專利名稱：通過原位產(chǎn)生的金屬納米粒子對核酸選擇性敷金屬的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過原位產(chǎn)生的金屬納米粒子對核酸直接和選擇性敷金屬的改進方法，所述改進方法可以用于納米導(dǎo)線(nanowires)的形成、用于允許高密度布置的電子網(wǎng)絡(luò)和電路。
另外，核酸的“金屬化”是已知，是指在一個金屬原子和所述核酸內(nèi)的一個位點之間直接結(jié)合的過程，尤其是與嘌呤核苷酸(G和A)的N-7原子直接結(jié)合的過程。這類反應(yīng)已經(jīng)進行了廣泛地研究，因為它們與抗癌藥物(大多數(shù)是Pt(II)或Pt(IV)絡(luò)合物(“鍍鉑(platination)”))的機制相關(guān)。表現(xiàn)出這種行為的其它金屬絡(luò)合物包括Pd、Ru、Au、Rh的絡(luò)合物。為了以這種方式結(jié)合，所述絡(luò)合物需要至少一種“不穩(wěn)定的”配體作為“離去基團”。
此外，核酸結(jié)合劑作為抗癌藥物已經(jīng)進行了廣泛地研究。非共價結(jié)合劑包括“嵌入劑”和“溝結(jié)合劑”。共價結(jié)合的試劑一般稱為“烷化劑”。已知每類試劑的許多實例，以及具有結(jié)合功能的許多分子。針對特定堿基對組合或序列或其它“識別位點”的選擇性是高度可調(diào)諧的(例如“藥物尋靶”)。
在1999年1月28日公布的WO 99/04440中描述了用于DNA敷金屬的三步法。首先，通過Ag+/Na+離子交換以及在Ag+和DNA核苷酸堿基之間形成絡(luò)合物，使銀離子(Ag+)沿所述DNA進行定位。然后，用堿性氫醌溶液，使所述銀離子/DNA絡(luò)合物還原，形成結(jié)合于所述DNA骨架的銀納米粒子。所述銀納米粒子隨后用氫醌和Ag+的酸性溶液在弱光照條件下進行“顯影”，這與標準照相法類似。這種方法產(chǎn)生寬度約為100nm、微分電阻約為10MΩ的銀導(dǎo)線。
然而，按照WO 99/04440中所述方法產(chǎn)生的寬度為100nm、尤其是微分電阻約為10MΩ的銀導(dǎo)線不能滿足與高密度布線和高密度電路相關(guān)的工業(yè)需求。
在WO 99/04440中描述的敷金屬法類似于通過銀染色檢測DNA片段的方法。已知這些方法導(dǎo)致所述DNA片段的非特異性染色并且不能鑒別不同的DNA序列。對核酸鏈的某些區(qū)域進行敷金屬而不對其它區(qū)域進行敷金屬的能力對于開發(fā)基于DNA的納米電子器件可能是關(guān)鍵的。
此外，Pompe等(Pompe等(1999)Z.Metallkd.90，1085；Richter等(2000)Adv.Mater.12，507)描述了DNA作為敷金屬的模板，以產(chǎn)生金屬納米導(dǎo)線。他們的敷金屬法包括用Pd(CH3COO)2水溶液將DNA處理2小時，然后加入作為還原劑的二甲胺硼烷(DMAB)溶液。在加入所述還原劑的幾秒鐘內(nèi)，直經(jīng)為3-5nm的鈀納米粒子在所述DNA上生長。大約1分鐘后，達到準連續(xù)覆蓋，金屬聚集物的大小為20nm。
核酸合成和修飾技術(shù)一直是大量出版物的主題。具體地說，這些方法描述于Bioorganic ChemistryNucleic Acids(S.M.Hecht編著，Oxford University Press，1996)和Bioconjugate Techniques(G.T.Hermanson編著，Academic Press，1996)中。更具體地說，在BioorganicChemistryNucleic Acids中M.Van Cleve所述章節(jié)(第3章，第75-104頁)描述了用于從較小的單位裝配雙鏈核酸的“退火”和“連接”技術(shù)。在同一書中M.J.O’Donnell和L.W.McLaughlin所述章節(jié)(第8章，第216-243頁)和在Bioconjugate Techniques_中的一個章節(jié)(第17章，第639-671頁)描述了化學(xué)修飾核酸和寡核苷酸以及共價連接報道基團(熒光團、自旋標記物等)的方法。這些技術(shù)也已經(jīng)用來連接金屬絡(luò)合物，例如用作鍵裂的氧還活性劑和催化劑，但是它們沒有被用于敷金屬目的。
