專利名稱：糖液的制造方法及其裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及由纖維素制造糖液的方法及其裝置。
背景技術：
以糖為原料的化學品發(fā)酵生產工藝被用于各種工業(yè)原料生產中。作為該成為發(fā)酵原料的糖，現在工業(yè)上使用來源于甘蔗、淀粉、甜菜等食用原料的糖，但是從今后世界人口增加引起食用原料價格暴漲、或與食用競爭這樣的倫理方面出發(fā)，構建由可再生的非食用資源、即含纖維素的生物質來有效地制造糖液的工藝，或者以所得的糖液為發(fā)酵原料有效地轉換成工業(yè)原料的工藝成為今后的課題。作為由含纖維素的生物質制造糖液的方法，公開了使用濃硫酸將纖維素和半纖維 素進行酸水解來制造糖液的方法(專利文獻I或2);通過將含纖維素的生物質用稀硫酸進行水解處理之后再用纖維素酶等進行酶處理來制造糖液的方法(非專利文獻I)。此外，作為不使用酸的方法，公開了 使用250 500°C左右的亞臨界水將含纖維素的生物質進行水解來制造糖液的方法(專利文獻3);通過在對含纖維素的生物質進行亞臨界水處理之后再進行酶處理來制造糖液的方法(專利文獻4);以及通過在將含纖維素的生物質用240 280°C的加壓熱水進行水解處理之后再進行酶處理來制造糖液的方法(專利文獻5)。近年來，特別廣泛研究了能量使用量和環(huán)境負荷少、且糖收量多的使用酶的生物質的水解方法。然而，作為這樣的使用酶的方法的缺點，存在酶費高這樣的課題。作為解決這樣的技術課題的方法，提出了將水解所使用的酶回收再利用的方法。公開了例如利用自旋過濾器進行連續(xù)固液分離，將所得的糖液通過超濾膜進行過濾，從而回收酶的方法(專利文獻6);通過在酶糖化的階段加入表面活性劑來抑制酶吸附，從而提高回收效率的方法(專利文獻7);將酶糖化后的殘渣進行通電處理從而回收酶成分的方法(專利文獻8);將酶糖化后的殘渣再次加入到新的生物質中從而將酶進行回收再利用的方法(專利文獻9)等?，F有技術文獻專利文獻專利文獻I:日本特表平11-506934號公報專利文獻2:日本特開2005-229821號公報專利文獻3:日本特開2003-212888號公報專利文獻4:日本特開2001-95597號公報專利文獻5:日本特許3041380號公報專利文獻6:日本特開2006-87319號公報專利文獻7:日本特開昭63-87994號公報專利文獻8:日本特開2008-206484號公報專利文獻9:日本特開昭55-144885號公報非專利文獻
非專利文獻I: A. Aden 等，“Lignocellulosic Biomass to Ethanol ProcessDesign and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis andEnzymatic Hydrolysis for Corn Stover，，NREL Technical Report(2002)

發(fā)明內容
發(fā)明要解決的課題如上所述，對于使用酶的纖維素的水解方法進行了開發(fā)，但在削減酶使用量這樣的觀點中，其效果不充分。因此，本發(fā)明的課題是開發(fā)提高現有的方法中的酶使用量的削減效果的工藝。用于解決課題的方法本發(fā)明具有以下[I] [11]的構成?！I]糖液的制造方法，其特征在于，是重復包含以下工序(I) (3)的糖液制造工藝而制造糖液的方法，其中，將工序(3)所得的回收酶在下次以后的糖液制造工藝的工序
(I)中使用，(I)在纖維素中添加來源于絲狀菌的纖維素酶而進行一次水解的工序；(2)在工序(I)的水解物中添加未使用的來源于絲狀菌的纖維素酶而進行二次水解的工序；以及(3)將工序(2)的水解物進行固液分離，從所得的糖液中獲得回收酶的工序。[2]根據[I]所述的糖液的制造方法，其特征在于，作為糖液制造工藝中的上述工序(I)中的來源于絲狀菌的纖維素酶，使用從利用來源于絲狀菌的纖維素酶獲得的纖維素水解物中回收的回收酶成分。[3]根據[I]或[2]所述的糖液的制造方法，其特征在于，上述工序⑴或⑵中的來源于絲狀菌的纖維素酶包含來源于木霉屬微生物的培養(yǎng)液的成分。[4]根據[I] [3]的任一項所述的糖液的制造方法，其特征在于，上述回收酶包含木聚糖酶和/或木糖苷酶。[5]根據[I] [4]的任一項所述的糖液的制造方法，其特征在于，上述回收酶包含水不溶性的來源于絲狀菌的纖維素酶。[6]根據[I] [5]的任一項所述的糖液的制造方法，其特征在于，上述纖維素是將含纖維素的生物質進行堿處理、水熱處理或稀硫酸處理而得的處理物。[7]根據[I] [6]的任一項所述的糖液的制造方法，其特征在于，一次水解和二次水解中的酶添加量滿足以下關系式工序(I)中的回收酶的添加量>工序(2)中的未使用酶量的添加量。[8]根據[I] [7]的任一項所述的糖液的制造方法，其特征在于，上述工序(3)中的來源于絲狀菌的纖維素酶的回收，是將糖液通過超濾膜進行過濾，從非透過側回收。[9]裝置，是用于包含水解纖維素的工序的糖液的制造方法的裝置，其中，作為構成，包含連接了回收酶投入配管和未使用酶投入配管的水解槽、將水解物進行固液分離的裝置、具有用于超濾膜的洗滌和/或保持在循環(huán)配管內的回收酶的除去的水供給配管的糖液保持罐、以及用于分離酶與糖液的超濾膜裝置。[10]裝置，是用于包含水解纖維素的工序的糖液的制造方法的裝置，其中，作為構成，包含用于將回收酶與纖維素混合而進行一次水解的纖維素/回收酶混合裝置、連接了纖維素/回收酶混合物供給配管和未使用酶投入配管的水解槽、將水解物進行固液分離的裝置、具有用于超濾膜的洗滌和/或保持在循環(huán)配管內的回收酶的除去的水供給配管的糖液保持罐、和用于分離酶與糖液的超濾膜裝置。[11]裝置，作為構成，除了 [9]或[10]所述的裝置構成之外，進一步包含濃縮糖液的反滲透膜和/或納濾膜裝置。發(fā)明的效果在回收再利用纖維素酶的纖維素的水解方法中，通過在添加未使用酶之前，實施添加回收酶的一次水解，接著進一步添加未使用酶進行二次水解，從而可以大幅削減水解時使用的酶量，進而來自含纖維素的生物質的糖生成效率大幅提高。



圖I是顯示本發(fā)明的水解方法中的步驟的概略圖。圖2是顯示本發(fā)明中使用的裝置的概略圖。圖3是顯示本發(fā)明中使用的裝置的概略圖。圖4是顯示本發(fā)明中使用的裝置的概略圖。圖5是顯示本發(fā)明中使用的裝置的概略圖。圖6是顯示本發(fā)明中使用的裝置的概略圖。圖7是顯示本發(fā)明中使用的裝置的概略圖。圖8是顯示本發(fā)明中使用的裝置的概略圖。圖9是顯示本發(fā)明中使用的裝置的概略圖。圖10是顯示本發(fā)明中使用的裝置的概略圖。圖11是顯示將水不溶性的來源于木霉屬的纖維素酶成分進行SDS-PAGE的結果的圖。
