專利名稱：基因檢測方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測基因如DNA或RNA的方法及其裝置，特別是涉及一種使用熒光探針定量、快速檢測基因的方法及其裝置。
為診斷遺傳性疾病而合成了一個(gè)互補(bǔ)于致病基因的DNA用作DNA探針。具體地說，是將樣品基因固定在纖維素濾膜或尼龍濾膜上，再加上放射性標(biāo)記或染料標(biāo)記的DNA探針，使之與濾膜上的DNA雜交。然后沖洗濾膜，以除去未與樣品基因雜交的DNA探針。由于放射性核素標(biāo)記或染料標(biāo)記的DNA可選擇地結(jié)合在如上得到的固定有基因的濾膜上，故可通過放射自顯影或肉眼可見的檢測法來判定是否存在可能的致病基因?！癇unseki(Analysis)”(462-468，1986)中描述了這一常規(guī)技術(shù)。
上述常規(guī)技術(shù)費(fèi)工費(fèi)時(shí)，而且存在著檢測結(jié)果定量上的問題。
本發(fā)明旨在解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，并提供一種能在短時(shí)間內(nèi)簡便而又定量地檢測基因的方法及其裝置。
為了達(dá)到上述目的，可用熒光素標(biāo)記與被檢基因互補(bǔ)的DNA探針;將樣品基因與所說的DNA探針混合并使所說的待檢基因與探針雜交;用凝膠電泳法將與所說的待檢基因雜交的DNA探針同未與待檢基因雜交的游離DNA探針分開，從而使所說的游離DNA探針流進(jìn)與所說的凝膠下游端接觸的緩沖溶液中，并使所說的雜交的DNA探針留在所說的凝膠中;然后用光學(xué)方法檢測所說的凝膠，以檢出熒光標(biāo)記之雜交的DNA探針。
因此，本發(fā)明的基因檢測方法包括Ⅰ)使樣品基因與互補(bǔ)于被檢基因并用熒光素標(biāo)記的DNA探針混合以進(jìn)行雜交，從而形成雜交DNA探針和游離DNA探針的混合物;Ⅱ)將所說的混合物從所說凝膠的一端注入電泳凝膠中;Ⅲ)用電泳法將所說已雜交的DNA探針與所說的游離DNA探針分離開，從而使所說的游離DNA探針流進(jìn)與所說的凝膠之下游端相接觸的緩沖溶液中，而只把所說雜交的DNA探針留在所說的凝膠中;Ⅳ)在完成所說的第Ⅲ)步驟之后，將所說的凝膠暴露于激發(fā)光下，并測定所產(chǎn)生的熒光。其中術(shù)語“凝膠下游端”是指凝膠中DNA遷移的下游。
另外，本發(fā)明的基因檢測裝置包括Ⅰ)一個(gè)引起熒光標(biāo)記樣品發(fā)生電泳凝膠遷移的電泳分離器，使具有短小堿基長度的游離DNA探針流進(jìn)與所說的凝膠的下游端相接觸的緩沖液中;Ⅱ)一個(gè)當(dāng)所說的游離DNA探針流入所說的緩沖液后，使保留在已從所說電泳分離器內(nèi)除去之所說凝膠中的樣品發(fā)光的激發(fā)光源;Ⅲ)用以檢測由所說樣品產(chǎn)生之熒光的裝置。
上述(用于分離的)凝膠一般是聚丙烯酰胺凝膠，但也可使用適于熒光檢測型電泳裝置的凝膠材料。從縮短檢測時(shí)間的觀點(diǎn)看，遷移方向上的凝膠長度最好是5cm或更短。只要能夠去除游離的DNA探針，并使與待檢基因雜交的DNA探針留在凝膠內(nèi)，可盡量縮短凝膠長度。從實(shí)際操作出發(fā)，現(xiàn)有檢測技術(shù)中凝膠長度的最低限為10mm。對(duì)于凝膠的形狀一般沒有特殊限制，適用于電泳的凝膠制備形式包括包裝在一個(gè)園柱形容器內(nèi)的棒形凝膠(使柱子的縱向與電泳遷移方向一致)、一個(gè)使其縱向與電泳遷移方向垂直、并且在凝膠遷移方向的上部分帶有許多可注入樣品之槽的多角棱柱或板狀凝膠、或以二維形式在表面上帶有許多可注入樣品之槽的平板。