化學(xué)修飾的一個實例是“溴活化”。例如與N-溴丁二酰亞胺的反應(yīng)引起在鳥嘌呤殘基的C-8位置和胞嘧啶的C-5上溴化(圖7)。然后，胺親核體可以通過親核置換偶聯(lián)到這些位置，以使各種官能團引入核酸中。用這種方法衍生化的位點在堿基配對期間不涉及氫鍵鍵合，因些雜交能力沒有明顯受干擾。
上述DNA敷金屬的兩個現(xiàn)有技術(shù)的實例以及本發(fā)明利用照相膠片顯影和無電敷鍍中存在的原理。這些方法包括兩個步驟(1)小金屬納米粒子(或簇)的形成和(2)通過無電淀積一種金屬使所述粒子增大，所述金屬可以與第一種金屬相同或不同。因此，將最初形成的粒子用作隨后金屬淀積的成核點。
從例如US 5,503,877和US 5,560,960中了解“兩步”無電敷鍍法。首先，將待敷鍍的襯底暴露于含有金屬離子種類的溶液中，然后，將其暴露于使所述金屬離子種類還原成金屬催化劑的還原劑溶液中。所述催化金屬通常是Pd，但也可以是Pd、Cu、Ag、Au、Ni、Pt、Ru、Rh、Os和Ir中的至少一種，并且通常與一種含有至少一個氮原子的有機配體結(jié)合。所述被淀積的金屬可以是磁性金屬，例如Co、Ni、Fe及合金，所述金屬可以含有由所述還原劑引入的B或P(例如氫硼化物或次磷酸鹽(hypophosphite)，參見US 3,986,901；US 4,177,253)。
這一問題通過用于產(chǎn)生金屬納米粒子-核酸復(fù)合材料的本發(fā)明方法得以解決，其中使一種核酸特異性金屬絡(luò)合物與一種核酸反應(yīng)，以產(chǎn)生一種金屬絡(luò)合物-核酸綴合物，去除未綴合的金屬絡(luò)合物和/或未綴合的副產(chǎn)物，然后將所述金屬絡(luò)合物-核酸綴合物與一種還原劑反應(yīng)，以產(chǎn)生一種金屬納米粒子-核酸復(fù)合材料。
本發(fā)明提供一種對核酸(例如DNA)直接和選擇性敷金屬的改進方法。加入所述還原劑后，采用AFM在所述DNA上不能觀察到金屬簇形成。這與由Richter等描述的方法相反，在Richter等描述的方法中在所述DNA上形成不規(guī)則的簇，它的最小尺寸約與所述DNA本身的直經(jīng)相同，表明采用這種方法所述金屬粒子在所述DNA上無控制地生長。按照本發(fā)明敷金屬的DNA的GoldEnhance處理還表明，所述敷金屬作用主要限于DNA，因此非常均質(zhì)。盡管如此，所述敷金屬的DNA仍可用于無電金屬淀積法，以產(chǎn)生納米導(dǎo)線或其它納米組分。
雖然Pompe等描述的敷金屬法代表比WO 99/04440中所述方法顯著改進，然而，最初生長的鈀納米粒子比DNA本身寬得多(雙鏈DNA寬約2nm)。本發(fā)明描述了一種在雙鏈DNA上產(chǎn)生不比所述DNA寬的鈀納米粒子的方法；這些粒子對于金的無電淀積是催化性，并可能因此以受控方式增大。此外，與Pompe等的方法相反，在按照本發(fā)明產(chǎn)生的納米粒子/DNA復(fù)合材料中的亞納米大小的鈀粒子隨后是穩(wěn)定的，至少穩(wěn)定數(shù)周或數(shù)月。因此，一次性制備的所述復(fù)合材料可以用于例如在不同時間在各種條件下的納米導(dǎo)線的生產(chǎn)。此外，本發(fā)明通過提供數(shù)種類型的納米粒子前體以及使它們與核酸結(jié)合的方法，擴大了對核酸內(nèi)的預(yù)定位點或區(qū)段敷金屬的可能性。