具體實施例方式纖維素在甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸、稻秸、麥秸等草本系生物質、或樹木、廢建材等木質系生物質中大量含有，在本發(fā)明中，優(yōu)選利用這些含纖維素的生物質作為原料。含纖維素的生物質中，除了纖維素和半纖維素(以下作為纖維素和半纖維素的總稱稱為“纖維素”)之外，還含有作為芳香族高分子的木質素等，因而在本發(fā)明的糖液的制造方法中以來源于生物質的纖維素為糖液的原料的情況下，可以通過進行前處理來提供利用酶的水解效率。作為含纖維素的生物質的前處理方法，可列舉酸處理、硫酸處理、稀硫酸處理、堿處理、苛性鈉處理、水熱處理、亞臨界水處理、微粉碎處理、蒸煮處理，但在本發(fā)明中優(yōu)選堿處理、水熱處理或稀硫酸處理。堿處理有作為堿使用氫氧化鈉、氫氧化鈣、氨等堿的方法，但可以特別優(yōu)選使用氨。這樣的氨處理可以通過日本特開2008-161125號公報和日本特開2008-535664號公報所記載的方法實施。例如，使用的氨濃度相對于生物質以0. I 15重量％的范圍添加，在4 200°C、優(yōu)選為90 150°C進行處理。添加的氨可以是液體狀態(tài)、或氣體狀態(tài)的任一者。進而添加的方式可以是純氨也可以是氨水溶液的方式。對處理次數不特別限定，將上述處理進行I次以上即可。特別是在將上述處理進行2次以上的情況下，第I次與第2次以后的處理可以在不同條件下實施。通過氨處理所得的處理物為了進一步進行利用酶的水解反應，需要進行氨的中和或氨的除去。中和可以對從水解物通過固液分離而除去固體成分后的氨進行，也可以在含有固體成分的狀態(tài)下直接進行。對中和所使用的酸試劑不特別限定。氨的除去可以通過將氨處理物保持在減壓狀態(tài)下使氨以氣體狀態(tài)揮發(fā)而除去。另外除去的氨可以回收再利用。在水熱處理的情況下，以含纖維素的生物質為0. I 50重量％的方式添加水，然后100 400°C的溫度下處理I秒 60分鐘。通過在這樣的溫度條件下處理，從而纖維素的水解發(fā)生。對處理次數不特別限定，將該處理進行I次以上即可。特別在將該處理進行2次以上的情況下，第I次與第2次以后的處理可以在不同條件下實施。在稀硫酸處理的情況下，硫酸的濃度優(yōu)選為0. I 15重量％，更優(yōu)選為0. 5 5重量％。反應溫度可以在100 300°C的范圍內設定，優(yōu)選在120 250°C設定。反應時間可以在I秒 60分鐘的范圍內設定。對處理次數不特別限定，將上述處理進行I次以上即 可。特別是在將上述處理進行2次以上的情況下，第I次與第2次以后的處理可以在不同條件下實施。稀硫酸處理所得的水解物含有酸，為了進一步進行利用纖維素酶的水解反應，或為了作為發(fā)酵原料使用，需要進行中和。本發(fā)明的特征在于，將上述的纖維素通過來源于絲狀菌的纖維素酶進行水解。纖維素的水解是指，通過纖維素酶的作用使纖維素低分子量化，生成單糖或寡糖。作為水解的反應條件，只要依據纖維素酶的優(yōu)選反應條件進行即不限定，一般反應溫度優(yōu)選為15°C IOO0C的范圍，更優(yōu)選為40°C 60°C，進一步優(yōu)選為50°C。水解的pH值優(yōu)選為pH值3 9的范圍，更優(yōu)選為pH值4 5. 5，進一步優(yōu)選為pH值5。pH值調整可以通過添加酸或堿至所需的PH值來調整。另外，可以使用適宜的緩沖液。在水解中，為了促進纖維素與酶的接觸，另外為了使水解物的糖濃度均勻，優(yōu)選進行攪拌混合。纖維素的固體成分濃度優(yōu)選加水至I 25重量％的范圍，更優(yōu)選8 20重量％的范圍。作為來源于絲狀菌的纖維素酶，可以例示木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、梭菌屬(Clostridium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、腐質霉屬(Humicola)、枝頂孢霉屬(Acremonium)、fE齒菌屬(Irpex)、毛霉屬(Mucor)、籃狀菌屬(Talaromyces)、平革菌屬(Phanerochaete)、白腐菌、褐腐菌等。在這樣的來源于絲狀菌的纖維素酶的中，優(yōu)選使用纖維素分解活性高的來源于木霉屬的纖維素酶。來源于木霉屬的纖維素酶是以來源于木霉屬微生物的纖維素酶為主成分的酶組合物。對木霉屬微生物不特別限定，優(yōu)選為里氏木霉(Trichoderma reesei),具體可以例不里氏木霉 QM9414 (Trichoderma reesei QM9414)、里氏木霉 QM9123 (Trichodermareesei QM9123)、里氏木霉 RutC-30 (Trichoderma reesei Rut C-30)、里氏木霉ATCC68589(Trichoderma reeseiATCC68589)、里氏木霉 PC3-7(Trichoderma reeseiPC3-7)、里氏木霉 CL-847 (Trichoderma reeseiCL-847)、里氏木霉 MCG77 (Trichodermareesei MCG77)、里氏木霉 MCG80(Trichoderma reesei MCG80)、綠色木霉QM9123 (Trichoderma viride 9123)。另外,還可以是對來源于上述木霉屬的微生物通過突變劑或紫外線照射等進行突變處理，從而纖維素酶生產性提高了的突變株。本發(fā)明中使用的來源于絲狀菌的纖維素酶，是包含纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、3 -葡糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶等多種酶成分的、具有將纖維素水解并糖化的活性的酶組合物。來源于絲狀菌的纖維素酶在纖維素分解中，通過多種酶成分的協同效果或互補效果，從而可以進行有效的纖維素的水解。纖維二糖水解酶是以從纖維素的末端部分開始水解下去為特征的纖維素酶的總稱，作為EC編號EC3. 2. I. 91記載了歸屬于纖維二糖水解酶的酶群。內切葡聚糖酶是以從纖維素分子鏈的中央部分開始水解為特征的纖維素酶的總稱，作為 EC 編號EC3. 2. I. 4、EC3. 2. I. 6、EC3. 2. I. 39、EC3. 2. I. 73 記載了歸屬于內切葡聚糖酶的酶群。