，反應(yīng)條件難控制、還要用二異丙基乙胺作為除酸劑，產(chǎn)物后處理需要在-78℃條件下操作，條件苛刻，實(shí)用性差。又如在M.J.Gait，Oligonucleotide Synthesis，a practical approach，P.41-45，IRL Press，Oxford，1984，中報(bào)道用甲基-N，N-二異丙胺亞磷酰氯為磷?；噭┲频煤塑占籽趸鶃喠柞０樊a(chǎn)物時(shí)，需用制備色譜或柱層析純化才能得純品，該法難于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。
為此，本發(fā)明目的是尋找一種保護(hù)脫氧核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺新的制備方法，采用易得的磷酰化試劑和適宜的活化劑進(jìn)行磷?；磻?yīng)，產(chǎn)物分離純化的方法簡(jiǎn)易，適宜于大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明β-氰乙基亞磷酰胺的制備是由保護(hù)脫氧核苷采用β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺為磷?；噭┘八倪蚝?或四唑二烷基胺鹽作活化劑在極性溶劑中進(jìn)行磷酰化反應(yīng)而成，最后用乙腈處理得純產(chǎn)物。
本發(fā)明制備方法可用下式表示
B＝腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶;i-Pr＝異丙基保護(hù)脫氧核苷是保護(hù)脫氧腺嘌呤核苷，保護(hù)脫氧鳥嘌呤核苷，保護(hù)脫氧胞嘧啶核苷及保護(hù)脫氧胸腺嘧啶核苷。活化劑中的四唑二烷基胺鹽如四唑二乙胺鹽，四唑二異丙胺鹽及四唑二丙胺鹽等。活化劑中四唑與四唑二烷基胺鹽的克分子比為0-1∶1-0。極性溶劑可以是鹵代烷，如二氯甲烷，三氯甲烷，1，2-二氯乙烷;吡啶類如吡啶，六氫吡啶，2，6-二甲基吡啶;酰胺類如二甲基甲酰胺，二乙基甲酰胺，二甲基乙酰胺等。
本發(fā)明β-氰乙基亞磷酰胺的制備方法是將保護(hù)脫氧核苷，活化劑四唑和/或四唑二烷基胺鹽及極性有機(jī)溶劑放入反應(yīng)瓶中，為一不均相體系，然后滴加入磷?；噭│?氰乙基N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，在室溫下攪拌反應(yīng)1-10小時(shí)，隨著反應(yīng)進(jìn)行不均相體系逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆虻囊合囿w系。用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)。待反應(yīng)完成后，用碳酸氫鈉飽和溶液洗滌，除去無(wú)機(jī)雜質(zhì)及活化劑，再用氯化鈉飽和溶液洗滌，分離出有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥過夜，過濾后抽去溶劑，殘余糖漿狀物用甲苯或二甲苯(對(duì)嘧啶類核苷)或用乙酸甲酯或乙酸乙酯(對(duì)嘌呤類核苷)溶解，攪拌下滴入預(yù)冷的(0～-20℃)正己烷或環(huán)己烷中析出沉淀，過濾，把此沉淀在預(yù)冷的正己烷中研磨成白色粉末，過濾干燥后，再把此白色粉末溶解于無(wú)水乙腈中，過濾去不溶物，真空抽去溶劑乙腈，收集研磨發(fā)泡的白色固體產(chǎn)物，即為β-氰乙基亞磷酰胺。產(chǎn)率可達(dá)60.1-91.3%產(chǎn)物的外觀及物理常數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道值一致。
在反應(yīng)中保護(hù)脫氧核苷，磷?；噭┡c活化劑之用量克分子比是1∶0.8-3∶0.2-1。每毫克分子保護(hù)脫氧核苷需用極性溶劑量為0.5-1毫升。
本發(fā)明制備方法的優(yōu)點(diǎn)是采用容易制得的磷?；噭┘斑m宜的四唑和/或四唑二烷基胺鹽作為活化劑的反應(yīng)體系，能充分有效地使磷?；磻?yīng)完全，并且產(chǎn)物分離純化后處理工藝簡(jiǎn)單，因此本法具有實(shí)用性，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
用以下實(shí)施例來說明本發(fā)明，但本發(fā)明范圍并不限于此。
實(shí)施例1在一反應(yīng)瓶中抽真空通氮，加入21.8克(40毫克分子)保護(hù)脫氧胸腺嘧啶核苷，2.9克(20毫克分子)四唑二乙胺鹽及0.14克四唑(2毫克分子)，及25毫升無(wú)水二氯甲烷，此時(shí)體系為固液非均相。室溫?cái)嚢柘碌渭尤?5克(50毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，反應(yīng)液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液倒入100毫升干氯仿(或干二氯甲烷中)，用碳酸氫鈉飽和溶液洗滌(3×150毫升)上述氯仿溶液，再用氯化鈉飽和溶液洗滌(3×150毫升)，分離出有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥過夜，過濾，室溫下減壓濃縮抽去溶劑，殘余糖漿狀物用80毫升甲苯溶解，攪拌下滴入預(yù)冷的(0～20℃)的正己烷中析出沉淀，過濾，將此沉淀再次用80毫升甲苯溶解，攪拌滴入預(yù)冷的正己烷中析出沉淀，將收集的沉淀物在預(yù)冷的正己烷中研磨成粉末，在充滿氮?dú)獾母稍锵渲羞^濾收集該白色粉末，再真空干燥5小時(shí)，然后用無(wú)水乙腈100毫升溶解干白色粉末，在氮?dú)飧稍锵渲羞^濾去掉不溶物，再真空抽去乙腈，產(chǎn)物發(fā)泡成白色片狀，研磨，再真空干燥得純產(chǎn)物保護(hù)脫氧胸腺嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺26克，產(chǎn)率為87.3%。