按照本發(fā)明，所述核酸組分可以溶于一種溶液中，在襯底上固定化或在一種半固體狀態(tài)下(例如在一種凝膠中)固定化，而進行反應(yīng)。
用于敷金屬的核酸可以選自DNA、RNA、PNA、CNA、寡核苷酸、DNA的寡核苷酸、RNA的寡核苷酸、引物、A-DNA、B-DNA、Z-DNA、DNA的多核苷酸、RNA的多核苷酸、核酸的T-接頭、核酸的三鏈體和四鏈體、非核酸聚合物區(qū)-核酸嵌段共聚物及其組合。嵌段共聚物的合適的非核酸聚合物可以是多肽、多糖、像葡萄糖或人工聚合物、像聚乙二醇(PEG)，并且一般是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述核酸可以或者是雙鏈核酸或者是單鏈核酸。
在一種按照本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述金屬絡(luò)合物-核酸綴合物通過金屬化和/或可相互作用的配體結(jié)合而形成。
甚至更優(yōu)選的是一種按照本發(fā)明的方法，所述方法的特征在于所述核酸特異性金屬絡(luò)合物選自二氯·(2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶)合鉑(II)、順-二氯·二氨合鉑(II)(cis-diaminodichloroplatinum(II))和具有連接或整合(integrated)的核酸可相互作用基團的金屬絡(luò)合物，所述核酸可相互作用基團像嵌入劑、溝結(jié)合劑和烷化劑。
在按照本發(fā)明方法的再一優(yōu)選實施方案中，通過層析，像凝膠過濾或離子交換；沉淀，像乙醇沉淀；或沖洗，例如用水或鹽水溶液沖洗，從未綴合的金屬絡(luò)合物和/或未綴合的副產(chǎn)物中分離所述金屬絡(luò)合物-核酸綴合物。
在按照本發(fā)明方法的又一實施方案中，所述金屬絡(luò)合物-核酸綴合物與至少一種選自以下的還原劑反應(yīng)氫化硼、氫化硼的鹽、通式為L∶BH3的路易斯堿∶硼烷絡(luò)合物(其中L可以為胺、醚、膦或硫化物)、肼及衍生物、羥胺及衍生物、次磷酸鹽、甲酸鹽、連二亞硫酸鹽和H2。
一個甚至更優(yōu)選的實施方案的特征在于以氣態(tài)還原劑的形式使用所述還原劑。
一般而言，按照本發(fā)明的方法可以用于對核酸選擇性敷金屬。優(yōu)選的金屬納米粒子是含有至少一種選自以下的那些金屬Fe、Co、Ni、Cu、Ru、Rh、Pd、Ag、Os、Ir、Pt、Au及這些金屬的組合(例如合金)。
優(yōu)選的一種方法的特征在于所述金屬納米粒子有對于無電敷金屬的催化活性。更優(yōu)選的是其中所述金屬納米粒子不可以通過原子力顯微鏡術(shù)(atomic force microscopy)進行觀測和/或所述金屬納米粒子的直經(jīng)小于3nm的方法。
本發(fā)明的主要問題還可通過一種方法加以解決，所述方法還包括用一種無電敷鍍?nèi)芤禾幚硭鼋饘偌{米粒子-核酸復(fù)合材料中的金屬納米粒子的步驟，以便增大所述金屬納米粒子。
在另一個實施方案中，將所述金屬絡(luò)合物-核酸復(fù)合材料如下進行處理溶于一種溶液中，在一種襯底上固定化或在一種半固體狀態(tài)下(例如在一種凝膠中)固定化。
在按照本發(fā)明方法的再一優(yōu)選實施方案中，所述金屬納米粒子用含選自以下金屬的混合物的無電敷鍍?nèi)芤禾幚鞦e、Co、Ni、Cu、Ru、Rh、Pd、Ag、Pt、Au或這些金屬的組合(例如合金)或者磁性的和/或磁化的Fe、Co、Ni、或者這些金屬的組合(例如合金)或者這些金屬與B或P的組合(例如合金)。
本發(fā)明的主要問題進一步通過按照本發(fā)明方法可以獲得的金屬納米粒子-核酸復(fù)合材料得到解決。