外切葡聚糖酶是以從纖維素分子鏈的末端開始水解為特征的纖維素酶的總稱，作為EC編號EC3. 2. 1.74、EC3. 2. I. 58記載了歸屬于外切葡聚糖酶的酶群。 ^ -葡糖苷酶是以作用于纖維寡糖或纖維二糖為特征的纖維素酶的總稱，作為EC編號EC3. 2. I. 21記載了歸屬于P -葡糖苷酶的酶群。木聚糖酶是以作用于半纖維素或特別作用于木聚糖為特征的纖維素酶的總稱，作為EC編號EC3. 2. I. 8記載了歸屬于木聚糖酶的酶群。木糖苷酶是以作用于木寡糖為特征的纖維素酶的總稱，作為EC編號EC3. 2. I. 37記載了歸屬于木糖苷酶的酶群。作為來源于木霉屬的纖維素酶，優(yōu)選使用包含來源于木霉屬微生物的培養(yǎng)液的成分的物質。來源于木霉屬的培養(yǎng)液的成分包含在以使木霉屬的微生物產生纖維素酶的方式調制的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而得的培養(yǎng)液所含的纖維素酶以外的全部成分。即，可以例示纖維素酶以外的酶成分、木霉屬微生物菌體、培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基成分等。特別作為培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基成分，可以例示葡萄糖或木糖等單糖、玉米衆(zhòng)、酵母提取液(yeast extract)、纖維素等的纖維素酶生產誘導物質、礦物、維生素成分等。作為來源于木霉屬微生物的培養(yǎng)液的成分，還可以包含木霉屬微生物菌體。這是因為，通過包含木霉屬微生物菌體作為本發(fā)明的來源于木霉屬的纖維素酶的成分，可以增大回收酶的活性量。對來源于木霉屬的纖維素酶中的各酶成分的重量比不特別限定，例如，來源于里氏木霉的培養(yǎng)液中包含50 95重量％的纖維二糖水解酶，殘余成分中包含內切葡聚糖酶、P -葡糖苷酶、外切-1，4- & -D-氨基葡糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶、內切-1，4-甘露糖苷酶、I, 2-Q-甘露糖苷酶、a -葡糖醛酸糖苷酶、殼聚糖酶、殼多糖酶、I, 4-a-葡糖苷酶、a -半乳糖苷酶、^ -半乳糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木聚糖酯酶、擴張蛋白(swollenin)、疏水蛋白(hydrophobin)等。另外，木霉屬的微生物在培養(yǎng)液中生產強的纖維素酶成分，另一方面關于￠-葡糖苷酶，由于保持在細胞內或細胞表層，因而培養(yǎng)液中的￠-葡糖苷酶活性低，因此除了本來保有的來源于木霉屬的纖維素酶成分之外，可以進一步添加異種或同種的￠-葡糖苷酶。作為異種的￠-葡糖苷酶，可以優(yōu)選使用來源于曲霉屬的￠-葡糖苷酶。作為來源于曲霉屬的￠-葡糖苷酶，可以例示由7^社市售的NovozymelSS等。作為添加異種或同種的￠-葡糖苷酶的方法，可以是培養(yǎng)以在木霉屬的微生物導入基因使其在其培養(yǎng)液中產生3-葡糖苷酶的方式進行基因重組而得的木霉屬的微生物，分離其培養(yǎng)液的方法。
本發(fā)明的特征在于，將利用上述的來源于絲狀菌的纖維素酶的纖維素的水解分成一次水解和二次水解來實施。以下按照工序依次進行說明。本發(fā)明中的一次水解是指對未進行酶處理的纖維素添加來源于絲狀菌的纖維素酶進行水解。作為一次水解而使用的酶可以是后述的未使用酶也可以是回收酶，但由于通過使用回收酶可以提高糖生成效率，因而優(yōu)選使用回收酶。作為通過在一次水解中使用回收酶來提高糖生成效率的機理，回收酶中包含由于水解時的熱而一部分結構變性的酶成分，這樣的酶成分對纖維素的表面存在的吸附點的吸附特別強，作為結果，非特異性地吸附于纖維素中的木質素等的吸附性的表面部位。因此，可以抑制之后投入的未使用酶成分的非特異吸附。一般地，如果比較回收酶和未使用酶在纖維素酶分解中的比活性(單位蛋白質重量的酶活性)，則未使用酶顯示高活性。即，能夠抑制這樣的比活性更高的未使用酶成分的非特異性的吸附的結果，可以提高糖生產性和酶的回收效率。另外，作為第2的理由，本發(fā)明的回收酶具有每重復回收次數而木聚糖分解活性升高這樣的特征?；厥彰杆哪揪厶欠纸饣钚钥梢酝ㄟ^使用來源于樺樹的木聚糖(Birch wood xylan)等的試劑木聚糖作為分解底物來測定。作為與木聚糖分解活性相關的來源于絲狀菌的纖維素酶成分，有木聚糖酶和木糖苷酶。作為木聚糖酶，存在xynl (GHll)、xyn2(GHll)、xyn3 (GHlO)、xyn4 (GH5)、 xyn5b(GH5)、xynl I (GHll)的基因。作為木糖苷酶，存在 bxll/bxl3a(GH3)、bxl3b(GH3)、bxl3c(GH3)的基因。上述基因分別編碼木聚糖酶和木糖苷酶，作為來源于絲狀菌的纖維素酶成分而含有。特別作為回收酶被提高了的木聚糖分解酶，可以例示木聚糖酶3(分子量38kDa、xyn3)、內切-I, 4-木聚糖酶(分子量25kDa、xynl)、^ -木糖苷酶(分子量88kDa、bxll/bxl3a)。通過將這樣的木聚糖分解活性被提高了的回收酶添加在一次水解中，從而包圍纖維素的木聚糖成分優(yōu)先被水解，可以提高一次和二次水解中的糖生產性?！嗡獾姆磻獣r間優(yōu)選為15分鐘 6小時的范圍。如果少于15分鐘,則有時糖生成效率的提高程度降低，另一方面，如果為6小時以上，則有時相對于時間的糖生成效率降低。對纖維素濃度、反應溫度和PH值不特別限定，優(yōu)選可以應用上述的水解條件。一次水解中的酶添加量優(yōu)選相對于纖維素前處理物重量為1/1000 1/50的量。纖維素前處理物的重量可以通過測定纖維素前處理物所含的固體成分的重量來計算出。這樣的固體成分的重量可以通過將前處理物用離心分離、膜過濾等的方法進行固液分離和水洗滌，從而分離除去水溶性化合物，然后將所得的含水固體干燥至重量恒定，測定其重量，從而計算出。另外，酶添加量可以通過用BCA法測定包含未使用酶的溶液中的蛋白質濃度，將該蛋白質濃度乘以添加的未使用酶的溶液量，從而計算出。 一次水解所得的一次水解物中積累了水解所生成的單糖成分。特別是在一次水解中使用回收酶的情況下，木聚糖分解活性傾向于提高。即，在一次水解中使用回收酶時的一次水解物具有大量生成木糖這樣的特征。通過本發(fā)明的一次水解獲得的一次水解物可以直接在該狀態(tài)下或在進行了固液分離等提高未分解的固體物濃度的操作之后，進行后述的二次水解。另外在一次水解之后進行固液分離的情況下，分離所得的溶液成分可以作為糖液利用。本發(fā)明中的二次水解是指相對于上述的一次水解所得的水解物進一步添加未使用酶而進行水解。對一次水解物，不需要進行特別的固液分離操作。另外，根據需要，也可以進一步添加水，但不特別限定。