通過檢測探針發(fā)出的熒光，可以確定游離的DNA探針是否已通過電泳凝膠分離流入緩沖液內(nèi)。如果預(yù)先測定好從遷移開始到進(jìn)行熒光檢測的遷移時(shí)間，則游離DNA探針即在已測定的遷移時(shí)間流入緩沖液內(nèi)。因此，在這種情況下，可根據(jù)需要，在事先定好一段時(shí)間后，從電泳分離器內(nèi)取出凝膠，并暴露于激發(fā)光下以測定所產(chǎn)生的熒光。
為了使大多數(shù)分離凝膠暴露于激發(fā)光，可方便地將凝膠移至暴露於激發(fā)光的區(qū)域，以使凝膠相繼地暴露于固定的激發(fā)光源下。在這種情況下，也可以固定熒光檢測裝置。如果凝膠有許多泳道，如帶有許多便于注入樣品之槽的凝膠，則可以使凝膠的各泳道相繼地暴露于該固定的激發(fā)光源之下。另一個(gè)方法是，可在光源由之通過時(shí)使多數(shù)排在一個(gè)方向上的泳道同時(shí)暴露于激發(fā)光，并按照垂直于激發(fā)光的方向移動(dòng)凝膠，以用行式感受器(linesensor)檢測熒光。
根據(jù)本發(fā)明的上述結(jié)構(gòu)，因使用了熒光標(biāo)記的探針，而不必使用放素性核素，又因?yàn)闄z測的是結(jié)合于凝膠中待檢基因上的DNA探針?biāo)l(fā)出的熒光，故不必將凝膠分離的DNA轉(zhuǎn)移到纖維素濾膜或類似物上，從而也改善了檢測效率。


圖1是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)例用于裝填凝膠之容器的平面圖。
圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例用于電泳分離之裝置的縱向斷面圖。
圖3是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例用于檢測熒光之裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4顯示DNA堿基長度與在預(yù)定之距離上遷移所需遷移時(shí)間之間的關(guān)系曲線。
圖5是根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例顯示平板凝膠暴露于激發(fā)光源的透視圖。
圖6是根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)例所用的裝置的圖解說明，其中所有槽同時(shí)暴露于從凝膠側(cè)面引入的激發(fā)光以檢測熒光。
圖7是圖解顯示根據(jù)本發(fā)明之再一個(gè)實(shí)例的平板凝膠。
實(shí)例1現(xiàn)參考圖1至4更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。
圖1顯示用于分離的樣品容器2及如圖2所示的容器支撐裝置1上視圖。圖中，樣品容器2排成一列。樣品容器2均為內(nèi)徑0.7mm、外徑6mm、長度4cm的石英管，且容器支撐裝置1是由石英制作的。
圖2顯示用于樣品電泳分離之裝置25的結(jié)構(gòu)縱剖面示意圖。凝膠3裝填于固定在支撐裝置1上容器2內(nèi)。凝膠3用的是聚丙烯酰胺。將樣品注入凝膠3上部。容器2被浸沒于上和下部緩沖液中。容器支撐裝置1固定于框架21上，目的是和框架21一起支撐上部緩沖液。當(dāng)跨經(jīng)電極5和5′提供電壓(一般約50伏/cm)時(shí)，DNA樣品即由凝膠上面部分向下泳動(dòng)。DNA的泳動(dòng)速度依據(jù)由堿基數(shù)目表示的堿基長度N、電泳的電場強(qiáng)度E、以及溫度T而有所不同。圖4中顯示了有不同長度的單鏈DNA泳動(dòng)25mm所用的時(shí)間td。曲線17、18和19分別相當(dāng)于聚丙烯酰胺濃度為2%、4%和6%的凝膠。下文中以百分總單體濃度(重量/體積)(g/ml)來表示聚丙烯酰胺濃度。