專利名稱：：一種葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種葉酸介導(dǎo)靶向聚合物膠束，尤其是一種包載難溶性抗腫瘤藥物的葉酸介導(dǎo)靶向聚合物膠束。
背景技術(shù)：
：臨床治療腫瘤的藥物，其中的難溶性抗腫瘤藥物的給藥，特別是注射給藥的最大障礙是藥物溶解度低，難于制備合適的制劑，往往需要采取各種增加溶解度的方法，如將藥物制備成鹽、加入助溶劑及表面活性劑增溶等。由于相對安全的表面活性劑較容易獲得，所以通過表面活性劑增溶往往成為首選。例如紫杉醇(paclitaxel，PCL)是從紅豆杉屬植物紫杉的樹干和樹皮中提取得到的天然抗癌藥，臨床上主要用于卵巢癌、乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌的治療，其注射液治療對順鉑耐藥或未控制的卵巢癌亦有效，對食道癌和肺癌也有一定療效。PCL難溶于水(〈6mg/L)，不穩(wěn)定，口服生物利用度差。上市的注射劑所采用的增溶溶媒聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEL)易產(chǎn)生高敏性、神經(jīng)毒性、腎毒性、心臟毒性等不良反應(yīng)，且在給藥過程中能夠溶解靜脈注射輸液管中的增塑劑，加之PCL本身對心臟和腎臟等組織亦有毒副作用，而限制了PCL在臨床上的應(yīng)用。同樣的情況也出現(xiàn)在喜樹堿等抗腫瘤藥物的注射劑中。因此研究開發(fā)難溶性抗腫瘤藥物載體，對臨床治療有著重要的意義。近年來，兩親性嵌段共聚物的膠束載藥系統(tǒng)引起了廣泛的關(guān)注。聚合物膠束作為藥物載體發(fā)展于20世紀(jì)90年代，是由兩親性聚合物在水溶液中自發(fā)形成的一種自組裝結(jié)構(gòu)，親水性片段形成外殼，疏水性片段形成內(nèi)核，構(gòu)成獨特的核-殼結(jié)構(gòu)，并將疏水性抗腫瘤藥物包載于內(nèi)核中；親水性組分多為聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯(PE0)等；疏水性組分多為聚氧丙烯、聚苯乙烯、聚氨基酸、聚酯等，粒徑一般為小于100nm，具有載藥量高、載藥范圍廣、穩(wěn)定性好、體內(nèi)滯留時間長以及增加藥物的穩(wěn)定性、提高生物利用度和降低毒副作用等特點，還可以連接具有特異性識別功能的配基對其表面進(jìn)行修飾實現(xiàn)主動靶向給藥，使藥物有效地到達(dá)靶點。近年來，藥物靶向傳釋系統(tǒng)作為治療腫瘤和癌癥的重要手段之一成為研究重點，既可以改善因抗腫瘤藥物選擇性不強(qiáng)而導(dǎo)致藥物分布全身各器官的問題，又可以提高藥物活性，降低藥物毒副作用?，F(xiàn)有技術(shù)公開了葉酸(Folicacid)是一種分子結(jié)構(gòu)中含有喋呤環(huán)的小分子維生素(VBn)，在生理條件下很難自由透過細(xì)胞膜，必須進(jìn)行內(nèi)化才能被人體所吸收。研究發(fā)現(xiàn)兩種內(nèi)化葉酸的機(jī)制一是低親和力的跨膜蛋白，轉(zhuǎn)運四氫葉酸、二氫葉酸(葉酸的還原態(tài))進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；二是高親和力的葉酸受體，可吸收葉酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。葉酸受體(FR)是一種糖蛋白膜受體，在某些實體腫瘤細(xì)胞膜表面高度表達(dá)，而在正常組織低表達(dá)，對于葉酸或葉酸的偶聯(lián)物都有高度的親和力，因此可介導(dǎo)含有葉酸及其偶聯(lián)物的載體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)。利用葉酸與葉酸受體特異性結(jié)合的特點，將葉酸連接到聚合物膠束表面，使聚合物膠束具有靶向腫瘤細(xì)胞的特性，從而提高抗腫瘤藥物的生物利用度，降低毒副作用。然而，葉酸分子過量會導(dǎo)致載藥膠束被巨噬細(xì)胞吞噬，從而降低靶向腫瘤細(xì)胞的作用，降低藥效。因此，研制一種可規(guī)避巨噬細(xì)胞吞噬的葉酸受體靶向納米膠束作為難溶性抗腫瘤藥物的載體，可以改變藥物分布，增加藥物在體內(nèi)滯留時間，提高藥物的腫瘤組織靶向性，在腫瘤靶向診斷和治療中，有著廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束，尤其是一種包載難溶性抗腫瘤藥物的葉酸介導(dǎo)靶向聚合物膠束。