專利名稱：免疫傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于進行免疫測定的裝置和方法。所述裝置包括一次性免疫傳感器。
背景技術(shù)：
生物醫(yī)學(xué)傳感器被用于報道多種分析物的存在和/或濃度。當(dāng)所述分析物是蛋白時，所使用的傳感元件通常是抗體，因為所述抗體與所述蛋白(抗原)的相互作用是非常特異的。這種類型的免疫測定通常被劃分成兩類獲得“是/否答案”，例如，通過簡單的視覺檢測，或者通過定量方法測定抗原的濃度。大多數(shù)定量方法涉及昂貴的設(shè)備部件，如閃爍計數(shù)器(用于監(jiān)測放射性)、分光光度計、分光熒光計(例如，參見US5156972)、和表面等離子體共振儀(例如參見US5965456)等。因此，如果能開發(fā)出一種適合家庭或野外使用的既廉價使用起來又足夠簡單的定量免疫測定方法將是有利的。
常規(guī)免疫測定被劃分成兩種類型競爭測定和夾心測定。在競爭測定中，將測試樣品中的抗原與抗原-探針復(fù)合物混合，然后讓該混合物競爭結(jié)合抗體。所述探針可以是酶、熒光團或生色團。其次，在夾心免疫測定中，讓測試樣品中的抗原與抗體結(jié)合，然后讓第二種抗體-探針復(fù)合物與所述抗原結(jié)合。在上述現(xiàn)有測定方法中，通常需要一個或多個洗滌步驟。這些洗滌步驟使得測定過程變得復(fù)雜，并且會產(chǎn)生生物有害的液體廢物。因此，如果能開發(fā)一種用于免疫測定的不需要任何洗滌步驟的裝置將是有利的。所述裝置必須被設(shè)計成使用一次的一次性裝置。
本發(fā)明概述提供了一種定量的、廉價的、一次性免疫傳感器，該傳感器不需要洗滌步驟，因此不會產(chǎn)生液體廢物。另外，在所述傳感器的優(yōu)選實施方案中，用戶不需要計時步驟，并且傳感器能夠方便地適應(yīng)廣泛的動力學(xué)范圍內(nèi)的抗原-抗體相互作用。
在一種實施方案中，提供了用于檢測具有一定pH的流體樣品中的靶抗原的一次性裝置，該裝置包括一個具有一個內(nèi)表面，一個近端和一個遠(yuǎn)端的反應(yīng)室；一種固定在所述反應(yīng)室內(nèi)的固定化抗體，所述抗體能夠結(jié)合靶抗原；存在于所述反應(yīng)室中的一種報道復(fù)合物，該復(fù)合物包括一種探針，該報道復(fù)合物能夠與樣品混合；一個具有一個壁、一個內(nèi)表面，一個遠(yuǎn)端和一個近端的檢測室；一個位于所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端的樣品入口；以及一個位于所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端和所述檢測室近端之間的樣品通道。
在本實施方案的一個方面，在所述反應(yīng)室中裝有一種試劑，該試劑能夠抑制蛋白與反應(yīng)室內(nèi)表面的非特異性結(jié)合。所述試劑可選自表面活性劑和諸如牛血清白蛋白的封閉蛋白。
在本實施方案的另一方面，所述報道復(fù)合物還包括能夠與所述靶抗原競爭結(jié)合所述固定化抗體的第二種抗原，或能夠結(jié)合所述靶抗原的第二種抗體。
在本實施方案的另一方面，所述探針選自生色團和熒光團。所述探針可以包括酶，如葡萄糖氧化酶和葡萄糖脫氫酶。還可以包括酶底物，例如，諸如半乳糖、乙酸或葡萄糖的可氧化的底物。
在本實施方案的另一方面，所述檢測室還包括一種介體。所述介體可以包括二氯靛酚、過渡金屬和含氮雜原子物質(zhì)的復(fù)合物或氰鐵酸鹽。
在本實施方案的一個方面，所述裝置還包括一種能調(diào)整樣品pH的緩沖劑，如磷酸鹽或檸檬酸鹽。
在本實施方案的一個方面，所述固定化抗體和/或報道復(fù)合物被支持在反應(yīng)室內(nèi)表面上。所述報道復(fù)合物還可以與所述固定化抗體間隔小于大約1毫米。
在該實施方案的另一方面，所述裝置還包括一種穩(wěn)定劑，它能穩(wěn)定抗原、酶、和抗體中的一種或多種。
在本實施方案的另一方面，所述酶底物被支持在檢測室內(nèi)表面上。
在本實施方案的另一方面，所述裝置還包括一種支持材料。所述支持材料可以容納在檢測室內(nèi)，并且可以將諸如酶底物、介體、和緩沖劑的一種或多種物質(zhì)支持在所述支持材料上或包含在該支持材料內(nèi)。所述支持材料還可以容納在反應(yīng)室內(nèi)，并且可以將諸如固定化抗體、報道復(fù)合物、和能夠抑制蛋白與反應(yīng)室內(nèi)表面非特異性結(jié)合的制劑的一種或多種物質(zhì)支持在所述支持材料上或包含在所述支持材料內(nèi)。所述支持材料可以包括紗布或纖維填充材料，包括選自下列一組的聚合物聚烯烴、聚酯、尼龍、纖維素、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、及其混合物；諸如多孔膜的多孔材料，包括選自下列一組的聚合材料聚砜、聚二氟乙烯、尼龍、乙酸纖維素酯、聚異丁烯酸酯、聚丙烯酸酯、及其混合物；或燒結(jié)的粉末。
在本實施方案的另一方面，所述檢測室包括至少兩個電極。所述電極可以包括選自下列一組的材料鈀、鉑、金、銥、碳、與粘合劑混合的碳、氧化銦、氧化錫、及其混合物。
在本實施方案的一個方面，所述檢測室的壁對于由所述探針發(fā)射或吸收的射線來說是可穿透的，該射線是所述報道復(fù)合物在檢測室中存在或缺乏的指標(biāo)。
在本實施方案的一個方面，包括一個能夠檢測反應(yīng)室基本上被充滿的狀態(tài)的檢測儀。還包括一個能夠在檢測室遠(yuǎn)端形成一個檢測室通氣孔的穿孔工具。還可以包括位于反應(yīng)室遠(yuǎn)端的反應(yīng)室通氣孔。
在第二種實施方案中，提供了一種生產(chǎn)用于檢測具有一定pH的流體樣品中的靶抗原的一次性裝置的方法，該方法包括以下步驟形成貫穿第一個片材的具有一個近端和一個遠(yuǎn)端的第一個孔，所述第一個孔確定反應(yīng)室側(cè)壁，一個檢測室側(cè)壁，以及位于反應(yīng)室遠(yuǎn)端和檢測室近端之間的第一個樣品通道；在所述第一個片材的第一面上安裝一個第一層，并且覆蓋所述孔，以便確定第一反應(yīng)室端壁和第一檢測室端壁；在所述第一個片材的第二面上安裝一個第二層，并且覆蓋所述孔，以便形成基本上與所述第一層重疊對齊的第二反應(yīng)室端壁和第二檢測室端壁，從而由所述片材和層構(gòu)成具有多個外表面的條(strip)；形成貫穿所述條的外表面進入所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端的第二通道，由該第二通道確定一個反應(yīng)室通氣孔；形成貫穿所述條的外表面進入所述反應(yīng)室近端的第三通道，由該第三通道確定一個樣品入口；將一種抗體固定在所述反應(yīng)室內(nèi)；將一種包括探針的報道復(fù)合物放入所述反應(yīng)室。
在本實施方案的另一方面，所述孔貫穿所述第一片材的近端，以便形成所述第三通道。
在本實施方案的另一方面，所述第一片材、第一層和第二層包括一種電阻材料，所述第一層包括一個第一電極，其中，第一電極朝向所述第一片材的第一面，而所述第二層包括一個第二電極，其中，第二電極朝向所述片材的第二面。至少有一個電極可以包括選自下列一組的材料鈀、鉑、金、銥、碳、與粘合劑混合的碳、氧化銦、氧化錫、及其混合物。所述第一電極可以基本上覆蓋所述第一檢測室端壁，而所述第二電極基本上覆蓋所述第二檢測室的端壁。至少有一個電極可以是噴濺涂布的金屬沉積物。所述第二電極可以與所述第一電極以相對的關(guān)系安裝，二者的間距小于大約500微米；小于大約150微米；或者小于大約150微米，但大于大約50微米。