優(yōu)選的是，所述金屬納米粒子-核酸復(fù)合材料的特征在于所述納米粒子的直經(jīng)小于3nm。更優(yōu)選的是一種金屬納米粒子-核酸復(fù)合材料，其特征在于所述納米粒子不可以通過原子力顯微鏡術(shù)進行觀測。
在本發(fā)明的再一方面，所述問題通過生產(chǎn)一種納米導(dǎo)線的方法加以解決，所述方法的特征為以下步驟a)提供一種按照本發(fā)明的金屬納米粒子-核酸復(fù)合材料和b)通過按照本發(fā)明的金屬無電淀積使所述納米粒子生長，最好是受控生長。
在本發(fā)明的又一方面，所述問題通過按照本發(fā)明的方法可獲得的一種線性布置的金屬納米粒子或一種納米導(dǎo)線加以解決。所述金屬納米粒子可以是催化性的或磁化的。再一方面，所述問題通過本發(fā)明方法之一可獲得的一種納米導(dǎo)線加以解決。本發(fā)明的納米導(dǎo)線可以構(gòu)成包含至少一根納米導(dǎo)線的電子網(wǎng)絡(luò)或包含至少一個按照本發(fā)明的電子網(wǎng)絡(luò)的電路。另外，本發(fā)明的納米導(dǎo)線可以以沒有完全敷金屬的形式用作電子元件，其中在沿所述核酸鏈定位的單個納米粒子之間存在近乎絕緣的間隔。另一方面，所述納米導(dǎo)線可以是完全導(dǎo)電的或可以在一端或兩端含有絕緣部分，或者所述絕緣部分可以在所述導(dǎo)線本身內(nèi)，使得納米導(dǎo)線由單個導(dǎo)電島組成，這些本發(fā)明結(jié)構(gòu)可以構(gòu)成包含至少一根納米導(dǎo)線的電子網(wǎng)絡(luò)或電路，或者可以是包含至少一根納米導(dǎo)線的電子網(wǎng)絡(luò)或電路的一部分。在這樣的電子網(wǎng)絡(luò)或電路中，在兩根或兩根以上的導(dǎo)線之間可以形成多個接點，其中每根導(dǎo)線在包含所述納米導(dǎo)線的接點近側(cè)具有一個連接區(qū)段。此外，包含納米導(dǎo)線的網(wǎng)絡(luò)可以是混合電子結(jié)構(gòu)的部件。
此外，所述問題通過電路的兩根或兩根以上的導(dǎo)線之間的接點加以解決，其中每根導(dǎo)線在包含一根按照本發(fā)明納米導(dǎo)線的接點近側(cè)具有一個末端區(qū)段。
本發(fā)明的實施方案主要包括四個步驟步驟(1)使金屬絡(luò)合物與核酸結(jié)合，產(chǎn)生金屬絡(luò)合物-核酸綴合物。
在該步驟中主要根據(jù)結(jié)合性質(zhì)確定用于核酸和用于其特定結(jié)構(gòu)域的敷金屬法的特異性。最直接的結(jié)合方法是“金屬化”。這種方法是指在一個金屬原子和所述核酸上的一個位點、尤其是與嘌呤核苷酸(G和A)的N-7原子之間的直接(“共價”)鍵合。這些位置示于圖7中。這樣的反應(yīng)已經(jīng)得到了廣泛地研究，因為它們與抗癌藥物(大多數(shù)為Pt(II)或Pt(IV)絡(luò)合物(“鍍鉑”))的機制相關(guān)。Pt(IV)絡(luò)合物一般被認為是“前體藥物”，由于它們在體內(nèi)被還原成相應(yīng)的Pt(II)絡(luò)合物，然后成為活性絡(luò)合物。
已知與核酸共價結(jié)合的Pt(II)絡(luò)合物一般是通式為Pt(L1)(L2)(X)(Z)和Pt(L1)(L2)(L3)(X)的正方平面4-配位種類，其中L1、L2和L3代表對置換相對惰性的配體(“非不穩(wěn)定的”)，而X和Z代表對置換相對活性的配體(“不穩(wěn)定的”)。在這些通式中，配體L1、L2和L3可以相同或不同，以及配體X和Z可以相同或不同。此外，配體L1、L2和L3可以通過橋連基連接到另一種配體或連接到配體X或Z。而且，配體X和Z相對于Pt(II)原子彼此之間相對而言可以是“順式”或“反式”位置。再者，所述絡(luò)合物可以含有兩個或兩個以上的Pt(II)原子。這些變化中的某些變化示于圖8中。