在本發(fā)明中，將未使用酶在二次水解中投入和使用。作為其目的，可列舉I)通過一次水解中的投入酶量(未使用酶或回收酶)纖維素的分解效率不充分，因而通過追加投入來獲得充分的纖維素分解效率，2)分成一次水解和二次水解的2次，通過投入未使用酶可以提高糖生成效率和酶回收效率，作為其目的。另外特別是在僅實施使用回收酶的一次水解的情況下，第2次以后的糖生產量減少，因此不優(yōu)選。因此，通過除了回收酶，在二次水解中進一步投入未使用酶，可以進行與第I次、或上一次的糖生產量同等的生產。即在本糖液的制造方法中，可以重復進行一定以上的糖濃度的生產。二次水解中的未使用酶的添加可以分多次投入(分開投入)。例如，可考慮一次水解結束后，投入應在二次水解中添加的未使用酶量的一半，進行數小時水解之后，進一步投入剩余的一半等的方法。在本發(fā)明中，即使如這樣在二次水解中分幾次分開投入新酶，也將這些操作總稱為二次水解。二次水解的反應時間優(yōu)選比一次水解長。另外，作為具體的二次水解的反應時間，優(yōu)選為I 200小時的范圍，更優(yōu)選為6 72小時的范圍，進一步優(yōu)選為12 24小時的范·圍。反應時間是應根據酶的使用量、反應溫度、和目的糖濃度等調整的事項，但在考慮纖維素酶的回收再利用的情況下，如果反應時間超過200小時，則有時發(fā)生纖維素酶的熱失活。另一方面，如果反應時間不足I小時，則有時不能獲得充分的糖濃度的水解物。二次水解中的酶添加量優(yōu)選相對于纖維素前處理物重量為1/1000 1/50的量。關于纖維素前處理物重量，可以用上述一次水解前的纖維素前處理物的固體成分的重量來計算出。關于一次水解和二次水解中的酶添加量，優(yōu)選滿足以下關系式一次水解中的酶添加量>二次水解中的酶添加量。這里所說的添加量，可以通過對添加的未使用酶或回收酶的蛋白質濃度乘以投入的酶溶液量來計算出。蛋白質濃度的測定可以通過上述的公知的方法來計算出回收酶以及未使用酶的蛋白質濃度。這里所說的蛋白質濃度單純地是蛋白質濃度，不限定其是來源于纖維素酶的成分還是其他成分。在本發(fā)明中，在滿足該添加量的關系式時，可以獲得更多的糖生產量，另外酶的回收效率也可以進一步提高。另外本發(fā)明的特征在于，具有將二次水解物進行固液分離，從所得的糖液中回收來源于絲狀菌的纖維素酶的工序，和將回收的來源于絲狀菌的纖維素酶在一次水解中再利用的工序。以下，按工序依次說明。二次水解物的固液分離是為了分離二次水解所得的糖液和水解殘渣而進行的。糖液是指通過上述的纖維素的水解而得的糖溶液。一般糖根據單糖的聚合度來分類，可分類為葡萄糖、木糖等單糖類，2 9個單糖脫水縮合而成的寡糖類，以及10個以上單糖脫水縮合而成的多糖類。本發(fā)明所得的糖液中包含葡萄糖或木糖作為主成分，另外雖然為少量但也包含纖維二糖等寡糖、和阿拉伯糖、甘露糖等單糖。作為具體的溶解于水的單糖、寡糖、多糖的分析方法，可以利用HPLC通過與標準品的比較來定量。對固液分離的方法不特別限定，可以通過螺旋沉降器等的離心法、壓濾機等的過濾法、精濾膜等的膜分離法來進行固液分離。另外，來源于絲狀菌的纖維素酶在二次水解物中以溶解于糖液的狀態(tài)或吸附于作為未分解物的固體殘渣上的狀態(tài)的任一狀態(tài)存在，可以將這樣的來源于絲狀菌的纖維素酶通過固液分離從糖液側回收。作為從糖液中回收來源于絲狀菌的纖維素酶的方法，可列舉將糖液通過超濾膜進行過濾，從非透過側回收纖維素酶的方法作為優(yōu)選例。作為使用的超濾膜，可以使用聚醚砜(PES)、聚1，I-二氟乙烯(PVDF)、再生纖維素等原料的膜，由于再生纖維素受到纖維素酶的分解，因而優(yōu)選使用以PES、PVDF等合成高分子為原料的超濾膜。超濾膜的截留分子量只要能夠有效地回收所使用的纖維素酶即可，不特別限定，優(yōu)選為截留分子量1000 50000的范圍的超濾膜?；厥彰噶扛鶕嗡庵刑砑拥奈词褂妹傅奶砑恿慷浠厥彰噶堪l(fā)生變動，因此不特別限定。在重復本發(fā)明中的回收再利用的操作中，特別是在利用超濾膜的回收酶的分離過程中，有時作為回收酶成分得到水不溶性的來源于絲狀菌的纖維素酶成分。這樣的水不溶性的來源于絲狀菌的纖維素酶成分是在水解中的過程、或利用超濾膜等的酶回收的過程中生成的酶成分。這樣的水不溶性的來源于絲狀菌的纖維素酶成分優(yōu)選不通過固液分離、過濾等除去，而直接作為回收酶成分使用。作為水不溶性的來源于絲狀菌的纖維素酶成分，主要由纖維二糖水解酶構成。水不溶性是指在回收酶液中作為沉淀、絮凝物、顆粒、微粒的狀態(tài)存在，通過將回收酶裝入管中進行離心處理，可以將水不溶性的來源于絲狀菌的纖維素酶成分作為沉淀分離。作為沉淀回收的水不溶性的來源于絲狀菌的纖維素酶成分可以以白色、淡黃色、褐色、等顏色確認?？梢苑蛛x水不溶性的來源于絲狀菌的纖維素酶成分，通過再懸浮于水中而使其一部分溶解。但是，為了使其完全溶解，需要添加尿素、表面活性劑 (十二燒基硫酸鈉、Tween80、Triton X等)。通過將包含這樣的水不溶性的來源于絲狀菌的纖維素酶成分的回收酶在一次水解中再利用，可以獲得更高的糖生產性。從二次水解物中回收的來源于絲狀菌的纖維素酶(以下稱為回收酶)在一次水解中被再利用。在一次水解中使用回收酶的優(yōu)點如上所述。對于回收酶的再利用次數不特別限定。在本發(fā)明中，將來自二次水解物的回收酶在一次水解中再利用時的酶添加量優(yōu)選多于二次水解中的未使用酶的添加量。這里的酶添加量如上所述通過蛋白質的量來測定。一般地，回收酶的纖維素酶活性(相對于蛋白質的量酶活性)低于未使用酶的纖維素酶活性，但在本發(fā)明中，在一次水解中再利用的回收酶添加量>二次水解中的未使用酶添加量的情況下，相對于未使用酶量的糖生成效率增大。由本發(fā)明獲得的糖液中包含來源于纖維素、半纖維素(木聚糖、阿拉伯聚糖)的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等單糖。對單糖的構成比率不特別限定，主要的單糖成分是葡萄糖和木糖。本發(fā)明的糖液中雖然與單糖相比為微量，但也包含纖維二糖等寡糖等。對糖液所含的單糖濃度不特別限定，優(yōu)選為0. I 20重量％，進一步優(yōu)選為5 20重量％。如果糖液濃度在5 20重量％的范圍內，則糖液不需要特別的濃縮就可以作為微生物的發(fā)酵原料使用。本發(fā)明的糖液可以通過納濾膜和/或反滲透膜進行濃縮。