在本實施方案的另一方面，所述各層粘合在所述片材上，例如通過諸如熱活化粘合劑、壓敏型粘合劑、熱固性粘合劑、化學(xué)固性粘合劑、熱熔性粘合劑和熱流粘合劑的粘合劑粘合。至少所述片材或所述層中的一個可以包括一種聚合材料，如聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烴、及其混合物，或聚對苯二甲酸乙二醇酯。所述各層中的至少一個對于包括紅外射線、可見光、和紫外線射線在內(nèi)的射線的波長來說是可穿透的。
在本實施方案的另一方面，所述方法還包括提供一種酶底物和一種介體，其中，所述酶底物和介體被容納在所述檢測室中，其中，所述探針是一種酶，并且，所述介體能夠介導(dǎo)所述酶和所述電極之間的反應(yīng)，以便指示一種電化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。
在本實施方案的另一方面，所述方法還包括提供一種緩沖劑的步驟，其中，所述緩沖劑能夠調(diào)節(jié)樣品的pH。
在第三種實施方案中，提供了一種生產(chǎn)用于檢測具有一定pH的流體樣品中的靶抗原的一次性裝置的方法，該方法包括形成貫穿第一個電阻材料片的具有一個近端和一個遠(yuǎn)端的第一個孔，所述第一個孔具有一個第一孔反應(yīng)室部分和第一孔檢測室部分，并且確定反應(yīng)室側(cè)壁的第一部分，檢測室側(cè)壁，和位于所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端和檢測室近端之間的樣品通道；形成貫穿第二個電阻材料片的具有一個近端和一個遠(yuǎn)端的第二個孔，由所述第二個孔確定所述反應(yīng)室側(cè)壁的第二部分；形成貫穿第三個電阻材料片的具有一個近端和一個遠(yuǎn)端的第三個孔，由所述第三個孔確定所述反應(yīng)室側(cè)壁的第三部分；將所述第二片材的第一面安裝在所述第一片材的第一面上，所述第二片材覆蓋所述第一孔檢測室部分，從而確定第一檢測室端壁，基本上與反應(yīng)室側(cè)壁的第一部分對齊的反應(yīng)室側(cè)壁的第二部分；將所述第三片材的第一面安裝在所述第一片材的第二面上，所述第三片材覆蓋所述第一孔檢測室部分，從而確定第二檢測室端壁，基本上與反應(yīng)室側(cè)壁的第一部分對齊的反應(yīng)室側(cè)壁的第三部分；在所述第二片材的第二面上安裝一個第一層，并且覆蓋所述第二個孔，以便確定第一個反應(yīng)室端壁；在所述第三片材的第二面上安裝一個第二層，并且覆蓋所述第三孔，以便確定基本上與所述第一薄層重疊對齊的第二反應(yīng)室端壁，從而由所述片材和各層形成具有多個外表面的條；形成貫穿所述條的外側(cè)進入所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端的第二通道，由第二通道確定一個反應(yīng)室通氣孔；形成貫穿所述條的外側(cè)進入所述反應(yīng)室近端的第三通道，由第三通道確定一個樣品入口；將一種抗體固定在所述反應(yīng)室內(nèi)；將一種包括探針的報道復(fù)合物放入所述反應(yīng)室。
在第四種實施方案中，提供了一種用于測定靶抗原在流體樣品中存在或缺乏的方法，該方法包括提供一種一次性裝置，該裝置包括一個反應(yīng)室，該反應(yīng)室具有一個內(nèi)表面，一個近端和一個遠(yuǎn)端，一種固定在所述反應(yīng)室內(nèi)的固定化抗體，所述抗體能夠結(jié)合所述靶抗原，存在于所述反應(yīng)室中的一種報道復(fù)合物，所述復(fù)合物包括一種探針，所述報道復(fù)合物能夠與所述樣品混合，具有一個壁、一個內(nèi)表面、一個遠(yuǎn)端和一個近端的檢測室，在所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端的之間一個樣品入口，在所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端和所述檢測室近端之間一個樣品通道，其中，所述報道復(fù)合物還包括能夠與所述靶抗原競爭結(jié)合所述固定化抗體的第二種抗原；讓一種流體樣品與所述樣品入口接觸；通過讓所述流體樣品由所述樣品入口流向所述反應(yīng)室，使該樣品基本上將所述反應(yīng)室充滿；保持預(yù)定長度的時間，該時間足以在所述樣品中缺少抗原的情況下基本上使所有報道復(fù)合物都結(jié)合在所述固定化抗體上。通過讓所述流體樣品由所述反應(yīng)室經(jīng)過所述樣品通道流向所述檢測室，使該樣品基本上充滿所述檢測室；檢測所述檢測室中抗原-探針復(fù)合物的存在或缺乏，所述抗原-探針復(fù)合物的存在或缺乏，是所述抗原在所述樣品中存在或缺乏的指標(biāo)。
在本實施方案的一個方面，所述方法還包括在所述檢測室壁上穿孔，以便在檢測室遠(yuǎn)端形成一個檢測室通氣孔，所述穿孔步驟是在所述預(yù)定時間之后馬上進行的。
在第五種實施方案中，提供了一種用于生產(chǎn)檢測具有一定pH的流體樣品中的靶抗原的一次性裝置的方法，該裝置具有多個外表面，該方法包括形成貫穿第一個電阻材料片的第一個孔，所述第一個孔具有一個檢測室部分，并且確定檢測室側(cè)壁，所述檢測室具有一個近端和一個遠(yuǎn)端；在所述第一片材的第一面上安裝一個第一層，并且覆蓋所述孔，以便確定第一檢測室端壁；在所述第一片材的第二面上安裝一個第二層，并且覆蓋所述孔，以便確定基本上與所述第一層重疊對齊的第二檢測室端壁，從而由所述片材和各層形成一個條；形成貫穿所述條的第二個孔；所述條具有一個近端和一個遠(yuǎn)端，所述第二個孔具有一個反應(yīng)室部分，該反應(yīng)室部分具有一個遠(yuǎn)端和一個近端，并且由所述第二個孔確定反應(yīng)室側(cè)壁和位于所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端和所述檢測室近端之間的樣品通道；將第三層的第一面安裝在所述條的第一面上，所述第三層覆蓋所述第二孔反應(yīng)室部分，以便確定第一個反應(yīng)室端壁；將第四層的第一面安裝在所述條的第二面上，所述第四層覆蓋所述第二孔反應(yīng)室部分，以便確定基本上與所述第一反應(yīng)室端壁對齊的第二個反應(yīng)室端壁；形成貫穿所述裝置的一個表面進入所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端的第三個孔，所述第三個孔確定一個反應(yīng)室通氣孔；形成貫穿所述裝置的一個表面進入所述反應(yīng)室近端的第四個孔，由所述第四孔確定一個樣品入口；將一種抗體固定在所述反應(yīng)室內(nèi)，并且將包括一種探針的報道復(fù)合物放入所述反應(yīng)室。
在本實施方案的一個方面，所述第一片材、第一層和第二層包括一種電阻材料，所述第一層包括一個第一電極，其中，所述第一電極朝向所述第一片材的第一面，所述第二層包括一個第二電極，其中，所述第二電極朝向所述電極的第二面。
附圖簡述

圖1表示采用了一種電化學(xué)電池的免疫傳感器的俯視圖(不成比例)。