非不穩(wěn)定配體(L1、L2和L3)中直接與Pt(II)配位的原子一般是N、P或S。不通過橋連基連接的配體稱為“單齒”配體。當(dāng)兩個配體被連接時，它們稱為“二齒”配體，而當(dāng)三個配體被連接時，它們?yōu)椤叭X”配體。單齒N-配體通常是胺，單齒P-配體通常是膦，而單齒S-配體通常是硫醇、硫醚或硫代羰基。胺配體可以是氨、伯胺、仲胺或叔胺。這些包括芳香胺例如吡啶和苯胺。也有許多已知與核酸共價結(jié)合的Pt(II)絡(luò)合物中的二齒N-N配體的實例。這些包括例如1，2-乙二胺、1，2-二氨基丙烷、1，3-二氨基丙烷、1，2-環(huán)己二胺和2，2’-聯(lián)吡啶。二齒N-P和N-S配體的實例也是已知的，三齒N-N-N配體也是已知的，例如2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶(terpy)和二亞乙基三胺(dien)。
一般用作好的離去基團的不穩(wěn)定配體X和Z的實例包括鹵化物、水、(二烷基)亞砜、硝酸根、硫酸根、羧酸根、二羧酸根、碳酸根、磷酸根、焦磷酸根、磷酸酯、膦酸根、亞硝酸根、亞硫酸根、磺酸根、β-二酮酸根、烯烴、硒酸根、方形酸根、抗壞血酸根和氫氧化物。這些配體可以是二齒配體，如在硒酸根和二羧酸根(例如草酸和1，1-環(huán)丁烷二羧酸)的情況下。它們也可以是含有非不穩(wěn)定配體的分子的一部分，例如在氨基酸(羧基和伯胺基團)和吡啶甲酸(羧基和吡啶基團)中。
除鉑以外的其它金屬的絡(luò)合物已顯示出用作抗癌藥物的潛力。這些包括Pd、Ru、Au和Rh的絡(luò)合物，所述絡(luò)合物往往或者是4-配位(例如正方平面幾何形狀)或者是6-配位(例如八面體幾何形狀)。如在Pt(II)抗癌藥物的情況下，它們還具有至少一個離去基團，通過所述離去基團發(fā)生核酸的金屬化。由于抗癌藥物的嚴格標準，這些其它金屬絡(luò)合物幾乎沒有在臨床上獲得成功。如果所述絡(luò)合物太不穩(wěn)定，則很可能到達其在腫瘤中作用位點之前與生理性親核體(蛋白質(zhì)等)相互作用，由此失活，要不就增加毒性的危險性。另一方面，如果所述絡(luò)合物太過惰性，則它可能不能按需與其生物分子靶相互作用而產(chǎn)生抗癌效應(yīng)。Pt(II)絡(luò)合物一般太不穩(wěn)定，而Rh(III)的那些絡(luò)合物一般是太過惰性；用Au(III)絡(luò)合物的一個問題是它們?nèi)菀妆簧磉€原劑還原的事實。當(dāng)這些特性成為應(yīng)用所述絡(luò)合物作為抗癌藥物的問題時，更不用說，它們對于應(yīng)用到核酸的敷金屬也是如此。實際上，與其Pt(II)類似物相比反應(yīng)性增強的Pt(II)絡(luò)合物可能有利于這種應(yīng)用，并且在Au(III)絡(luò)合物的情況下，可以避免外加還原劑。
除具有至少一種離去基團外，所述金屬化絡(luò)合物還應(yīng)能夠被還原成表現(xiàn)出對無電敷鍍過程有催化活性的金屬狀態(tài)。除Pt外，一般是Pd和Au的絡(luò)合物將最可能達到這些標準。然而，也可使用Ru和Rh的絡(luò)合物。這些金屬化試劑的應(yīng)用與常用的鍍鉑試劑相比擴大了對于核酸內(nèi)序列或區(qū)段的選擇性，并且還擴大了對于無電敷鍍的催化活性的范圍。
在本發(fā)明步驟(1)的另一個實施方案中，使寡核苷酸亞單位內(nèi)的特定堿基金屬化。這些亞單位通過在更長核酸的互補區(qū)段上雜交而進行裝配。所述寡核苷酸亞單位中的靶堿基的金屬化可以或者在雜交之前或者在雜交之后進行。更長核酸組分的非互補區(qū)段不與金屬化的寡核苷酸雜交；這些空位可以用其它寡核苷酸填補，例如用沒有金屬化的互補寡核苷酸填補。本實施方案的兩種變化用圖解法示于圖9和