本發(fā)明的聚合物膠束為可靜脈注射的難溶性抗腫瘤藥物葉酸受體靶向納米膠束制劑，可有效規(guī)避巨噬細(xì)胞，延長藥物在體內(nèi)滯留時間，并具有良好的靶向腫瘤細(xì)胞的作用，增加藥物在腫瘤組織分布，從而提高療效，降低毒性。本發(fā)明具體公開了葉酸受體靶向納米膠束的載體材料的合成，以及通過篩選含葉酸材料在載體中所占比例，使載藥膠束具有有效規(guī)避巨噬細(xì)胞的特點，并包載難溶性抗腫瘤藥物，構(gòu)建葉酸受體靶向納米載藥膠束給藥系統(tǒng)。本發(fā)明所述的的葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束，由葉酸_聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺材料按o.i:ioo-io:ioo摩爾比形成，其包載有難溶性抗腫瘤藥物。所述的葉酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺兩種材料中的聚乙二醇分子量為2300-5000，其中的磷脂酰乙醇胺選自二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(DSPE)、氫化豆磷脂乙醇胺(HSPE)、氫化蛋磷脂乙醇胺(HEPE);其中的葉酸-聚乙二醇_磷脂酰乙醇胺與甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的摩爾比為o.i:ioo-io:ioo，優(yōu)選摩爾比為i:ioo。所包載的難溶性藥物選自紫杉烷類藥物如紫杉醇、喜樹堿類藥物如9-硝基喜樹堿、嗯環(huán)類藥物如阿霉素。本發(fā)明提供了可靜脈注射的難溶性抗腫瘤藥物葉酸受體靶向納米膠束載體材料的制備方法，包括材料分離純化，及純度檢測方法的建立。本發(fā)明提供了可靜脈注射的難溶性抗腫瘤藥物葉酸受體靶向納米膠束的制備方法，包括1)制備載體材料FA-PEG-DSPE制備Folate-PEG_NH2;制備Folate-PEG-SUC;制備Folate-PEG-DSPE;2)制備載體材料MPEG-DSPE;3)制備FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE為載體的載藥膠束。本發(fā)明的葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞體外實驗，實驗結(jié)果表明，將FA-PEG-DSPE與MPEG-DSPE按照摩爾比0.1:100-10:100混合作為載體，優(yōu)選摩爾比i:ioo，采用成膜水化法包載難溶性抗腫瘤藥物，制成的載藥葉酸偶聯(lián)聚合物膠束，能有效規(guī)避巨噬細(xì)胞，體外抗腫瘤活性顯著高于無葉酸載藥膠束以及游離藥物。圖1顯示載體材料FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE高效液相檢測圖譜。圖2顯示載體材料FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE分別對細(xì)胞產(chǎn)生毒性結(jié)果。圖3顯示載體材料的CMC測定結(jié)果，其中，A:MPEG-DSPE;B:FA-PEG-DSPE。圖4顯示為本發(fā)明中實施例6中流式細(xì)胞法結(jié)合載藥葉酸偶聯(lián)膠束抑制腫瘤細(xì)胞生長法，篩選膠束載體材料中FA-PEG-DSPE與MPEG-DSPE的最佳比例。具體實施例方式以下借助非限制性實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實施例1制備載體材料FA-PEG-DSPE制備Folate-PEG_NH2取30.9mg(0.15mmol)DCC溶于5ml二甲亞砜(DMSO)，力B入300mgNH2-PEG_NH2，66.2mgFolate,10ill吡啶，25"攪拌24h，加入10ml蒸餾水終止反應(yīng)，離心，取上清液，用蒸餾水透析，凍干。依次用DEAES印haroseFF離子交換柱和S印hadexG-15柱結(jié)合AKTAexplorer快速純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，凍干，得黃色的Folate-PEG_NH2固體154mg。