圖2表示沿圖1所示免疫傳感器實施方案的線A-A’的橫切面圖(不成比例)
優(yōu)選實施方案的詳細(xì)說明以下說明和實施例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括本發(fā)明的多種改變和改進。因此，對優(yōu)選實施方案的說明不應(yīng)當(dāng)被視為對本發(fā)明范圍的限定。
公開了一種單一步驟的免洗免疫傳感器。該傳感器是僅使用一次的一次性裝置，它采用了兩個相鄰的室，一個反應(yīng)室和一個檢測室。在所述反應(yīng)室中，發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，而在所述檢測室中檢測所述反應(yīng)的結(jié)果，并且提示所述樣品中抗原的存在或缺乏。
可以使用任何合適的檢測方法。合適的檢測方法包括，例如，視覺檢測，其中，觀察顏色的形成；或光譜檢測，其中，利用反射光線或透射光線檢測光吸收的改變。在一種優(yōu)選實施方案中，所述檢測方法是電化學(xué)方法，其中，檢測直接由抗原/抗體反應(yīng)產(chǎn)物所產(chǎn)生的電流或電位。
用于獲得流體樣品的電化學(xué)測定結(jié)果的方法和裝置進一步公開于以下文獻中申請日為2000年7月14日的共同未決美國專利申請?zhí)?9/616691，題為“抗氧化劑傳感器”，申請日為2000年7月14日的共同未決美國專利申請?zhí)?9/616512，題為“血紅蛋白傳感器”，以及申請日為2000年7月14日的共同未決美國專利申請?zhí)?9/616556，題為“用于測定化學(xué)反應(yīng)速度的電化學(xué)方法”，以上每一份專利申請以其全文形式收作本文參考。
各個檢測階段，即反應(yīng)階段和檢測階段的計時，可以通過人工完成。另外，計時還可以反應(yīng)于在所述反應(yīng)室被填充時所產(chǎn)生的啟動信號自動進行。
在圖1和2中示出了適用于電化學(xué)檢測的傳感器的一種實施方案。圖1是所述傳感器條的俯視圖，而圖2是橫切面圖，顯示反應(yīng)室和檢測室的細(xì)節(jié)。
傳感器所述優(yōu)選實施方案的免疫傳感器可以用在制備電化學(xué)葡萄糖傳感裝置時所使用的眾所周知的薄層裝置生產(chǎn)技術(shù)制備(例如，參見US5942102，在此以全文形式收作本文參考)。所述技術(shù)在進行某些改進之后，同樣可用于使用非電化學(xué)檢測方法制備免疫傳感器。
在圖1和2所示的免疫傳感器的一種優(yōu)選實施方案中，檢測室28包括一個電化學(xué)電池28。反應(yīng)室22和檢測室28是通過首先形成一個貫穿電阻材料片36的孔制備的。所述孔的形狀是這樣的由它確定反應(yīng)室22和檢測室28的側(cè)壁，以及位于室22和28之間的樣品通道38。通過將所述孔由反應(yīng)室22的近端24延伸通過片材37的邊緣，還形成了樣品入口24。在一種實施方案中，由片材36的厚度確定了反應(yīng)室22和檢測室28的整個高度，這兩者是相等的。在另一種實施方案中，反應(yīng)室22的高度大于檢測室28的高度。通過將多個片材32、34和36層壓在一起，制備高度大于檢測室28高度的反應(yīng)室22。如上文所述，所述層的中間片材36具有確定反應(yīng)室22和檢測室28的側(cè)壁74和76的孔。然后將中間層36夾在兩個或兩個以上其他層32和34之間，所述其他層32和34具有僅確定反應(yīng)室22的側(cè)壁74的孔，由層32和34確定檢測室28的端壁60和62。在本實施方案中，所述檢測室的端壁60和62包括電極52和54，所述電極可以按以下方法制備。
在形成反應(yīng)室22和檢測室28的側(cè)壁74和76之后，將第一個薄的電極層52安裝在電阻片材36的一面70上，覆蓋確定檢測室28的孔，并且形成端壁60。可以將層52粘合在片材36上，例如，通過粘合劑粘合。合適的粘合劑包括，例如，熱活化粘合劑、壓敏型粘合劑、熱固性粘合劑、化學(xué)固性粘合劑、熱熔性粘合劑、和熱流粘合劑等。所述電極層52是通過用諸如鉑、鈀、碳、氧化銦、氧化錫、混合的氧化銦/氧化錫、金、銀、銥及其混合物等的合適金屬對電阻材料片32進行涂布(例如，通過噴濺涂布)而制備的。適合用作電極52和54的材料與存在于傳感器20中的試劑相容，即它們不會與試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
然后將第二個薄的電極層54安裝在所述電阻材料36的相對一面71上，同樣覆蓋形成檢測室28的孔，以便形成第二個端壁62。在一種優(yōu)選實施方案中，電極層52和54是以相對的關(guān)系安裝的，二者的間距小于大約500微米，更優(yōu)選小于100微米，最優(yōu)選50-150微米。如果還沒有形成一個樣品入口24的話，就提供一個這樣的入口，例如，在裝置20的邊緣37上形成一個缺口，該缺口與反應(yīng)室22的近端23相交。
給電極層52和54提供連接工具，以便將傳感器20安裝在測定電路中。電池28中的至少一個電極52或54是傳感電極，即對于抗氧化劑來說是對還原的氧化還原試劑量敏感的電極，或者對于氧化劑來說是對氧化的氧化還原試劑敏感的電極。對于電位測定傳感器20來說，其中，傳感電極52或54的電位是分析物含量的指標(biāo)，起著參考電極作用的第二個電極54或52提供參考電位。對于電流測定傳感器20來說，其中，所述傳感電極電流是樣品中分析物含量的指標(biāo)，存在至少一個其他電極54或52，該電極起著對電極的作用，以便使該電路完整。所述第二個電極54或52可以起著參考電極的作用。另外，可以由一個獨立的電極(未示出)起著參考電極的作用。
如果免疫傳感器20是以電化學(xué)電池28的形式工作的話，包含確定反應(yīng)室22和/或檢測室28的孔的片材32、34和36就應(yīng)當(dāng)包括電阻材料。例如，合適的電阻材料包括聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烴及其混合物等。優(yōu)選的聚酯是聚對苯二甲酸乙二醇酯。如果免疫傳感器20是通過一種檢測方法工作，而不是通過電化學(xué)檢測方法工作的話，所述材料就不一定是電阻材料。不過，優(yōu)選用上述聚合材料制造優(yōu)選實施方案的免疫傳感器，因為這些材料便于加工、成本低、并且不會與試劑和樣品發(fā)生反應(yīng)。對于涉及到特定頻率光線的吸收、透射或發(fā)射的檢測方法來說，端壁60和/或62以及位于檢測室28的端壁上面的層32和46和/或?qū)?4和42對于所述光線頻率而言應(yīng)當(dāng)是可穿透的。
可以將用于電池28中的試劑，例如固定化抗體、探針連接的抗原、緩沖劑和介體等支持在反應(yīng)室22的壁40、48、和/或74上，或支持在檢測室28的壁60、62和/或76上，支持在容納于室內(nèi)的獨立的支持物上，或包含在一種基質(zhì)內(nèi)，或者是自我支持的。如果將所述試劑支持在電極52和54的所述室的壁上，可以采用本領(lǐng)域眾所周知的印刷技術(shù)涂敷所述化合物，例如，噴墨印刷、絲網(wǎng)印刷、和平板印刷等。在一種優(yōu)選實施方案中，將含有所述試劑的溶液涂敷在一個室內(nèi)的表面上，并讓它干燥。