本發(fā)明中使用的納濾膜或反滲透膜的原料可以使用乙酸纖維素系聚合物、聚酰胺、聚酯、聚酰亞胺、乙烯基聚合物、聚砜等高分子原料，但不限于由上述I種原料構成的膜，可以是包含多種膜原料的膜。本發(fā)明中使用納濾膜優(yōu)選使用螺旋型的膜元件。作為優(yōu)選的納濾膜元件的具體例，可列舉例如，作為乙酸纖維素系的納濾膜元件的GE Osmonics社制GEs印a、以聚酰胺為功能層的r > 7 r ^ K &社制納濾膜元件NF99或NF99HF、以交聯哌嗪聚酰胺為功能層的y ^ y夕社制納濾膜元件NF-45、NF-90、NF-200、NF-270或NF-400、或包含以交聯哌嗪聚酰胺為主成分的東 > 株式會社制納濾膜UTC60的東 > 株式會社制納濾膜元件SU-210、SU-220、SU-600 或 SU-610，更優(yōu)選為 NF99 或 NF99HF、NF-45、NF-90、NF-200 或 NF-400、或SU-210、SU-220、SU-600 或 SU-610，進一步優(yōu)選為 SU-210、SU-220、SU-600 或 SU-610。另外，本發(fā)明中使用的反滲透膜與納濾膜同樣地優(yōu)選使用螺旋型的膜元件。作為優(yōu)選的反滲透膜元件的具體例，可列舉例如，作為東 > 株式會社制聚酰胺系反滲透膜組件的低壓型的 SU-710、SU-720、SU-720F、SU-710L、SU-720L、SU-720LF、SU-720R、SU-710P、SU-720P,以及包含作為反滲透膜的UTC70的高壓型的SU-810、SU-820、SU-820L、SU_820FA、東 > 株式會社制乙酸纖維素系反滲透膜SC-L100R、SC-L200R、SC-1100、SC-1200、SC-2100、SC-2200、SC-3100、SC-3200、SC-8100、SC-8200、日東電工(株)制 NTR-759HR、NTR-729HF、NTR-70SWC、ES10-D、ES20-D、ES20-U、ES15-D、ES15-U、LF10-D、r ^ 7 r 7 八卟制 R098pHt、R099、HR98PP、CE4040C-30D、GE 制 GE Sepa, Filmtec 制 BW30-4040、TW30-4040、XLE-4040、LP-4040、LE-4040、SW30-4040,SW30HRLE-4040 等。關于用于實施利用本發(fā)明的酶水解纖維素的糖液的制造方法的裝置，參考附圖進·行具體說明。本發(fā)明的裝置的特征在于，作為用于實施上述糖液的制造方法的裝置機構，是將以下I 4功能性地連接而成的裝置構成1.連接有回收酶投入配管和未使用酶投入配管的水解槽、2.將水解物進行固液分離的裝置、3.具有用于超濾膜的洗滌和/或保持在循環(huán)配管內的回收酶的除去的水供給配管的糖液保持罐、4.用于分離酶和糖液的超濾膜裝置。即本發(fā)明的糖液的制造方法的特征在于，進行使用回收酶的一次水解。為了實施該水解，設置了 I.連接有回收酶投入配管和未使用酶投入配管的水解槽。接著，為了分離水解物所含的回收酶，設置了 2.將水解物進行固液分離的裝置、和4.用于分離酶和糖液的超濾膜裝置。進而為了在除去回收的回收酶液的同時進行超濾膜的洗滌，設置了 3.具有用于超濾膜的洗滌和/或保持在循環(huán)配管內的回收酶的除去的水供給配管的糖液保持罐。以下作為更具體的裝置實施例，例示圖2 圖10，以下進行說明。圖2是實施本發(fā)明的方法的裝置的一例。即，圖2的裝置是包含獨立地連接有回收酶投入配管4和未使用酶投入配管6的水解槽I、以及將水解物進行固液分離的壓濾裝置9、具有用于超濾膜的洗滌和/或保持在循環(huán)配管15內的回收酶的除去的水供給配管11的糖液保持罐12、和用于分離酶與糖液的超濾膜裝置14作為構成的裝置，其中，所述回收酶投入配管4能夠將回收酶獨立地投入水解槽、或能夠進一步控制投入，未使用酶投入配管6能夠將未使用酶獨立地投入水解槽，或能夠進一步控制投入。水解槽I進一步設置了用于保持水解的溫度的保溫設備2、用于攪拌混合木質纖維素的攪拌翼3、纖維素投入口 7。回收酶投入配管4和未使用酶投入配管6分別介由閥與回收酶保持罐5和未使用酶保持罐8連接。閥優(yōu)選為夾管閥并被另外電子控制。上述的水解槽I與將水解進行分離的壓濾裝置9經由閥和空氣泵等連接，向壓濾裝置9內送液水解物。壓濾裝置9與用于供給過濾壓力的壓縮機10連接。通過壓濾獲得的糖液被保持在糖液保持罐12中。糖液保持罐12介由循環(huán)泵13與超濾膜裝置14連接。通過到超濾膜的膜側(非透過側)的回收酶經由循環(huán)配管15返回糖液保持罐12。除去了酶的糖溶液在二次側(透過側)作為濾液被回收。被回收至糖液保持罐12的回收酶經由回收酶配管16和泵被送液至回收酶保持罐5。由水供給配管11向糖液保持罐12供水，使該水通過循環(huán)泵13在超濾膜裝置14以及循環(huán)配管15中循環(huán)，從而將保持在超濾膜的表面或循環(huán)配管15內的回收酶成分進一步作為溶液回收，因此是有效率的。另外，還可以回收附著于超濾膜表面等的水不溶性的來源于絲狀菌的纖維素酶成分。進而另外，該水的循環(huán)還可以洗滌超濾膜裝置14所具備的超濾膜的表面，對膜污染的抑制也發(fā)揮作用。進一步通過該操作而保持在糖液保持罐12中的水經由回收酶配管16被送入回收酶保持罐5。因此，由水供給配管11供給的水可以在水解槽I中的木質纖維素的水解中使用。圖3是實施本發(fā)明的方法的裝置的另外一例。即，圖3記載的裝置是包含水解槽I、將水解物進行固液分離的壓濾裝置9、具有用于超濾膜的洗滌和/或保持在循環(huán)配管15內的回收酶的除去的水供給配管11的糖液保持罐12、和用于分離酶與糖液的超濾膜裝置14作為構成的裝置，所述水解槽I獨立地連接有用于將回收酶與纖維素混合而進行一次水解的纖維素/回收酶混合裝置18、纖維素/回收酶混合物投入配管17和未使用酶投入配管6。與圖2的裝置的不同點是，纖維素/回收酶混合裝置18、及其供給口 17。纖維素/回收酶混合裝置18是用于將纖維素與回收酶混合的裝置，其中，通過內部螺旋而將回收酶與纖維素攪拌混合。在纖維素/回收酶混合裝置18中，進行工序(I)的一次水解。纖維素/回 收酶混合裝置18可以被保溫在適合一次水解的溫度。另外也可以將回收酶預先保溫，使其在纖維素/回收酶混合裝置18內與纖維素混合來進行一次水解。通過在該纖維素/回收酶混合裝置18中預先實施回收酶與纖維素的混合，可以削減水解槽I中的攪拌混合動力消耗。