制備Folate-PEG-SUC取Folate-PEG-NH280.9mg溶于lmlDMF，SUC23.8mg溶于lmlDMF，混合，50。C反應(yīng)，點板檢測反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)4h后加2ml蒸餾水終止反應(yīng)，用S印hadexG-15柱結(jié)合AKTAexplorer快速純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，凍干，得黃色的Folate-PEG-SUC固體71mg。制備Folate-PEG-DSPE取Folate-PEG-SUC71.7mg溶于lml氯仿，DCC5.8mg溶于0.5ml氯仿，混合，DSPE122.2mg溶于3ml氯仿，加入上述溶液中，5(TC反應(yīng)，點板檢測反應(yīng)進(jìn)行。5h后反應(yīng)完全，旋蒸，除氯仿，真空干燥過夜。再加入乙醇50ml，攪拌10min，7500r/min20min離心，取上清液，重復(fù)幾次，合并上清液，過濾，旋蒸，除乙醇，真空干燥過夜，加蒸餾水?dāng)嚢?，離心，取上清液凍干，得黃色的Folate-PEG-DSPE(FA-PEG-DSPE)58.7mg。FA-PEG-DSPE純度檢測將上述制得到的FA-PEG-DSPE，用HPLC法對其純度進(jìn)行檢測，純度為94.3%(圖1，A/B)。實施例2制備載體材料MPEG-DSPE制備Me0-PEG-SUC取Me0-PEG-NH2200mg溶于2mlDMF，SUC80mg溶于lmlDMF，混合，50°C反應(yīng)，點板檢測反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)4h后加2ml蒸餾水終止反應(yīng)，用S印hadexG-15柱結(jié)合AKTAexplorer快速純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，凍干，得白色的Me0-PEG-SUC固體159.9mg。制備MeO-PEG-DSPE取MeO-PEG-SUC90mg溶于lml氯仿，DCC8mg溶于lml氯仿，混合，DSPE254.4mg溶于4ml氯仿，加入上述溶液中，50°C反應(yīng)，點板檢測反應(yīng)進(jìn)行。5h后反應(yīng)完全，旋蒸，除氯仿，真空干燥過夜。再加入乙醇50ml，攪拌10min，7500r/min20min離心，取上清液，重復(fù)幾次，合并上清液，過濾，旋蒸，除乙醇，真空干燥過夜得白色的MeO-PEG-DSPE(MPEG-DSPE)86.7mg。MPEG-DSPE純度檢測將上述方法制備得到的MPEG-DSPE，用HPLC法對其純度進(jìn)行檢測，純度為95.8%(圖1，C/D)。實施例3載體材料細(xì)胞毒性檢測將對數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞HeLa以7.5X103cells/well，接種于96孔板，24h后分別給予由膠束載體材料FA-PEG-DSPE與MPEG-DSPE配制成的0.220uM的膠束溶液，置于37。C培養(yǎng)箱中培育48h后，加入2015mg/ml的MTT溶液，37。C培養(yǎng)4h后將培養(yǎng)液替換成200illDMS0，振蕩10min，用酶標(biāo)儀在490nm測定吸光度值。結(jié)果顯示，在0.220uM濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)A_PEG_DSPE的細(xì)胞存活率為93.47±3.402%73.20±2.043%，MPEG-DSPE的細(xì)胞存活率為96.21±7.261%84.18±1.697%，說明載體材料本身對細(xì)胞的毒性較小，對接下來的藥物敏感性試驗的影響較小(圖2)。實施例4載體材料CMC測定采用芘熒光探針法。分別配置一系列濃度的FA-PEG-DSPE/芘，以及MPEG-DSPE/芘的無水氯仿溶液，加入到干凈的試管中，用氮氣吹干氯仿，并真空避光干燥過夜；在各試管中加入一定量的lOmM，pH7.4的HBS緩沖液，使各試管中FA-PEG-DSPE和MPEG-DSPE的濃度為0.0020.04mg/ml，芘的濃度為0.014mg/ml，將混合液置于25"C水浴避光振蕩24h后，過濾除去游離的芘，并采用熒光光譜法檢測包載于膠束中的芘的濃度，激發(fā)波長350nm，發(fā)射波長440nm。