除了將抗體44、探針連接的抗原50或其他化合物固定或干燥在反應(yīng)室22或檢測室28的表面40、48、60、62、74和/或76上之外，優(yōu)選將其支持在一種或多種獨立的支持物上或容納在該支持物內(nèi)，然后再將該支持物放入一個室。合適的獨立支持物包括，但不限于紗布材料、無紡片材、纖維填充材料、大孔膜或燒結(jié)的粉末。獨立支持物的優(yōu)點包括具有較大的表面積，因此，如果需要的話，可以在反應(yīng)室28中容納更多的抗體和探針連接的抗原。在這樣一種實施方案中，將抗體固定在一片多孔材料上，并將其放入第一反應(yīng)室，并且將探針連接的抗原干燥在第二片多孔材料上，然后將該材料放入所述反應(yīng)室。另外，如上文所述，可以將抗體或探針連接的抗原摻入多孔材料，而將其他成分支持在反應(yīng)室的壁上。在另一種實施方案中，所述反應(yīng)室的壁本身是多孔的，在這些孔中摻入所述抗體和/或探針連接的抗原。在本實施方案中，液體能夠被吸入所述多孔的壁，但不會從特定部位泄露。這一目的是通過使用大孔膜形成反應(yīng)室壁，并且將所述膜壓縮在反應(yīng)室周圍，以便阻止樣品從需要的部位泄露而實現(xiàn)的。
諸如紗布材料、無紡片材和纖維填充材料的合適的獨立支持物包括聚烯烴、聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚砜及其混合物等。合適的大孔膜可以用聚合材料制備，這些材料包括聚砜、聚二氟乙烯、尼龍、乙酸纖維素酯、聚異丁烯酸酯、聚丙烯酸酯及其混合物等。
蛋白或抗體可以包含在諸如聚乙酸乙烯酯的基質(zhì)內(nèi)。通過改變所述基質(zhì)在樣品中的溶解特征，可以實現(xiàn)控制所述蛋白或抗體向樣品中的釋放。
在所有場合下，用于所述傳感器中的材料都是適合大批量生產(chǎn)形式的，并且將電池本身設(shè)計成能夠在一次實驗中使用后就被丟棄。
在圖1和2中示出了按上述方法生產(chǎn)的免疫傳感器的一種優(yōu)選實施方案。在該優(yōu)選實施方案中，層32和34是用導(dǎo)電材料52和54涂布的基質(zhì)。表面60或62上的導(dǎo)電材料52或54朝向檢測室28，而涂在表面33或35上的粘合劑層(未示出)分別朝向?qū)?2或46。
使用所述傳感器測定一種抗原的存在或缺乏如圖1和2所示，在一種優(yōu)選實施方案中，傳感器20是一種使用諸如葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶作探針的電化學(xué)電池28，圖1是傳感器20的俯視圖，圖2是通過線A-A’的該傳感器的橫切面圖。在以下實施方案中了解一種分析物的存在或缺乏。
用戶首先通過樣品入口24將樣品導(dǎo)入傳感器20的反應(yīng)室22。在毛細(xì)作用或燈芯作用的影響下將樣品吸入反應(yīng)室22。在填充反應(yīng)室期間，通氣孔26是與大氣相通，以便使得由樣品排出的空氣能夠逸出。樣品會被吸入反應(yīng)室22，直到充滿到反應(yīng)室通氣孔26。然后就終止填充。選擇反應(yīng)室22的體積，以便其體積至少等于，并且優(yōu)選大于檢測室28的體積。
圖1中用虛線劃出的圓表示穿透層32、34和36，但沒有穿透層42和46的孔30，層34上的孔通向檢測室28。由于層42和46最初沒有被刺穿，檢測室28通向環(huán)境的唯一通道是通向反應(yīng)室22的樣品通道38。因此，當(dāng)反應(yīng)室22被樣品所充滿時，就阻斷了通向檢測室28的樣品通道38。這樣會將空氣滯留在檢測室28中，并且基本上能抑制其填充樣品。在樣品首次接觸通向檢測室28的開口38至樣品接觸開口38的遠(yuǎn)側(cè)期間，會有少量樣品進入檢測室28。不過，一旦所述樣品將通向檢測室28的開口38完全濕潤，就不再會發(fā)生檢測室28的進一步填充。
用抗待檢測抗原的抗體44包被構(gòu)成反應(yīng)室22底部的基質(zhì)42的內(nèi)表面40。通過吸附或其他方式將抗體44固定在基質(zhì)42的表面40上，以便在測試期間抗體不會從基質(zhì)42上排出。在將抗體44涂敷到基質(zhì)42的內(nèi)表面40上之后，可選擇性地將一種被設(shè)計用于抑制蛋白與該表面的非特異性結(jié)合的試劑涂在該表面上(未示出)。本領(lǐng)域眾所周知的這樣一種試劑的例子是牛血清白蛋白(BSA)。還可以將非離子型表面活性劑用作所述試劑。例如由賓夕法尼亞州費城的Rohm&Haas生產(chǎn)的Triton X-100TM或由德拉華州維明頓市的ICI Americas生產(chǎn)的TweenTM。所選擇的非離子型表面活性劑不會使蛋白變性。待檢測狀態(tài)的涂在基質(zhì)42內(nèi)表面40上的涂層44是干燥狀態(tài)的。
由另一種基質(zhì)46構(gòu)成反應(yīng)室22的上表面48。在基質(zhì)46的內(nèi)表面48上包被有與待檢測抗原50連接的酶。合適的酶包括，但不限于葡萄糖氧化酶和葡萄糖脫氫酶。將酶連接的抗原50干燥在基質(zhì)66的內(nèi)表面48上，以便當(dāng)表面48被樣品濕潤時它能釋放到樣品中。因此，要選擇用于涂敷酶連接抗原50的基質(zhì)46的內(nèi)表面和涂敷方法，以便在酶連接的抗原50和基質(zhì)46的內(nèi)表面48之間僅存在弱的結(jié)合。選擇酶連接的抗原50從表面48上溶解的速度，以便在樣品填充反應(yīng)室22期間只會出現(xiàn)很少的溶解。這樣，在填充之后，酶連接的抗原50就能均勻分布到反應(yīng)室22的整個部位。
選擇酶連接的抗原50和抗體44的相對量，以便抗體44的量略微超過酶連接的抗原50的量。在上下文中略微多于被定義為該多余量與樣品中待檢測的抗原分子的數(shù)量相比是小的。
因此，當(dāng)樣品填充反應(yīng)室22時，酶連接的抗原50進入并且與所述樣品混合。然后用足夠的時間使酶連接的抗原與抗體44接觸。因為存在多余的抗體44，如果樣品中不存在抗原的話，基本上所有的酶連接的抗原50都能結(jié)合在抗體44上，并且被有效固定。如果樣品中存在抗原，這些抗原小于酶連接的抗原50，并且業(yè)已存在于樣品的所有體積中，這些抗原會在酶連接的抗原50接觸抗體44之前接觸并結(jié)合在抗體44上。因此，抗體44被封閉，并且不能結(jié)合酶連接的抗原50。因此，如果樣品中原來存在抗原的話，在反應(yīng)步驟結(jié)束時，酶連接的抗原50在樣品中將保持移動性。如果在樣品中最初不存在抗原的話，在反應(yīng)步驟結(jié)束時，酶連接的抗原50就會固定在基質(zhì)46的內(nèi)表面上。
所述反應(yīng)步驟的結(jié)束是在樣品被導(dǎo)入反應(yīng)室22之后的預(yù)定時間。設(shè)定所述預(yù)定時間，以便在當(dāng)樣品中最初不存在抗原的測試條件下，有足夠的時間使基本上由酶連接的所有抗原50結(jié)合在抗體44上。
樣品被導(dǎo)入反應(yīng)室22的時間可以由用戶確定，例如，通過按壓與傳感器20連接的儀表的按鈕。這種動作被用于啟動計時裝置。對于視覺檢測來說，不需要儀表裝置。在這種實施方案中，用戶手工計時反應(yīng)時間。