另外通過在纖維素/回收酶混合裝置18中預先實施回收酶與纖維素的混合，還可以縮短水解槽I中纖維素的均勻分散化所花費的時間，作為結果可以進一步縮短水解時間。進而從纖維素/回收酶混合裝置18獲得的一次水解物通過纖維素/回收酶混合物供給配管17而被投入水解裝置I中。然后，由未使用酶投入配管6添加工序(2)的未使用的含有來源于絲狀菌的纖維素酶的酶進行二次水解。關于之后的固液分離、和酶回收操作，與圖2的裝置相同。圖4是實施本發(fā)明的方法的裝置的另外一例。圖4的裝置是對上述圖2的裝置設置包含壓濾機的固液分離裝置19時的裝置。另外，關于圖2所述的回收酶保持罐5、未使用酶保持罐8、攪拌翼3，根據需要設置即可，因此在圖4中未記載。通過固液分離裝置19被分離的固體物由固體物排出配管20被除去。固液分離裝置19可以如上述圖2和圖3那樣是壓濾機，另外作為其他固液分離裝置，可以例示連續(xù)離心機、螺旋沉降器、德拉瓦爾(DeLaval)離心機、螺旋壓力機、帶型過濾器、鼓型過濾器等?；镜难b置特征有回收酶投入配管4和未使用酶投入配管6獨立地與水解槽連接，可以獨立地控制回收酶的添加和未使用酶的添加；水供給配管11與糖液保持罐12連接，由水供給配管11供給的水在超濾膜裝置14中循環(huán)，以該水通過回收酶配管16而能夠供給至水解槽I的方式連接，與圖2、圖3的裝置相同。圖5是實施本發(fā)明的方法的裝置的另外一例。圖5的裝置是與上述圖4的裝置基本相同，但超濾膜14的非透過液與回收酶保持罐5連接的裝置。特別該裝置是作為超濾膜使用螺旋元件并將其串聯連接、或樹狀連接時的裝置。該裝置中也與圖2 4相同，水供給配管11與糖液保持罐12連接，由水供給配管11供給的水通過由三通閥21切換配管而在超濾膜裝置14中循環(huán)，進一步切換三通閥21后，該水被供給至回收酶保持罐5。進而回收酶保持罐5上連接有回收酶配管16，通過該回收酶配管16能夠供給至水解槽I?；厥彰竿度肱涔?和未使用酶投入配管6獨立地與水解槽連接，可以獨立地控制回收酶的添加和未使用酶的添加，這與圖2 4的裝置相同。圖6是實施本發(fā)明的方法的裝置的另外一例。在圖6裝置中，顯示在固液分離裝置19的后段進一步設置了精濾膜裝置22的裝置。在固液分離裝置19中不能充分除去固體物的情況下，進一步通過用精濾膜裝置22處理，可以獲得幾乎完全不含固體物的液。由此，可以降低后段超濾膜裝置14的膜污染。圖7是圖6的精濾膜裝置22的詳細圖，是顯示實施錯流過濾的裝置構成的圖。是將在固液分離裝置19中被分離的濾液保持在固液分離濾液罐23中，介由泵24對精濾膜25進行錯流過濾的裝置。精濾膜25可以是平膜、中空絲膜的任一種。中空絲膜可以是內壓式或外壓式的任一種。圖8是圖6的精濾膜裝置22的詳細圖，是顯示在精濾膜裝置22中實施死端過濾 的裝置構成的圖。將在固液分離裝置19中分離的濾液保持在固液分離濾液保持罐23中，用精濾膜25進行過濾。在死端過濾的情況下，可以具備用于進行膜表面的氣泡洗滌的壓空供給裝置26，另外還可以設置用于逆洗的逆洗泵27。此外，逆洗可以是回收于糖液保持罐12中的濾液，也可以是一般的膜洗滌水和藥液。精濾膜25可以是平膜、中空絲膜的任一種。中空絲膜可以是內壓式或外壓式的任一種。圖9是實施本發(fā)明的方法的裝置的另外一例。本發(fā)明的糖液的制造裝置可以是進一步具備濃縮糖液的反滲透膜和/或納濾膜的裝置。作為圖9，顯示了在圖4的裝置上連接了納濾膜或反滲透膜裝置30的裝置。在超濾膜裝置14的濾液側進一步連接糖液濃縮罐28，介由高壓泵29用反滲透膜和/或納濾膜30進行過濾。糖液被反滲透膜和/或納濾膜阻止，因此被濃縮于糖液濃縮罐28中。另一方面，剩余水可以作為濾液除去。反滲透膜和/或納濾膜裝置30可以是圖2 6的任一裝置，也可以通過與超濾膜裝置14的濾液側連接來設置。圖10是實施本發(fā)明的方法的裝置的另外一例。優(yōu)選回收酶投入配管4、和未使用酶投入配管6獨立地與水解槽I連接，但只要上述配管4和配管6能夠控制各自的酶成分的投入，則也可以是通過三通閥31等合流連接后、作為I個配管(未使用酶或回收酶投入配管)與水解槽I連接的方式。由水供給配管11供給的水可以是溫水。如果考慮到酶的失活，則溫水的溫度優(yōu)選為60°C以下。另外，通過使由水供給配管供給的水為溫水，從而可以在超濾膜裝置14內循環(huán)時獲得超濾膜的高的洗滌效果。洗滌效果優(yōu)選溫水的溫度為30°C 60°C。實施例以下，通過實施例更具體地說明本發(fā)明。但是本發(fā)明不限于這些實施例。(參考例I)纖維素酶的制備(來源于木霉屬的纖維素酶酶組合物)來源于木霉培養(yǎng)液的酶組合物通過以下方法來制備。[前培養(yǎng)]以玉米浸潰液5% (w/vol)、葡萄糖2% (w/vol)、酒石酸銨0. 37% (w/vol)、硫酸銨0. 14(w/vol)、磷酸二氫鉀0. 2% (w/vol)、氯化I丐二水合物0. 03% (w/vol)、硫酸鎂七水合物 0. 03% (w/vol)、氯化鋅 0. 02% (w/vol)、氯化鐵(III)六水合物0.01% (w/vol)、硫酸銅(II)五水合物 0.004% (w/vol)、氯化錳四水合物 0.0008% (w/vol)、硼酸 0. 0006% (w/vol)、七鑰酸六銨四水合物0. 0026% (w/vol)的方式添加至蒸懼水中，將IOOmL加入500mL帶擋板的三角燒瓶中，在121°C高壓釜滅菌15分鐘。放冷后，添加與其分別在121°C高壓釜滅菌15分鐘的PE-M和Tween80各0. 01% (w/vol) 0在該前培養(yǎng)培養(yǎng)基中接種里氏木霉ATCC68589使其為I X IO5個/mL，以28°C、72小時、180轉/分鐘振蕩培養(yǎng)，作為前培養(yǎng)(振蕩裝置TAITEC 社制 BI0-SHAKERBR-40LF)。[主培養(yǎng)]以玉米浸潰液5% (w/vol)、葡萄糖2% (w/vol)、纖維素(艾維素)10% (w/vol)、酒石酸銨0. 37% (w/vol)、硫酸銨0. 14% (w/vol)、磷酸二氫鉀0. 2%(w/vol)、氯化I丐二水合物0.03% (w/vol)、硫酸鎂七水合物0. 03 % (w/vol)、氯化鋅0. 02 % (w/vol)、氯化鐵(III)六水合物0.01% (w/vol)、硫酸銅(II)五水合物0.004% (w/vol)、氯化猛四水合物 0.0008% (w/vol)、硼酸 0.0006% (w/vol)、七鑰酸六銨四水合物 0. 0026% (w/vol)的方式添加至蒸餾水中，將2. 5L加入5L容量的攪拌廣口瓶(ABLE社制DPC-2A)容器中，在·121°C高壓釜滅菌15分鐘。