實(shí)施例2在一反應(yīng)瓶中抽真空通氮，加入25.3克(40毫克分子)保護(hù)脫氧胞嘧啶核苷，2.9克(20毫克分子)四唑二乙胺鹽和1.7克(24毫克分子)四唑及40毫升無(wú)水吡啶，此時(shí)體系為固液非均相。室溫?cái)嚢柘碌渭尤?8克(60毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，反應(yīng)液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，后處理同實(shí)施例1，得純產(chǎn)物保護(hù)脫氧胞嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺26.8克，產(chǎn)率為80.5%。
實(shí)施例3在一反應(yīng)瓶中抽真空通氮，加入21.8克(40毫克分子)保護(hù)脫氧胸腺嘧啶核苷，2.8克(16毫克分子)四唑二丙胺鹽和0.56克(8毫克分子)四唑及30毫升二乙基甲酰胺，此時(shí)體系為固液非均相。室溫?cái)嚢柘碌渭尤?2克(40毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6小時(shí)，反應(yīng)液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，后處理同實(shí)施例1，得純產(chǎn)物保護(hù)脫氧胸腺嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺18.2克，產(chǎn)率為61.2%。
實(shí)施例4在一反應(yīng)瓶中抽真空通氮，加入25.3克(40毫克分子)保護(hù)脫氧胞嘧啶核苷，2.7克(19.2毫克分子)四唑二乙胺鹽和0.14克(2毫克分子)四唑及20毫升氯仿，此時(shí)體系為固液非均相。室溫?cái)嚢柘碌渭尤?4.5克(48毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)5小時(shí)，反應(yīng)液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，后處理同實(shí)施例1，但甲苯溶解改為二甲苯溶解，得純產(chǎn)物保護(hù)脫氧胞嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺30.2克，產(chǎn)率為90.5%。
實(shí)施例5在一反應(yīng)瓶中抽真空通氮，加入26.3克(40毫克分子)保護(hù)脫氧腺嘌呤核苷，3克(18毫克分子)四唑二乙丙胺鹽和0.14克(2毫克分子)四唑及40毫升無(wú)水二甲基乙酰胺，此時(shí)體系為固液非均相。室溫?cái)嚢柘碌渭尤?4克(80毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10小時(shí)，反應(yīng)液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，后處理同實(shí)施例1，但甲苯溶解改為乙酸乙酯溶解，預(yù)冷的正己烷改成預(yù)冷的環(huán)己烷，得純產(chǎn)物保護(hù)脫氧腺嘌呤核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺25.8克，產(chǎn)率為75.2%。
實(shí)施例6在一反應(yīng)瓶中抽真空通氮，加入25.6克(40毫克分子)保護(hù)脫氧鳥嘌呤核苷，3.4克(20毫克分子)四唑二丙胺鹽及35毫升無(wú)水1，2二氯乙烷，此時(shí)體系為固液非均相。室溫?cái)嚢柘碌渭尤?6克(120毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)，反應(yīng)液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，后處理同實(shí)施例1，但甲苯溶解改為乙酸甲酯溶解，得純產(chǎn)物保護(hù)脫氧鳥嘌呤核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺27.9克，產(chǎn)率為83.1%。
實(shí)施例7在一反應(yīng)瓶中抽真空通氮，加入26.3克(40毫克分子)保護(hù)脫氧腺嘌呤核苷，0.57克(4毫克分子)四唑二乙胺鹽和1.1克(16毫克分子)四唑及30毫升無(wú)水六氫吡啶，此時(shí)體系為固液非均相。室溫?cái)嚢柘碌渭尤?.6克(32毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，反應(yīng)液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，后處理同實(shí)施例1，但甲苯溶解改為乙酸甲酯溶解，預(yù)冷的正己烷改為預(yù)冷的環(huán)己環(huán)，得純產(chǎn)物保護(hù)脫氧腺嘌呤核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺16.6克，產(chǎn)率為60.5%。