在利用電化學(xué)檢測檢測抗體/抗原反應(yīng)結(jié)果的情況下，顯示樣品業(yè)已導(dǎo)入反應(yīng)室22的指示可以是自動化的。如上文所述，當(dāng)樣品填充反應(yīng)室22時，在通向反應(yīng)室開口38處的檢測室28的小部分會被樣品潤濕。如果進行電化學(xué)檢測的話，在檢測室28中會存在至少兩個電極52和54。如果電極52和54被安裝在檢測室28中，在填充反應(yīng)室22期間每一個電極52和54的至少一部分會接觸樣品，樣品的存在會連通電極52和54，并且產(chǎn)生一個可以被用來啟動計時裝置的電信號。
在經(jīng)過由用戶或自動啟動所述計時裝置的預(yù)定時間之后，該測試的抗體/抗原反應(yīng)階段就被認(rèn)為已經(jīng)結(jié)束。當(dāng)所述測試的抗體/抗原反應(yīng)階段結(jié)束時，通向大氣的通氣孔56打開。例如，可以利用所述儀表上的由電池閥驅(qū)動的針刺穿層42或46或同時剌穿42和46，由此使得檢測室28的遠(yuǎn)端58與大氣相通。如在上面的例子中所述，所述穿刺可以是由所述儀表自動進行的，或者在不使用儀表通過視覺檢測的情況下由用戶用手穿刺，例如，用戶將針插入層42和46，并由此形成通氣孔56。
由于通氣孔56與大氣相通，這使得滯留在檢測室28中的空氣可以逸出，從而由來自反應(yīng)室22的反應(yīng)過的樣品填充檢測室28。由于檢測室28中的毛細(xì)力比反應(yīng)室22中的毛細(xì)力大，所述反應(yīng)過的樣品被吸入檢測室28。在一種優(yōu)選實施方案中，所述較大的毛細(xì)力是通過適當(dāng)包被檢測室28的表面60和62而產(chǎn)生的，或者更優(yōu)選通過選擇檢測室28的毛細(xì)距離使其小于反應(yīng)室22的毛細(xì)距離。在本實施方案中，毛細(xì)距離被定義為所述室的最小尺寸。
在檢測室28中選擇性地安裝有干燥的試劑64，該試劑中含有能夠與酶連接的抗原50的酶部分起反應(yīng)以便產(chǎn)生可檢測信號的酶底物和介體。如果存在酶底物和介體的話，其數(shù)量足以使得所存在的所有酶與酶底物64的反應(yīng)速度是由所存在的酶的數(shù)量決定的。例如，如果所述酶是葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶的話，可以將合適的酶介體64和葡萄糖(如果樣品中沒有的話)安裝到檢測室28中。還可以包含緩沖劑，以便幫助調(diào)節(jié)檢測室28中樣品的pH。在使用電化學(xué)檢測系統(tǒng)的實施方案中，氰鐵酸鹽是一種合適的介體。其他合適的介體包括二氯靛酚和過渡金屬與含氮雜原子物質(zhì)之間的復(fù)合物。所述葡萄糖、介體和緩沖試劑64具有足夠的數(shù)量，以便所述酶與酶底物64的反應(yīng)速度是由所存在的酶的濃度決定的。
當(dāng)檢測室28被充滿時，試劑64就溶解到樣品中。試劑64的酶成分與葡萄糖和介體起反應(yīng)，產(chǎn)生還原的介體。這種還原的介體被在檢測室28中起著陽極作用的電極52或54以電化學(xué)方式氧化，以便產(chǎn)生電流。在一種實施方案中，將該電流隨時間推移改變的速度用作存在于反應(yīng)樣品中的酶的存在和數(shù)量的指標(biāo)。如果電流的改變速度小于預(yù)定的閾值的話，就表明在反應(yīng)的樣品中不存在明顯數(shù)量的酶連接的抗原50，表明在原始樣品中缺乏抗原的存在。如果電流改變的速度大于所述閾值的話，就表明在反應(yīng)的樣品中存在酶連接的抗原50，并且所述樣品中最初就也存在抗原。在一種實施方案中，電流的改變速度被用于提供最初存在于所述樣品中的抗原的相對數(shù)量的指標(biāo)。
在所述電化學(xué)檢測系統(tǒng)的一種優(yōu)選實施方案中，檢測室28中的電極52和54是以包被在基質(zhì)32和34內(nèi)表面60和62上的導(dǎo)電層形式生產(chǎn)的，例如，通過公開于WO97/18464中的噴濺技術(shù)生產(chǎn)。導(dǎo)電層52和54是不會與所存在的試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的材料，并且可以在選擇的電位下被用作電極52和54。合適材料的例子包括，但不限于鈀、鉑、金、銥、碳、與粘合劑混合的碳、氧化銦、氧化錫、和混合的氧化銦和氧化錫。
在本實施方案中，用一種惰性電絕緣層36分隔裝有電極的基質(zhì)32和34。絕緣層36優(yōu)選起著保持層32和34具有預(yù)定間隔的作用。只要該間隔距離足夠小，例如小于500微米，更優(yōu)選50-150微米，在經(jīng)過相對所使用的檢測時間而言適當(dāng)?shù)亩痰臅r間之后，電極52和54之間的電流就直接與還原介體的濃度成正比。在本實施方案中，電流量直接與所述酶反應(yīng)的速度相關(guān)，并因此與所存在的酶的數(shù)量相關(guān)。
在圖1中示出了連接端66。檢測室28中的電極54和56可以通過連接終端66與儀表(未示出)形成電連接。所述連接工具(未示出)通過導(dǎo)電電路(未示出)與檢測室28中的電極54和56形成電連接。在圖1所示的優(yōu)選實施方案中，所述導(dǎo)電電路由包被在內(nèi)表面32和34上的導(dǎo)體52和54的薄膜的延長部分構(gòu)成。與所述連接部位66連接的儀表能夠在檢測室28中的電極52和54之間施加一個電位，分析所產(chǎn)生的電信號，顯示反應(yīng)結(jié)果，并選擇性地將該反應(yīng)結(jié)果保存在存儲器中。
在使用電化學(xué)檢測的其他實施方案中，在檢測室的一個或兩個內(nèi)表面上使用導(dǎo)電材料條，其前提是存在至少兩個電極，即一個傳感電極和一個對電極/參考電極。選擇性地包括被用作獨立的參考電極的第三個電極。
在利用視覺檢測或反射光譜分析作為檢測方法的實施方案中，至少層32和46或34和42對于要觀察的射線波長來說是可穿透的。在視覺檢測的情況下，觀察檢測室28中的簡單的顏色變化。在反射光譜分析中，檢測光線是通過層32和46或?qū)?4和42照射進來的，并且分析由檢測室28中的溶液反射的光線。在將透射光譜用作檢測方法的情況下，至少層32、46、34和42對于選擇的波長來說是可穿透的。光線通過檢測室28中的樣品照射，并且測定光束的減弱。
在制造傳感器方法的一種優(yōu)選實施方案中，層36包括一種基質(zhì)，在其上表面70和下表面72上涂有一層粘合劑(未示出)。適合用作層60的基質(zhì)的材料的例子包括聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烴，并且優(yōu)選聚對苯二甲酸乙二醇酯。合適粘合劑的例子有壓敏型粘合劑、熱和化學(xué)固性粘合劑以及熱熔性和熱流粘合劑。
用蜂毒肽作探針常規(guī)ELISAs將一種抗原連接在一種酶上。不過，也可以將所述抗原連接在蜂毒肽上。蜂毒肽是存在于蜂毒中的多肽。在本實施方案中，探針連接的抗原包括可以干燥在反應(yīng)室壁上的抗原-蜂毒肽復(fù)合物，如上文所述。檢測室可以裝有一種介體，包括存在于脂質(zhì)體或脂類小泡中的氰亞鐵酸鹽。如果所述抗原-蜂毒肽復(fù)合物接觸所述脂質(zhì)體，脂質(zhì)體就會破裂，并釋放出氰亞鐵酸鹽。這樣會導(dǎo)致信號的迅速放大，即少量的游離抗原與抗原-蜂毒肽復(fù)合物競爭結(jié)合抗體上的結(jié)合位點，并產(chǎn)生高濃度的氰亞鐵酸鹽。