放冷后，添加與其分別在121°C高壓釜滅菌15分鐘的PE-M和Tween80各0. I %，接種250mL預先通過上述的方法在液體培養(yǎng)基中進行了前培養(yǎng)的里氏木霉ATCC68589。然后，以28°C、87小時、300轉/分鐘、通氣量Ivvm進行培養(yǎng)，離心分離后，將上清進行膜過濾(Millipore公司制^ ^」力〃 7° -GV材質PVDF)。對以該上述條件制備的培養(yǎng)液，添加蛋白質重量比為1/100的量的￠-葡糖苷酶(Novozymel88)，將所得產物作為來源于木霉屬的纖維素酶在以下實施例中使用。(參考例2)纖維素前處理物的制備[纖維素前處理物I的制備]將市售的艾維素( > > 々社制)不進行特別處理而作為纖維素前處理物I在以下的實施例中使用。[纖維素前處理物2的制備]作為含纖維素的生物質使用稻秸。將含纖維素的生物質浸于硫酸1%水溶液中，在150°C進行30分鐘高壓釜處理(日東高壓制)。處理后進行固液分離，分離成硫酸水溶液(以下稱為稀硫酸處理液)和硫酸處理纖維素。接著將硫酸處理纖維素以固體成分濃度為10重量％的方式與稀硫酸處理液攪拌混合，然后用氫氧化鈉將pH值調整至5左右。將該產物作為纖維素前處理物2在以下的實施例中使用。[纖維素前處理物3的制備]作為纖維素使用稻秸。將上述含纖維素的生物質加入小型反應器(耐壓硝子工業(yè)制、TVS-N2 30ml)中,用液氮冷卻。在該反應器中流入氨氣,使樣品完全浸潰于液體氨中。蓋上反應器的蓋，在室溫放置15分鐘左右。接著，在150°C的油浴中處理I小時。處理后將反應器從油浴取出，在通風中直接漏掉氨氣，然后再用真空泵將反應器內抽真空至IOPa使其干燥。將產物作為纖維素前處理物3在以下實施例中使用。[纖維素前處理物4的制備]作為含纖維素的生物質使用稻秸。將含纖維素的生物質浸于水中，一邊攪拌一邊在180°C進行20分鐘高壓釜處理(日東高壓株式會社制)。此時的壓力為lOMPa。處理后使用離心分離(3000G)而固液分離成溶液成分(以下稱為水熱處理液)和處理生物質成分。將該處理生物質成分作為纖維素前處理物4在以下實施例中使用。(參考例3)糖濃度的測定糖水溶液所含的葡萄糖和木糖濃度在下述所示HPLC條件下通過與標準品的比較
來定量。柱LunaNH2 (Phenomenex 社制)移動相Milli-Q:乙腈=25:75(流速 0. 6mL/ 分鐘)反應液無檢測方法RI (差示折射率)溫度30°C。(參考例4)來源于木霉屬的纖維素酶的酶活性測定來源于木霉屬的纖維素酶的酶活性按照以下步驟進行測定。I)結晶纖維素分解活性相對于酶液(以規(guī)定條件制備)，添加艾維素(義 > 々社制、要確認)lg/L、乙酸鈉緩沖液(pH值5. 0) IOOmM,在50°C反應24小時。反應液在ImL管中制備，以上述條件一邊旋轉混和一邊進行反應。反應后將管進行離心分離，測定其上清成分的葡萄糖濃度。葡萄糖濃度依照參考例3所記載的方法測定。艾維素分解活性將生成的葡萄糖濃度(g/L)直接作為活性值。2)纖維二 糖分解活性相對于酶液，添加纖維二糖(和光純藥)500mg/L、乙酸鈉緩沖液(pH值5. 0) IOOmM,在50°C反應0. 5小時。反應液在ImL管中制備，以上述條件一邊旋轉混和一邊進行反應。反應后，將管進行離心分離，測定其上清成分的葡萄糖濃度。葡萄糖濃度依照參考例3所記載的方法進行測定。纖維二糖分解活性將生成的葡萄糖濃度(g/L)直接作為活性值。3)木聚糖分解活性相對于酶液,添加木聚糖(Birch wood xylan、和光純藥)10g/L、乙酸鈉緩沖液(pH值5. 0) IOOmM,在50°C反應4小時。反應液在ImL管中制備，以上述條件一邊旋轉混和一邊進行反應。反應后，將管進行離心分離，測定其上清成分的木糖濃度。木糖濃度依據參考例3所記載的方法進行測定。木糖分解活性將生成的木糖濃度(g/L)直接作為活性值。(比較例I)以下作為比較例，不實施一次水解和二次水解而由纖維素制造糖液。[工序I:水解]在纖維素前處理物I 4(各Ig)中混合添加參考例I記載的未使用酶(蛋白質濃度50mg/mL)0. 2mL(蛋白質的量IOmg)、以及后述的工序2的步驟中回收的回收酶溶液。進一步添加蒸餾水使得添加后的溶液的重量為10g。將本組合物移至帶分枝反應容器(東京理化社制(|)30NSl4/23)，以50°C保溫和攪拌19小時進行水解(東京理化社制小型機械攪拌器CPS-1000、轉換適配器、帶三通旋塞的添加口、保溫裝置MG-2200)。[工序2:固液分離和由糖液的酶回收(回收酶)]將工序I的水解物通過離心分離(4500G、10分鐘)進行固液分離，分離成糖液和殘渣。糖液的葡萄糖和木糖濃度通過參考例3記載的方法測定，作為生成糖而計算出。
進一步將糖液進行膜過濾(Millipore公司制^ f U 7 U 〃 7° -GP材質PES)，將所得的上清利用截留分子量10000的超濾膜(Sartorius stedim biotech社制VIVASPIN20、材質PES)以4500G離心至膜級分為lmL。將蒸餾水IOmL添加至膜級分中，再次以4500G離心至膜級分為lmL。然后，從膜級分中回收酶，將該酶作為回收酶?；厥彰冈谏鲜龅墓ば騃的水解中再利用。在本比較例中，通過使工序I和2循環(huán)進行，從而進行纖維素酶的回收再利用。將工序I 2的工序作為一套，共計進行6次回收再利用。此外，不進行回收再利用的第0次的反應通過以下步驟進行。[工序0:第0次的水解] 在纖維素前處理物I 4 (各Ig)中添加未使用酶(蛋白質濃度50mg/mL)0. 3mL(蛋白質的量15mg)(因為是第0次所以不添加回收酶)。添加蒸餾水至添加后的溶液的重量為10g。將本組合物移至帶分枝反應容器(東京理化社制(p30彳S14/23)，以50°C保溫和攪拌19小時進行水解(東京理化社制小型機械攪拌器CPS-1000、轉換適配器、帶三通旋塞的添加口、保溫裝置MG-2200)。所得的水解物通過上述工序2記載的方法分離，獲得回收酶。另外測定此時的糖液的葡萄糖和木糖濃度。表I中，將工序0和2實施I次，以及將工序I 2依次實施共計6次時，將各反應所得的糖液的葡萄糖濃度(Glc、g/L)和木糖濃度(Xly、g/L)歸納于表I。隨著回收再利用的次數增加，葡萄糖(Glc)和木糖(Xyl)減少。另外，判明了糖生成效率隨著再利用次數(N)增加而緩緩減少。[表 I]
___0次 I次 2次 3次 4次 5次 6次
Glc 4 2 3 9 37 3 5 3 I 3 0 2 7
纖維素前處理物I --------
Xyl I 0. 8 0. 7 0. 6 0. 4 0. 4 0. 3