DNA探針的堿基長度(以堿基數(shù)目表示)約為20，而待測DNA為1000或1000以上。最短的堿基長度約為300至400。因此，選用了長度為1000的待測基因片段作為典型例子。在該實(shí)例中，容器內(nèi)的凝膠長度和聚丙烯酰胺凝膠濃度分別為25mm和4%。從凝膠的上部分注入1至2μl含樣本基因與熒光標(biāo)記之DNA探針的混合物以啟始電泳遷移。2分鐘后DNA探針本身流入下部緩沖液槽內(nèi)?？赏ㄟ^檢測由探針發(fā)出的熒光來確定探針的流入。另一方面，與被檢基因雜交的DNA僅在30分鐘之后通過凝膠部分。因此，施加5分鐘電泳電場即僅除去尚未雜交的DNA探針，然后將容器2移向固定于支撐裝置上的檢測部分。這樣，如果測定了游離DNA探針流入緩沖液槽及檢測熒光所用的時(shí)間，則只要控制電泳遷移時(shí)間長于上述遷移時(shí)間，即可從樣品中除去游離DNA探針。
圖3中顯示了用于檢測由已雜交DNA所發(fā)射熒光之檢測部分的結(jié)構(gòu)示意圖。由光源6發(fā)出的激發(fā)光11(如激光或燈光)從上面進(jìn)入管狀容器2，以照射裝填于小室容器內(nèi)的棒形凝膠。如果凝膠中存在雜交的DNA探針即可觀察到熒光20。熒光20經(jīng)透鏡7聚光后穿過濾光器8，而進(jìn)入光接受裝置9，并用檢測器10檢測。激發(fā)光源6是具有適于標(biāo)記DNA探針之熒光團(tuán)熒光波長的光源。例如，當(dāng)熒光團(tuán)是FITC(熒光素異硫氰酸鹽;最大熒光波長515nm)時(shí)，應(yīng)使用輸出功率為10mw的氬激光(激發(fā)波長488nm)，而當(dāng)熒光團(tuán)是TexasRed(最大熒光波長605nm)時(shí)，則使用輸出功率為0.7mW的氦-氖激光(激發(fā)波長543nm)。當(dāng)然也可結(jié)合使用其他光源(如紅色氦-氖激光或半導(dǎo)體激光)與熒光團(tuán)。
光接收裝置9包括，如一個(gè)帶有計(jì)算機(jī)控制顯示器(CCD)(用于二維圖形的情況下)的圖像加強(qiáng)儀，或一個(gè)光電倍增管。檢測器10包括一檢測電路和一個(gè)數(shù)據(jù)處理部分。
使固定于支撐裝置1并呈線形排列的容器2沿著箭頭31指出的方向，通過一自動(dòng)給進(jìn)機(jī)制移向檢測部分進(jìn)行檢測。當(dāng)然也可以移動(dòng)包括光源、檢測器在內(nèi)的檢測部分，以代替移動(dòng)容器。
實(shí)例2上述實(shí)例1中，各樣品均使用了不同的容器。但如圖5所示，也可以使用平板凝膠。在這種情況下，可將樣品注入平板凝膠3的各槽內(nèi)。在由石英制成的凝膠支撐裝置13支持的平板凝膠3中制成許多樣品槽12。按實(shí)施例1中所述的同樣方法除去分離出的游離DNA探針，并使樣品槽暴露于激發(fā)光源6發(fā)出的光11下，以檢測熒光。按箭頭51所示方向移動(dòng)凝膠3，并檢測各樣品槽的熒光。圖6顯示了板狀凝膠3暴露于由凝膠側(cè)面方向提供激光11的例子。圖6所示的實(shí)例中，可同時(shí)照射并掃描所有樣品槽，通過一高敏感性行式感受器15同時(shí)檢測得自許多樣品槽的信息。圖象放大儀與二極管陳列的結(jié)合被用作高敏感行式感受器15。圖6中，數(shù)字6標(biāo)示一激發(fā)光源，13為一凝膠支撐裝置、14為一濾光鏡系統(tǒng)、16為一數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，61為一箭頭指示凝膠掃描的移動(dòng)方向。