在電化學(xué)測定中使用辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶常規(guī)ELISAs將辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)用作比色測定中的酶。不過，業(yè)已開發(fā)出了能夠使這兩種酶被用于電化學(xué)測定中的底物。
在本實施方案中，AP可以與對氨基苯基磷酸一起使用，而HRP可以與四硫富瓦烯一起使用。
用免疫傳感器獲得電化學(xué)測定結(jié)果在某些實施方案中，可以用所述傳感器獲得與能產(chǎn)生至少一種電活性產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)的速度相關(guān)的信息，這一目的是通過確保所述化學(xué)反應(yīng)位于遠(yuǎn)離用來與所述電活性產(chǎn)物發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的電極的部位而實現(xiàn)的。
所述化學(xué)反應(yīng)的部位與所述電極足夠遠(yuǎn)，以至來自所述化學(xué)反應(yīng)部位的所述電活性產(chǎn)物的向所述電極的質(zhì)量轉(zhuǎn)移在任何時間都能有效控制所述電極上的電流。這種結(jié)構(gòu)能確保在所述化學(xué)反應(yīng)部位和所述電極之間存在基本上為線性的電活性物質(zhì)濃度梯度。通過在它上面所發(fā)生的電化學(xué)反應(yīng)，將所述電極上的電活性物質(zhì)的濃度有效保持為0。由于所述濃度大小隨著時間的變化基本上僅僅是由所述化學(xué)反應(yīng)位點上電活性物質(zhì)的濃度隨著時間的變化以及所述電活性反應(yīng)產(chǎn)物在液體介質(zhì)中的擴散系數(shù)決定的。因此，所述電極上的電流與該電極上所述電活性物質(zhì)的濃度梯度成正比，該電流隨時間的變化能體現(xiàn)發(fā)生在所述遠(yuǎn)處位置上的化學(xué)反應(yīng)的時間變化。這樣就可以將在所述電極上測定的電流(通過的電荷，如果所述電流是集成的)用作所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)速度和進程的方便的指標(biāo)。
用于確保所述化學(xué)反應(yīng)遠(yuǎn)離工作電極的合適方法的一個例子是，將一種或多種反應(yīng)成分固定在遠(yuǎn)離所述電極的固體表面上?？梢酝ㄟ^將所述反應(yīng)成分摻入聚合物基質(zhì)中對其進行固定，所述成分通過干燥或以其他方式連接在所述固體表面上。還可以通過化學(xué)結(jié)合或物理結(jié)合將所述反應(yīng)成分直接連接在所述固體表面上。或者將一種或多種所述反應(yīng)成分簡單地在所述固體表面上干燥，而不采用特殊固定措施。在這種情況下，所述一種或多種反應(yīng)成分在填充電化學(xué)電池的液體基質(zhì)中的遷移率足夠低，就是說在能夠有效監(jiān)測電化學(xué)電流以便完成必要的測定的時間內(nèi)，它不會從它所干燥的位置上發(fā)生明顯的遷移。在這里，明顯的遷移表示所述化學(xué)反應(yīng)所需要的移動最緩慢的成分足夠接近所述工作電極，以便Cottrell型消耗動力學(xué)開始在所述電極上實現(xiàn)電流的時間進程。
在優(yōu)選實施方案中，所述化學(xué)反應(yīng)部位和工作電極之間的間隔距離以小于大約1厘米為理想，優(yōu)選小于5毫米，更優(yōu)選為5、10、50、100、200、500微米至5毫米，更優(yōu)選為5、10、50、100、200至500微米，最優(yōu)選為5、10、50、100至200微米。
除了所述工作電極之外，提供至少一個與所述流體樣品接觸的對電極，以便使所述電化學(xué)電路完整。所述對電極可以選擇性地起著對電極/參考電極的作用，或者提供一個獨立的參考電極。在一種優(yōu)選實施方案中，所述工作電極和對電極之間的間隔距離以不超過大約300微米為宜，優(yōu)選不超過大約500微米，更優(yōu)選大約500微米至10毫米，更優(yōu)選大約500微米至1、2、5毫米，最優(yōu)選1至2、5、10毫米。
所述工作電極優(yōu)選是用這樣的材料制成的在使用期間它不會與所接觸到的任何成分發(fā)生能干擾該電極電流反應(yīng)程度的化學(xué)反應(yīng)。如果所述工作電極被用作陽極的話，合適材料的例子是鉑、鈀、碳、與惰性粘合劑結(jié)合的碳、銥、氧化銦、氧化錫、氧化銦和氧化錫的混合物。如果所述工作電極被用作陰極的話，除了上面所列舉的材料之外，其他合適材料有鋼、不銹鋼、銅、鎳、銀和鉻。
適合用作對電極的材料的例子有鉑、鈀、碳、與惰性粘合劑結(jié)合的碳、銥、氧化銦、氧化錫、氧化銦和氧化錫的混合物、鋼、不銹鋼、銅、鎳、鉻、銀和用基本上為不溶性的銀鹽包被的銀，如氯化銀、溴化銀、碘化銀、氰亞鐵酸銀、氰鐵酸銀。
化學(xué)反應(yīng)的部位可以位于遠(yuǎn)離所述工作電極的裸露的壁或所述對電極上的。所述化學(xué)反應(yīng)的部位可以在與工作電極相同的平面上，或者更優(yōu)選位于朝向并且基本上平行于所述工作電極的平面上。
適用于某些實施方案的傳感器包括安裝在電絕緣基質(zhì)上的工作電極和對電極。在第二種基質(zhì)上安裝有一層化學(xué)反應(yīng)劑，其中至少一種反應(yīng)劑基本上固定在該基質(zhì)上。在使用時，在所述傳感器的壁之間的空間中填充含有能夠與所述試劑發(fā)生反應(yīng)以便產(chǎn)生一種電活性物質(zhì)的物質(zhì)的液體。所述化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物向工作電極擴散，在這里，所述電活性物質(zhì)發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，以便產(chǎn)生電流。然后可以用在特定時間的電流或通過的電荷的大小或電流或通過的電荷隨時間的變化獲得發(fā)生在所述反應(yīng)劑層上的化學(xué)反應(yīng)的速度或程度的指標(biāo)。
在所述傳感器的另一種實施方案中，所述反應(yīng)劑存在于被安裝在一種電阻基質(zhì)上的對電極上。在該實施方案中，制造對電極的材料與存在于該電極上的反應(yīng)劑的任何成分的反應(yīng)都是惰性的。
獲得上述電化學(xué)測定結(jié)果的方法應(yīng)用于任何合適的電化學(xué)系統(tǒng)，包括電化學(xué)免疫測定系統(tǒng)。應(yīng)用于典型的，但不是免疫測定的電化學(xué)系統(tǒng)的所述方法的一個例子，是用酶PQQ依賴型葡萄糖脫氫酶(GDHpqq)和氧化還原介體測定全血中的葡萄糖。在該反應(yīng)中，血液中的葡萄糖與GDHpqq起反應(yīng)，形成葡萄糖酸。在該過程中，所述酶的PQQ減少。然后諸如氰鐵酸鉀的介體氧化所述酶中的PQQ，并形成氰亞鐵酸鹽。然后所述氧化形式的酶能夠與其他葡萄糖起反應(yīng)。該反應(yīng)的凈結(jié)果是使發(fā)生反應(yīng)的每一個葡萄糖分子產(chǎn)生兩個氰亞鐵酸鹽分子。氰亞鐵酸鹽是一種電活性物質(zhì)，因此能夠在電極上被氧化，產(chǎn)生電流。適合該反應(yīng)的其他酶是葡萄糖氧化酶(GOD)或NAD依賴型葡萄糖脫氫酶。對其他反應(yīng)來說，可以使用乳酸脫氫酶和醇脫氫酶。其他合適的氧化還原介體包括ferrocinium、鋨與二吡啶和二苯酮的復(fù)合物。