測定結(jié)果通過數(shù)據(jù)處理得出FA-PEG-DSPE和MPEG-DSPE的CMC分別為1.0X10—5M和0.97X10—5M(圖3)。實施例5制備FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE為載體的載藥膠束制備紫杉醇(PCL)載藥膠束將MPEG-DSPE與FA-PEG-DSPE按摩爾比100:1溶于無水氯仿中，加入PCL的乙腈溶液，旋蒸成膜后放入真空干燥箱過夜揮凈有機(jī)溶液，用一定量的10mMpH7.4的HBS水化，37t:水浴振蕩20min，用220nm膜過濾除去未包載的藥物，得到載藥膠束溶液。PCL在乙腈/水=52/48(v/v)中230nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=94.099x+24.008(r=0.9998)x為PCL濃度(iig/ml)，A為吸光度。制備9-硝基喜樹堿(9-NC)載藥膠束將MPEG-DSPE與FA-PEG-DSPE按摩爾比100:1溶于無水氯仿中，加入9-NC的乙腈溶液，旋蒸成膜后放入真空干燥箱過夜揮凈有機(jī)溶液，用一定量的10mMpH5.5的HBS水化，37t:水浴振蕩20min，用220nm膜過濾除去未包載的藥物，得到載藥膠束溶液。9-NC在甲酸/水/乙腈=0.169/45/55(v/v/v)中368nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=46.182x+2.3065(r=0.9999)x為9-NC濃度(iig/ml)，A為吸光度。制備阿霉素(DOX)載藥膠束將MPEG-DSPE與FA-PEG-DSPE按摩爾比100:1溶于無水氯仿中，加入DOX的甲醇溶液(D0X與三乙胺摩爾比1:2.2)，旋蒸成膜后放入真空干燥箱過夜揮凈有機(jī)溶液，用一定量的10mMpH7.0的HBS水化，37。C水浴振蕩20min，透析除去未包載的藥物并凍干，得到載藥膠束粉末。D0X在0.01M磷酸二氫鉀溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH3.0)/乙腈=70/30(v/v)中480nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=21.868x-10.086(r=0.9998)x為D0X濃度(Pg/ml)，A為吸光度。所得載藥膠束平均粒徑均為25nm左右，成圓整球形。實施例6篩選載藥膠束中FA-PEG-DSPE與MPEG-DSPE的最佳比例采用FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE摩爾比分別為0:100，1:100，2:100，5:100，10:IOO，制備包載羅丹明123(Rh-123)的納米膠束。分別加入到正常培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞RAW264.7中約lh后，消化并用pH7.4的PBS洗滌3遍，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE摩爾比為0:100禾P1:100時，沒有表達(dá)熒光的巨噬細(xì)胞；2:IOO時表達(dá)熒光的巨噬細(xì)胞為O.11%;5:100時表達(dá)熒光的巨噬細(xì)胞為67.06%，10:100時表達(dá)熒光的巨噬細(xì)胞為98.30%。采用FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE摩爾比分別為0.1:100,0.2:100，1:100，2:100，5:100，制備包載9-NC的納米膠束(9-NC濃度為0.9iig/ml)。分別加入到接種于96孔板的HeLa細(xì)胞中，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37°C、5%0)2、飽和濕度)連續(xù)培養(yǎng)24h后，采用MTT法測定細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示FA-PEG-DSPE/MPEG-DSPE摩爾比為0.1:100時，細(xì)胞存活率為52.19%，0.1:100時為51.29%，0.2:100時為48.78%，0.5:100時為35.42%，1:100時為22.19%，2:100時為21.15%，5:100時為21.0%。