實(shí)例3為了處理比上面實(shí)例中所述者更大量的樣品，也可使用如圖7所示的在板狀表面上布有槽的凝膠板。在這種情況下，可按圖3和5中所示的方法檢測各槽的熒光，按圖6所示的方法逐行檢測，或通過整個(gè)表面照射用二維檢測儀檢測。用光進(jìn)行整個(gè)表面照射，如可使用由透鏡系統(tǒng)發(fā)出的激光或使用掃描激光。圖7中，數(shù)字3、12和13分別指示帶槽的凝膠平板、樣品槽及凝膠支撐裝置。凝膠支撐裝置13是用石英制成的。
上述各實(shí)例中，不僅可對(duì)由雜交DNA發(fā)出的熒光進(jìn)行定量檢測，而且可使檢測時(shí)間減少到大約15分鐘或更短，而現(xiàn)有技術(shù)中則需要近一天的時(shí)間。
上述各實(shí)例中，分離和檢測是分開進(jìn)行的。但也可以將這些系統(tǒng)組合在一套裝置中。
如上所述，可按照本發(fā)明在短時(shí)間內(nèi)檢測基因，而無須使用放射性核素進(jìn)行標(biāo)記，也不必將待檢DNA固定于濾膜上。再者，本發(fā)明還具有可定量測定熒光強(qiáng)度的優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種基因檢測方法，其包括下述步驟Ⅰ)制備一熒光標(biāo)記之、與被檢基因互補(bǔ)的DNA探針；Ⅱ)將樣品基因與所說的DNA探針混合，以使待檢基因與所說的DNA探針雜交；Ⅲ)在凝膠(3)上用電泳方法將與待檢基因雜交的DNA探針同游離DNA探針分離開，從而由所說的凝膠(3)中除去所說的游離DNA探針；以及Ⅳ)用光學(xué)方法檢測已除去了游離DNA探針的所得凝膠(3)，以檢測熒光標(biāo)記并已雜交的DNA探針。
2.一種基因檢測方法，其包括以下步驟Ⅰ)將樣品基因與互補(bǔ)于待測基因并用熒光標(biāo)記的DNA探針混合并進(jìn)行雜交，從而形成雜交DNA探針與游離DNA探針的混合物;Ⅱ)將所說的混合物由其一端注入電泳凝膠(3)中;Ⅲ)以電泳方法將所說凝膠(3)中的所說的雜交DNA探針與所說的游離DNA探針分離開，從而使所說的游離DNA探針流入與所說凝膠(3)下游端相接觸的緩沖液(4)中，而只使已雜交的DNA探針留在所說的凝膠(3)內(nèi);以及Ⅳ)在完成上述步驟Ⅲ)后，使所說的凝膠(3)暴露于激發(fā)光(11)并檢測所產(chǎn)生的熒光(20)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的基因檢測方法，其中所說的凝膠是聚丙烯酰胺凝膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的基因檢測方法，其中所說步驟Ⅲ)中的遷移時(shí)間定義為預(yù)先確定的足以使所說的游離DNA探針流入所說緩沖液(4)中的時(shí)間。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的基因檢測方法，其中所說凝膠的長度為5cm或短于5cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的基因檢測方法，其中所說的凝膠(3)被裝在園柱形樣品容器(2)內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的基因檢測方法，其中所說的凝膠(3)在其上表面帶有許多用于注射樣品的槽。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的基因檢測方法，其中所說的凝膠(3)是平板狀的，且在其上表面上有許多以二維形式注射樣品的槽。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的基因檢測方法，其中步驟Ⅲ)所說的電泳分離是在許多泳道上進(jìn)行的，且所說步驟Ⅳ)中熒光(20)的檢測是隨著將各泳道移向暴露于激發(fā)光(11)的區(qū)域而連續(xù)進(jìn)行的。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的基因檢測方法，其中所說的步驟Ⅲ)所說的電泳分離是在帶有許多遷移泳道的凝膠上進(jìn)行的，且所說的步驟Ⅳ)中的熒光檢測是使激發(fā)光(11)光線由之通過時(shí)同時(shí)照射按一個(gè)方向排列的所說的泳道，并在此同時(shí)沿著垂直于激發(fā)光的方向(61)移動(dòng)凝膠，以用行式感受器檢測熒光。