…w Glc 32 30 2 8 27 25 23 2 0r n 纖維素前處理物2 --------Xyl 7432 0. 9 0. 6 0. 3
^,Glc 40 35 3 I 2 8 2 5 24 22
纖維素前處理物3---------
__Xyl I 2 I Q 97__6__4__4
^ , Glc 2 5 23 2 2 2 0 I B 18 15 纖維素前處理物4----—----
Xyl 422I 0.4 0. 2 0. I(實施例I)以下作為實施例，通過進行纖維素的一次水解和二次水解來制造糖液。[工序I:一次水解]在纖維素前處理物I 4(各Ig)中加入蒸餾水，添加后述的工序3的步驟中回收的回收酶，進一步添加蒸餾水使總重量為10g。將本組合物移至帶分枝試管(東京理化社制Cp30 NS14/23)、將本組合物移至帶分枝反應容器(東京理化社制f30NS14/23)，以50°C保溫和攪拌I小時進行水解(東京理化社制小型機械攪拌器CPS-1000、轉換適配器、帶三通旋塞的添加口、保溫裝置MG-2200)[工序2:二次水解]對工序I的一次水解物添加參考例I記載的未使用酶(蛋白質濃度50mg/mL)0. 2mL(蛋白質的量IOmg)，以50°C反應18小時。
[工序3:固液分離和從糖液的酶回收(回收酶)]將工序3的二次水解物通過離心分離(4500G、10分鐘)進行固液分離，分離成糖液和殘渣。糖液的葡萄糖和木糖濃度通過參考例3記載的方法測定，作為第N次的生成糖計算出。進一步將糖液進行膜過濾(Millipore公司制^ r -J 7 -J ^ 7° -GP、材質PES)，將所得的上清利用截留分子量10000的超濾膜(Sartorius stedim biotech社制VIVASPIN 20、材質PES)以4500G離心至膜級分為lmL。將蒸餾水IOmL添加到膜級分中，再次以4500G離心至膜級分為lmL。然后，從膜級分回收酶，將此作為回收酶?；厥彰冈谏鲜龅墓ば騃的水解中再利用。在本實施例中，通過將工序I 工序3循環(huán)進行，從而進行纖維素酶的回收再利用。將工序I 3的工序作為一套，共計進行6次回收再利用。此外，不進行回收再利用的第0次的反應通過以下步驟進行。[工序0:第0次的水解]在纖維素前處理物I 4 (各Ig)中添加未使用酶(蛋白質濃度50mg/mL)0. 3mL(蛋白質的量15mg)(因為是第0次所以不添加回收酶)。添加蒸餾水至添加后的溶液的重量為10g。將本組合物移至帶分枝反應容器(東京理化社制(p30NS14/23)，以50°C保溫和攪拌19小時進行水解(東京理化社制小型機械攪拌器CPS-1000、轉換適配器、帶三通旋塞的添加口、保溫裝置MG-2200)。所得的水解物通過上述工序3記載的方法分離，獲得回收酶。另外測定此時的糖液的葡萄糖和木糖濃度。表2中，將工序0和3實施I次，以及將工序I 3依次實施共計6次時，將各反應所得的糖液的葡萄糖濃度(Glc) (g/L)和木糖濃度(Xly) (g/L)歸納于表2。確認了隨著回收再利用的次數增加，葡萄糖(Glc)和木糖(Xyl)減少，但與比較例1(表I)相比，糖生成量緩緩增多。[表2]
權利要求
1.糖液的制造方法，其特征在干，是重復包含以下エ序(I) (3)的糖液制造エ藝而制造糖液的方法，其中，將エ序(3)所得的回收酶在下次以后的糖液制造エ藝的エ序(I)中使用， (1)在纖維素中添加來源于絲狀菌的纖維素酶而進行一次水解的エ序； (2)在エ序(I)的水解物中添加未使用的來源于絲狀菌的纖維素酶而進行二次水解的エ序；以及 (3)將エ序(2)的水解物進行固液分離，從所得的糖液中獲得回收酶的エ序。
2.根據權利要求I所述的糖液的制造方法，其特征在于，作為糖液制造エ藝中的上述エ序(I)中的來源于絲狀菌的纖維素酶，使用從利用來源于絲狀菌的纖維素酶獲得的纖維素水解物中回收的回收酶成分。
3.根據權利要求I或2所述的糖液的制造方法，上述エ序⑴或⑵中的來源于絲狀菌的纖維素酶包含來源于木霉屬微生物的培養(yǎng)液的成分。
4.根據權利要求I 3的任一項所述的糖液的制造方法，其特征在干，上述回收酶包含木聚糖酶和/或木糖苷酶。
5.根據權利要求I 4的任一項所述的糖液的制造方法，其特征在于，上述回收酶包含水不溶性的來源于絲狀菌的纖維素酶。
6.根據權利要求I 5的任一項所述的糖液的制造方法，其特征在干，上述纖維素是將含纖維素的生物質進行堿處理、水熱處理或稀硫酸處理而得的處理物。
7.根據權利要求I 6的任一項所述的糖液的制造方法，其特征在干，一次水解和二次水解中的酶添加量滿足以下關系式エ序(I)中的回收酶的添加量>エ序(2)中的未使用酶量的添加量。
8.根據權利要求I 7的任一項所述的糖液的制造方法，其特征在于，上述エ序(3)中的來源于絲狀菌的纖維素酶的回收，是將糖液通過超濾膜進行過濾，從非透過側回收。
9.裝置，是用于包含水解纖維素的エ序的糖液的制造方法的裝置，其中，作為構成，包含連接了回收酶投入配管和未使用酶投入配管的水解槽、將水解物進行固液分離的裝置、具有用于超濾膜的洗滌和/或保持在循環(huán)配管內的回收酶的除去的水供給配管的糖液保持罐、以及用于分離酶與糖液的超濾膜裝置。
10.裝置，是用于包含水解纖維素的エ序的糖液的制造方法的裝置，其中，作為構成，包含用于將回收酶與纖維素混合而進行一次水解的纖維素/回收酶混合裝置、連接了纖維素/回收酶混合物供給配管和未使用酶投入配管的水解槽、將水解物進行固液分離的裝置、具有用于超濾膜的洗滌和/或保持在循環(huán)配管內的回收酶的除去的水供給配管的糖液保持罐、和用于分離酶與糖液的超濾膜裝置。
11.裝置，作為構成，除了權利要求9或10所述的裝置構成之外，進ー步包含濃縮糖液的反滲透膜和/或納濾膜裝置。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供糖液的制造方法，其特征在于，是重復包含以下工序(1)～(3)的糖液制造工藝而制造糖液的方法，其中，將工序(3)所得的回收酶在下次以后的糖液制造工藝的工序(1)中使用。(1)在纖維素中添加來源于絲狀菌的纖維素酶而進行一次水解的工序；(2)在工序(1)的水解物中添加未使用的來源于絲狀菌的纖維素酶而進行二次水解的工序；以及(3)將工序(2)的水解物進行固液分離，從所得的糖液中獲得回收酶的工序。由此，提供在由纖維素前處理物制造糖液的方法中，削減纖維素酶等的酶使用量的方法。
文檔編號C12P19/14GK102791874SQ20118001390
公開日2012年11月21日 申請日期2011年3月14日 優(yōu)先權日2010年3月15日
發(fā)明者南野淳, 山本優(yōu)樹, 山田勝成, 栗原宏征 申請人:東麗株式會社