全血中葡萄糖與所述酶的反應(yīng)可能是緩慢的，需要幾分鐘時間才能完成。另外，所述樣品的血細(xì)胞比容越高，反應(yīng)就越慢。血液的血細(xì)胞比容是紅細(xì)胞在全血樣品中所占的體積比例。例如，將含有50毫克/毫升GDHpqq、0.9M氰鐵酸鉀和50mM緩沖劑，pH6.5的溶液沉積在對電極上，并且除去水分，留下的干燥的反應(yīng)劑層。在該層中，GDHpqq的量大到足以有效固定在對電極上，而所述氰鐵酸鹽能夠更均勻地混合在所述電化學(xué)電池的液體中。將所述血液樣品導(dǎo)入所述電池，并且馬上在工作電極和對電極之間施加+300mV的電位。盡管對于氧化氰亞鐵酸鹽來說，+300mV的電位是最優(yōu)選的，但所述電位以在+40至+600mV為宜，優(yōu)選+50至+500mV，優(yōu)選+100至+400mV。在所述電池上，工作電極由噴濺在一種聚酯基質(zhì)上的一層金組成，而對電極由噴濺在一種聚酯基質(zhì)上的一層鈀組成。
記錄具有不同血細(xì)胞比容的血液樣品的電流量，發(fā)現(xiàn)在較低血細(xì)胞比容的血液中，即血液中的血細(xì)胞比容為20％、42％和65％時反應(yīng)速度較快。每一種血液樣品中的葡萄糖含量大體上相同，即65％血細(xì)胞比容樣品的葡萄糖含量為5.4mM，42％血細(xì)胞比容樣品的葡萄糖含量為5.5mM，而20％血細(xì)胞比容樣品的葡萄糖含量為6.0mM。
測定的電流大體上可以用以下公式表示i＝-FADC/L其中，i是電流，F(xiàn)是法拉第常數(shù)(96486.7C/mol)，A是電極面積，D是所述氰亞鐵酸鹽在樣品中的擴散系數(shù)，C是氰亞鐵酸鹽在反應(yīng)部位的濃度，而L是反應(yīng)部位和電極之間的距離。因此，通過C隨時間改變的速度表示的反應(yīng)速度可以用以下公式表示dC/dt＝-(L/FAD)di/dt對于上述反應(yīng)來說，在6-8秒之間，20％、42％和65％血細(xì)胞比容樣品的平均di/dt分別為3.82、2.14和1.32毫安/秒。對20％、42％和65％血細(xì)胞比容的樣品來說，氰亞鐵酸鹽的擴散系數(shù)分別為2.0×10-6，1.7×10-6和1.4×10-6平方厘米/秒。電極面積為0.1238平方厘米，而L為125微米。對于20％、42％和65％血細(xì)胞比容的樣品來說，以上值所得到的反應(yīng)速度分別為2.0、1.3和1.99mM/秒。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，可以對上述用于測定血液中葡萄糖反應(yīng)的方法進行改進，以便應(yīng)用于其他電化學(xué)系統(tǒng)，包括免疫測定系統(tǒng)，如抗原測定。
以上說明公開了本發(fā)明的若干種方法和材料?？梢詫Ρ景l(fā)明的所述方法和材料進行改進，并且改變生產(chǎn)方法和設(shè)備。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本說明書或本文所公開的本發(fā)明的實踐之后能夠理解所述改進。因此，并非要將本發(fā)明局限于本文所公開的具體實施方案，而是要包括根據(jù)體現(xiàn)在所附權(quán)利要求書中的本發(fā)明的實際范圍和構(gòu)思作出的所有改進和改變。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測具有一定pH的流體樣品中的靶抗原的一次性裝置，該裝置包括一個具有一個內(nèi)表面，一個近端和一個遠(yuǎn)端的反應(yīng)室；一種固定在所述反應(yīng)室內(nèi)的固定化抗體，所述抗體能夠結(jié)合靶抗原；存在于所述反應(yīng)室中的一種報道復(fù)合物，該復(fù)合物包括一種探針，該報道復(fù)合物能夠與樣品混合；一個具有一個壁、一個內(nèi)表面，一個遠(yuǎn)端和一個近端的檢測室；一個位于所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端的樣品入口；以及一個位于所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端和所述檢測室近端之間的樣品通道。
2.如權(quán)利要求1的裝置，還包括容納在所述反應(yīng)室中的一種試劑，該試劑能夠抑制蛋白與反應(yīng)室內(nèi)表面的非特異性結(jié)合。
3.如權(quán)利要求2的裝置，其中，所述試劑選自表面活性劑和封閉蛋白。
4.如權(quán)利要求3的裝置，其中，所述封閉蛋白是牛血清白蛋白。
5.如權(quán)利要求1的裝置，其中，所述報道復(fù)合物還包含能夠與所述靶抗原競爭結(jié)合所述固定化抗體的第二種抗原，或能夠結(jié)合所述靶抗原的第二種抗體。
6.如權(quán)利要求1的裝置，其中，所述探針選自生色團和熒光團。
7.如權(quán)利要求1的裝置，其中，所述探針包括酶。
8.如權(quán)利要求7的裝置，其中，所述酶包括葡萄糖氧化酶。
9.如權(quán)利要求7的裝置，其中，所述酶包括葡萄糖脫氫酶。
10.如權(quán)利要求7的裝置，其中，所述檢測室還包含酶底物。
11.如權(quán)利要求7的裝置，其中，所述酶底物是可氧化的底物。
12.如權(quán)利要求11的裝置，其中，所述可氧化的底物選自半乳糖和乙酸。
13.如權(quán)利要求11的裝置，其中，所述酶底物包括葡萄糖。
14.如權(quán)利要求7的裝置，其中，所述檢測室還包含一種介體。
15.如權(quán)利要求14的裝置，其中，所述介體選自二氯靛酚和過渡金屬與含氮雜原子物質(zhì)的復(fù)合物。
16.如權(quán)利要求14的裝置，其中，所述介體包括氰鐵酸鹽。
17.如權(quán)利要求7的裝置，其中，所述裝置還包括一種能調(diào)節(jié)樣品pH的緩沖劑。
18.如權(quán)利要求17的裝置，其中，所述緩沖劑選自磷酸鹽和檸檬酸鹽。
19.如權(quán)利要求1的裝置，其中，所述檢測室包括至少兩個電極。
20.如權(quán)利要求1的裝置，其中，所述電極包括選自下列一組的材料鈀、鉑、金、銥、碳、與粘合劑混合的碳、氧化銦、氧化錫、及其混合物。
21.如權(quán)利要求1的裝置，其中，所述檢測室的壁對于由所述探針發(fā)射或吸收的射線來說是可穿透的，該射線是所述報道復(fù)合物在檢測室中存在或缺乏的指標(biāo)。
22.如權(quán)利要求1的裝置，還包括一個能夠檢測反應(yīng)室基本上被充滿的狀態(tài)的檢測儀。
23.如權(quán)利要求1的裝置，還包括一個能夠在檢測室遠(yuǎn)端形成一個檢測室通氣孔的穿孔裝置。
24.如權(quán)利要求1的裝置，還包括位于反應(yīng)室遠(yuǎn)端的反應(yīng)室通氣孔。