圖10中。在一種情況(圖9)下，敷金屬發(fā)生在核酸中原有的位點上，而在另一情況(圖10)下，金屬化發(fā)生在已通過化學(xué)修飾導(dǎo)入的位點上。寡核苷酸亞單位中特定堿基的化學(xué)修飾可以或者在雜交之前或者在雜交之后進行。
在用圖解法示于圖9的實例中，具有序列TTGTT的五核苷酸被用作進行金屬化的亞單位，而具有一個三齒(N-N-N)配體和一個離去基團(X)的金屬絡(luò)合物被用作金屬化試劑。在溫和條件(例如室溫和中性pH)下，胸腺嘧啶(T)殘基基本上是惰性的，而只有鳥嘌呤(G)殘基被金屬化裝配金屬化的雜交構(gòu)建體的兩種途徑示于該圖中。在一種方法中，所述寡核苷酸被金屬化(i)，然后與更長的核酸組分雜交(ii)在另一種方法中，所述寡核苷酸首先雜交(iii)，然后金屬化(iv)。這個第二種方法可能需要使用所述更長核酸組分中的修飾堿基，以防止在步驟(iv)期間該組分金屬化。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸亞單位由4-20個堿基組成，所述金屬化試劑是Pt、Pd、Au、Ru或Rh的絡(luò)合物。
在用圖解法示于圖10的實例中，具有序列TTC*TT的五核苷酸被用作進行金屬化的亞單位，其中C*代表一個已被化學(xué)修飾以連接一個咪唑(Im)基團作為金屬配體的胞嘧啶殘基。通過例如溴活化和用1-(3-氨基丙基)咪唑的親核置換，所述咪唑基團可以被連接到胞嘧啶的C-5位置。具有一個三齒(N-N-N)配體和一個離去基團(X)的金屬絡(luò)合物被用作金屬化試劑，如在圖9中的實例中一樣。同在該實例中一樣，裝配金屬化的雜交構(gòu)建體的兩種途徑是可行的。在一種方法中，所述寡核苷酸被金屬化(i)，然后雜交(ii)。在另一種方法中，所述寡核苷酸首先雜交(iii)，然后金屬化(iv)。這個第二種方法可能需要使用所述更長核酸組分中的修飾堿基，以防止在步驟(iv)期間該組分金屬化。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸亞單位由4-20個堿基組成，所述金屬化試劑是Pt、Pd、Au、Ru或Rh的絡(luò)合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過一種方法完成步驟(1)，在所述方法中所述絡(luò)合物中與金屬配位的配體沒有在結(jié)合后被取代。這種類型的結(jié)合可以定為“外層”方法。一種金屬離子(例如Mg2+)藉此被一種帶類似電荷的金屬絡(luò)合物(例如[Pt(NH3)4]2+)取代的抗衡離子交換是一個實例，但這種簡單交換過程提供在核酸內(nèi)的核苷酸堿基序列之間或在核酸和其它帶負電物質(zhì)之間的鑒別即使有也很少。通過將核酸可相互作用基團連接到金屬絡(luò)合物，達到對于核酸及其中特定結(jié)構(gòu)域的特異性。這類基團包括現(xiàn)有技術(shù)已知的嵌入劑、溝結(jié)合劑和烷化劑。所述核酸可相互作用基團可以是與金屬離子(如在“金屬嵌入劑”中)配位的配體的組成部分，或者它可以被共價連接到配體上。按照本發(fā)明使用的金屬絡(luò)合物的主要條件是它對配體交換相對穩(wěn)定，使得所述絡(luò)合物可以完整地被傳遞到靶核酸結(jié)合部位。此外，它應(yīng)該能夠被還原成對于無電敷鍍表現(xiàn)出催化活性的金屬狀態(tài)。周期表的8族和1B族的金屬的絡(luò)合物基本上滿足了這兩個條件。
可用于這種步驟(1)的實施方案的化合物的通用結(jié)構(gòu)如下INT-CON-LIG-M(L)n其中INT為一種核酸可相互作用基團，LIG為一種非不穩(wěn)定的配體，而M(L)n為與LIG結(jié)合以完成金屬M的配位需要的配位不飽和金屬-配體絡(luò)合物?；鶊FCON連接INT基團和LIG基團并且可以用來在空間上隔開INT基團和LIG基團和/或指導(dǎo)它們的相對定向。