11.一種基因檢測裝置，其包括一個(gè)用于對(duì)熒光標(biāo)記的樣品進(jìn)行電泳凝膠遷移，以使具有小堿基長度的游離DNA探針流入與所說凝膠(3)之下游端接觸的緩沖液(4)中的電泳分離器(25);一個(gè)當(dāng)所說的游離DNA探針流入所說的緩沖液(4)之后，用于激發(fā)保留于從所說電泳分離器(25)中除去之所說凝膠(3)內(nèi)的樣品發(fā)射熒光的激發(fā)光源(6);以及用于檢測由所說樣品產(chǎn)生之熒光的裝置。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的基因檢測裝置，其中所說的凝膠(3)是聚丙烯酰胺凝膠。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的基因檢測裝置，其中所說的凝膠(3)的長度為5cm或短于5cm。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的基因檢測裝置，其中所說的凝膠(3)被裝在一園柱形樣品容器(2)內(nèi)。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的基因檢測裝置，其中所說的凝膠(3)在其上表面帶有許多使用于注射樣品的槽。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的基因檢測裝置，其中所說的凝膠(3)是平板狀的，且在其上表面上有許多便于以二維形式注射樣品的槽。
17.根據(jù)權(quán)利要求11的基因檢測裝置，其進(jìn)一步包括一個(gè)使由所說電泳分離器(25)中取出之至少一片所說凝膠(3)的許多遷移泳道連續(xù)地移向暴露於激發(fā)光的區(qū)域的機(jī)械裝置。
18.根據(jù)權(quán)利要求11的基因檢測裝置，其中所說的激發(fā)光源(6)被置于能夠使位于所說凝膠之一個(gè)方向上的許多遷移泳道同時(shí)暴露于光源的位置上，且具有能以垂直于所說激發(fā)光(11)的方向(61)移動(dòng)所說凝膠的裝置，而所說用于檢測熒光的裝置裝有一行式感受器。
全文摘要
本發(fā)明的基因檢測方法包括以下步驟使樣品基因與互補(bǔ)于待檢基因并用熒用標(biāo)記的DNA探針混合并進(jìn)行雜交，從而形成雜交DNA探針與游離DNA探針的混合物；將所說的混合物由所說凝膠的一端注入電泳凝膠中；用電泳法將已雜交的DNA探針與游離的DNA探針分離開，從而使游離的DNA探針流入緩沖溶液內(nèi)；使已經(jīng)除去了游離DNA探針的凝膠暴露于激發(fā)光下并檢測所產(chǎn)生的熒光。因此，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的基因檢測方法和其裝置能夠獲得定量的結(jié)果，并可顯著地縮短檢測時(shí)間。
文檔編號(hào)F04B39/00GK1038499SQ8810528
公開日1990年1月3日 申請(qǐng)日期1988年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1988年6月5日
發(fā)明者神原秀記 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日立制作所