優(yōu)選FA-PEG-DSPE/MeO-PEG-DSPE摩爾比1:100構(gòu)建混合膠束(圖4)。實施例7難溶性抗腫瘤藥物葉酸受體靶向納米膠束對體外腫瘤細(xì)胞的抑制作用用含10%小牛血清(BCS)的RPMI1640培養(yǎng)液，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37°C、5%0)2、飽和濕度)連續(xù)培養(yǎng)HeLa、SGC7901、BXPC3三種細(xì)胞，分別以7.5X103cells/well接種于96孔板，24h后，將培養(yǎng)液替換為200的葉酸偶聯(lián)載藥膠束、無葉酸載藥膠束及游離藥物三種制劑，繼續(xù)相同條件培養(yǎng)24h后采用MTT法測定細(xì)胞存活率。結(jié)果表明葉酸偶聯(lián)載藥膠束有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長作用，三種溶液制劑的抑制作用程度依次為葉酸偶聯(lián)膠束>無葉酸膠束>游離藥物。結(jié)果表明，葉酸偶聯(lián)膠束具有較好的腫瘤細(xì)胞靶向性。表1是9-NC納米膠束在體外對腫瘤細(xì)胞HeLa、SGC7901、BXPC3抑制作用的IC5。值比較。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束，其特征在于，由葉酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺材料按0.1∶100-10∶100摩爾比形成葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束，其包載有難溶性抗腫瘤藥物。2.根據(jù)權(quán)利要求i所述的葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束，其特征在于，所述葉酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺與甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的摩爾比為i:ioo。3.根據(jù)權(quán)利要求i所述的葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束，其特征在于，所述葉酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺材料中的聚乙二醇分子量為2300-5000。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束，其特征在于，所述磷脂酰乙醇胺選自二硬脂酸磷脂酰乙醇胺、氫化豆磷脂乙醇胺或氫化蛋磷脂乙醇胺。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束，其特征在于，所包載的難溶性藥物選自紫杉烷類藥物、喜樹堿類藥物或嗯環(huán)類藥物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束，其特征在于，所包載的難溶性藥物選自紫杉醇、9_硝基喜樹堿或阿霉素。7.權(quán)利要求l的葉酸介導(dǎo)靶向的聚合物膠束，其特征在于是可靜脈注射的難溶性抗腫瘤藥物葉酸受體耙向納米膠束制劑。全文摘要本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及一種葉酸介導(dǎo)靶向聚合物膠束，尤其是一種包載難溶性抗腫瘤藥物的葉酸介導(dǎo)靶向聚合物膠束。本發(fā)明采用一定比例的兩種生物相容的葉酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺材料制成葉酸介導(dǎo)靶向聚合物膠束，其包載有難溶性抗腫瘤藥物，使難溶性抗腫瘤藥物有效增溶在其所形成的聚合物膠束內(nèi)，經(jīng)試驗證實，具有特異性靶向抑制腫瘤細(xì)胞生長、有效規(guī)避了巨噬細(xì)胞吞噬的雙重優(yōu)勢，為難溶性抗腫瘤藥物提供了一種理想的新型藥物載體和制劑形式。文檔編號A61K47/34GK101721350SQ20081020107公開日2010年6月9日申請日期2008年10月10日優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日發(fā)明者劉婧,劉敏,謝操,陸偉躍,韓雪申請人:復(fù)旦大學(xué)