25.一種生產(chǎn)用于檢測具有一定pH的流體樣品中的靶抗原的一次性裝置的方法，該方法包括以下步驟形成貫穿第一個片材的具有一個近端和一個遠(yuǎn)端的第一個孔，所述第一個孔確定反應(yīng)室側(cè)壁，檢測室側(cè)壁，以及位于反應(yīng)室遠(yuǎn)端和檢測室近端之間的第一個樣品通道；在所述第一個片材的第一面上安裝一個第一層，并且覆蓋所述孔，以便確定第一反應(yīng)室端壁和第一檢測室端壁；在所述第一個片材的第二面上安裝一個第二層，并且覆蓋所述孔，以便形成基本上與所述第一層重疊對齊的第二反應(yīng)室端壁和第二檢測室端壁，從而由所述片材和層構(gòu)成具有多個外表面的條；形成貫穿所述條的外表面進入所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端的第二通道，由該第二通道確定一個反應(yīng)室通氣孔；形成貫穿所述條的外表面進入所述反應(yīng)室近端的第三通道，由該第三通道確定一個樣品入口；將一種抗體固定在所述反應(yīng)室內(nèi)；以及將一種包括探針的報道復(fù)合物放入所述反應(yīng)室。
26.如權(quán)利要求25的方法，其中，所述第一片材、第一層和第二層包括一種電阻材料，所述第一層包括一個第一電極，其中，第一電極朝向所述第一片材的第一面，而所述第二層包括一個第二電極，其中，第二電極朝向所述片材的第二面。
27.如權(quán)利要求26的方法，其中，所述第二電極與所述第一電極以相對的關(guān)系安裝，二者的間距小于大約500微米。
28.如權(quán)利要求26的方法，其中，所述第二電極與所述第一電極以相對的關(guān)系安裝，二者的間距小于大約150微米。
29.如權(quán)利要求26的方法，其中，所述第二電極與所述第一電極以相對的關(guān)系安裝，二者的間距小于大約150微米，但大于大約50微米。
30.如權(quán)利要求25的方法，其中，所述各層中的至少一個對于選自紅外射線、可見光、和紫外射線的射線的波長來說是可穿透的。
31.如權(quán)利要求25的方法，還包括以下步驟提供一種酶底物和一種介體，其中，所述酶底物和介體被容納在所述檢測室中，其中，所述探針是一種酶，并且，其中所述介體能夠介導(dǎo)所述酶和所述電極之間的反應(yīng)，以便指示一種電化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生。
32.一種生產(chǎn)用于檢測具有一定pH的流體樣品中的靶抗原的一次性裝置的方法，該方法包括形成貫穿第一個電阻材料片的具有一個近端和一個遠(yuǎn)端的第一個孔，所述第一個孔具有一個第一孔反應(yīng)室部分和第一孔檢測室部分，并且確定反應(yīng)室側(cè)壁的第一部分，檢測室側(cè)壁，和位于所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端和檢測室近端之間的樣品通道；形成貫穿第二個電阻材料片的具有一個近端和一個遠(yuǎn)端的第二個孔，由所述第二個孔確定所述反應(yīng)室側(cè)壁的第二部分；形成貫穿第三個電阻材料片的具有一個近端和一個遠(yuǎn)端的第三個孔，由所述第三個孔確定所述反應(yīng)室側(cè)壁的第三部分；將所述第二片材的第一面安裝在所述第一片材的第一面上，所述第二片材覆蓋所述第一孔檢測室部分，從而確定第一檢測室端壁，基本上與反應(yīng)室側(cè)壁的第一部分對齊的反應(yīng)室側(cè)壁的第二部分；將所述第三片材的第一面安裝在所述第一片材的第二面上，所述第三片材覆蓋所述第一孔檢測室部分，從而確定第二檢測室端壁，基本上與反應(yīng)室側(cè)壁的第一部分對齊的反應(yīng)室側(cè)壁的第三部分；在所述第二片材的第二面上安裝一個第一層，并且覆蓋所述第二個孔，以便確定第一個反應(yīng)室端壁；在所述第三片材的第二面上安裝一個第二層，并且覆蓋所述第三孔，以便確定基本上與所述第一薄層重疊對齊的第二反應(yīng)室端壁，從而由所述片材和各層形成具有多個外表面的條；形成貫穿所述條的外側(cè)進入所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端的第二通道，由第二通道確定一個反應(yīng)室通氣孔；形成貫穿所述條的外側(cè)進入所述反應(yīng)室近端的第三通道，由第三通道確定一個樣品入口；將一種抗體固定在所述反應(yīng)室內(nèi)；以及將一種包括探針的報道復(fù)合物放入所述反應(yīng)室。
33.一種用于測定靶抗原在流體樣品中存在或缺乏的方法，該方法包括提供權(quán)利要求1的裝置，其中，所述報道復(fù)合物還包括能夠與所述靶抗原競爭結(jié)合所述固定化抗體的第二種抗原；讓一種流體樣品與所述樣品入口接觸；通過讓所述流體樣品由所述樣品入口流向所述反應(yīng)室，使該樣品基本上將所述反應(yīng)室充滿；保持預(yù)定長度的時間，該時間足以在所述樣品中缺少抗原的情況下基本上使所有報道復(fù)合物都結(jié)合在所述固定化抗體上；通過讓所述流體樣品由所述反應(yīng)室經(jīng)過所述樣品通道流向所述檢測室，使該樣品基本上充滿所述檢測室；檢測所述檢測室中抗原-探針復(fù)合物的存在或缺乏，所述抗原-探針復(fù)合物的存在或缺乏，是所述抗原在所述樣品中存在或缺乏的指標(biāo)。
34.一種用于生產(chǎn)檢測具有一定pH的流體樣品中的靶抗原的一次性裝置的方法，該裝置具有多個外表面，該方法包括形成貫穿第一個電阻材料片的第一個孔，所述第一個孔具有一個檢測室部分，并且確定檢測室側(cè)壁，所述檢測室具有一個近端和一個遠(yuǎn)端；在所述第一片材的第一面上安裝一個第一層，并且覆蓋所述孔，以便確定第一檢測室端壁；在所述第一片材的第二面上安裝一個第二層，并且覆蓋所述孔，以便確定基本上與所述第一層重疊對齊的第二檢測室端壁，從而由所述片材和各層形成一個條；形成貫穿所述條的第二個孔；所述條具有一個近端和一個遠(yuǎn)端，所述第二個孔具有一個反應(yīng)室部分，該反應(yīng)室部分具有一個遠(yuǎn)端和一個近端，并且由所述第二個孔確定反應(yīng)室側(cè)壁和位于所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端和所述檢測室近端之間的樣品通道；將第三層的第一面安裝在所述條的第一面上，所述第三層覆蓋所述第二孔反應(yīng)室部分，以便確定第一個反應(yīng)室端壁；將第四層的第一面安裝在所述條的第二面上，所述第四層覆蓋所述第二孔反應(yīng)室部分，以便確定基本上與所述第一反應(yīng)室端壁對齊的第二個反應(yīng)室端壁；形成貫穿所述裝置的一個表面進入所述反應(yīng)室遠(yuǎn)端的第三個孔，所述第三個孔確定一個反應(yīng)室通氣孔；形成貫穿所述裝置的一個表面進入所述反應(yīng)室近端的第四個孔，由所述第四孔確定一個樣品入口；將一種抗體固定在所述反應(yīng)室內(nèi)；以及將包括一種探針的報道復(fù)合物放入所述反應(yīng)室。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量的、廉價的、一次性免疫傳感器20，該傳感器不需要洗滌步驟，因此不會產(chǎn)生液體廢物。另外，在傳感器20的優(yōu)選實施方案中，用戶不需要計時步驟，并且傳感器20能夠方便地適應(yīng)廣泛的動力學(xué)范圍內(nèi)的抗原－抗體相互作用。
文檔編號G01N33/84GK1441905SQ01812804
公開日2003年9月10日 申請日期2001年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月14日
發(fā)明者A·霍格斯, R·查特利爾 申請人:生命掃描有限公司