實(shí)施例8在一反應(yīng)瓶中抽真空通氮，加入25.6克(40毫克分子)保護(hù)脫氧鳥嘌呤核苷，1.7克(24毫克分子)四唑及30毫升無(wú)水二甲基甲酰胺，此時(shí)體系為固液非均相。室溫?cái)嚢柘碌渭尤?4.4克(48毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8小時(shí)，反應(yīng)液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，后處理同實(shí)施例1，但甲苯溶解改為乙酸乙酯溶解，得純產(chǎn)物保護(hù)脫氧鳥嘌呤核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺20.2克，產(chǎn)率為60.1%。
實(shí)施例9在一反應(yīng)瓶中抽真空通氮，加入21.8克(40毫克分子)保護(hù)脫氧胸腺嘌呤核苷，4.8克(28毫克分子)四唑二異丙胺和0.84克(12毫克分子)四唑，及40毫升無(wú)水2.6-二甲基吡啶，此時(shí)體系為固液非均相。室溫?cái)嚢柘碌渭尤?4克(80毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)5小時(shí)，反應(yīng)液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，后處理同實(shí)施例1，得純產(chǎn)物保護(hù)脫氧胸腺嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺20.9克，產(chǎn)率為70.2%。
實(shí)施例10在一反應(yīng)瓶中抽真空通氮，加入21.8克(40毫克分子)保護(hù)脫氧胸腺嘌呤核苷，3.4克(20毫克分子)四唑二丙胺和0.14克(2毫克分子)四唑，及30毫升無(wú)水二氯甲烷，此時(shí)體系為固液非均相。室溫?cái)嚢柘碌渭尤?4.4克(48毫克分子)β-氰乙基-N，N，N’，N’-四異丙基亞磷酰二胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)5小時(shí)，反應(yīng)液逐漸變成均勻的液相，用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，后處理同實(shí)施例1，得純產(chǎn)物保護(hù)脫氧胸腺嘧啶核苷-3’-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺27.2克，產(chǎn)率為91.3%。
權(quán)利要求
1.一種用磷?；磻?yīng)制備保護(hù)脫氧核苷-3′-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺的方法，其特征在于是由保護(hù)脫氧核苷采用β-氰乙基-N，N，N′，N′-四異丙基亞磷酰二胺為磷?；噭┘八倪蚝?或四唑二烷基胺鹽作活化劑在極性溶劑中于室溫下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)中保護(hù)脫氧核苷，磷?；噭┡c活化劑用量的克分子比為1∶0.8-3∶0.2-1，活化劑中四唑與四唑二胺基胺鹽的克分子比為0-1∶1-0，反應(yīng)時(shí)間是1-10小時(shí)。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于保護(hù)脫氧核苷是保護(hù)脫氧腺嘌呤核苷，保護(hù)脫氧鳥嘌呤核苷，保護(hù)脫氧胞嘧啶核苷及保護(hù)脫氧胸腺嘧啶核苷。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于活化劑中四唑二烷基胺鹽是四唑二乙胺鹽，四唑二丙胺鹽及四唑二異丙胺鹽。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于極性溶劑可以是鹵代烷如二氯甲烷，三氯甲烷，1，2-二氯乙烷;吡啶類如吡啶，六氫吡啶，2，6-二甲基吡啶;酰胺類如二甲基甲酰胺，二乙基甲酰胺，二甲基乙酰胺。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于上述反應(yīng)后，最后用乙腈處理得純產(chǎn)物。
全文摘要
一種保護(hù)脫氧核苷-3′-氰乙基-N，N-二異丙基亞磷酰胺是由保護(hù)脫氧核苷采用β-氰乙基-N，N，N′，N′，-四異丙基亞磷酰二胺為磷?；噭┘八倪蚝?或四唑二烷基胺鹽作活化劑在極性溶劑中進(jìn)行磷?；磻?yīng)而成，產(chǎn)物分離純化的后處理工藝簡(jiǎn)單。因此本法具有實(shí)用性，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H19/073GK1072414SQ9210863
公開日1993年5月26日 申請(qǐng)日期1992年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月17日
發(fā)明者蔣飛龍 申請(qǐng)人:蔣飛龍