適于按照本實施方案使用的金屬嵌入劑絡(luò)合物代表通用結(jié)構(gòu)INT-CON-LIG-M(L)n的一種特殊情況。由于INT和LIG的功能是連在一起的，因此CON不可定義為一種獨立基團。合適的金屬嵌入劑包括具有通式(ICL)M(L)n的絡(luò)合物，其中ICL為一個平面芳族配體，而M(L)n為與ICL結(jié)合以完成金屬M的配位需要的配位不飽和金屬-配體絡(luò)合物。合適的金屬M包括Pt、Pd和Au。已知其金屬絡(luò)合物通過嵌入作用與核酸相互作用的平面芳族二齒配體包括8-羥基喹啉和α-二亞胺例如2，2’-聯(lián)吡啶、1，10-菲咯啉、2，2-聯(lián)喹啉、二吡啶并[3，2-a2’3’-c]吩嗪及其衍生物。2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶(terpy)是三齒嵌入劑配體的一個實例。配體L在基團M(L)n中的功能主要是為所述金屬提供相對取代惰性的配位環(huán)境，因此各種各樣的非不穩(wěn)定的單齒或多齒N-、P-或S-配體是可行的。合適的二齒配體包括雙胺例如1，2-乙二胺、1，2-二氨基丙烷、1，3-二氨基丙烷和1，2-環(huán)己二胺。
加入Pt(II)、Pd(II)或Au(III)的絡(luò)合物的這類化合物的具體實例示于圖11中。通過將試劑1-(3-氨基丙基)咪唑共價偶聯(lián)到核酸可相互作用基團制備這些化合物，產(chǎn)生INT-CON-LIG的實例，其中所述配體是所附加的咪唑基團的N-3原子。然后，INT-CON-LIG化合物與M(dien)(X)形成的金屬絡(luò)合物反應(yīng)，其中dien為二亞乙基三胺，而X為一個離去基團例如硝酸根。在這些實例中的核酸可相互作用基團由蒽醌(嵌入劑)、陽離子卟啉(溝結(jié)合劑)和氮芥(烷化劑)組成。
在本發(fā)明步驟(1)的再一個實施方案中，使取代-惰性金屬絡(luò)合物共價連接到寡核苷酸亞單位內(nèi)的特定堿基。這些亞單位通過在更長核酸互補區(qū)段上雜交而進行裝配。所述寡核苷酸內(nèi)特定堿基的共價修飾可以或者在雜交之前或者在雜交之后進行。所述更長核酸組分的非互補區(qū)段不與如此修飾的寡核苷酸雜交；這些空位可以用其它寡核苷酸填補，例如用沒有連接金屬絡(luò)合物的互補寡核苷酸填補。在用圖解法示于圖12的實例中，具有序列TTG*TT的五核苷酸被用作進行金屬化的亞單位，其中G*代表一個已被化學(xué)修飾以連接一個氨基(-NH2)作為共價結(jié)合部位的鳥嘌呤殘基。所述胺基團可以通過例如溴活化和用1，4-二氨基丁烷的親核置換而連接到鳥嘌呤的C-8位置。在該實例中的取代-惰性金屬絡(luò)合物具有一個三齒(N-N-N)配體和一個單齒胺配體。所述單齒胺配體被用來使一個游離羧酸基團(-COOH)連接到金屬絡(luò)合物。所述金屬絡(luò)合物上的羧酸基團與所述寡核苷酸亞單位上的胺基團縮合形成一個酰胺鍵-(CONH-)，提供在那些組分之間的鍵合。這種縮合可以使用例如碳二亞胺作為偶聯(lián)劑來完成。
裝配所述雜交構(gòu)建體的兩種可能途徑示于圖12中。在一種方法中，所述寡核苷酸被偶聯(lián)到金屬絡(luò)合物(i)，然后雜交至更長的核酸組分(ii)。在另一種方法中，所述寡核苷酸首先雜交(iii)，然后偶聯(lián)到金屬絡(luò)合物(iv)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸亞單位由4-20個堿基組成，所述金屬絡(luò)合物是Pt、Pd、Ru、Au或Rh的絡(luò)合物。
步驟(2)的優(yōu)選實施方案取決于金屬絡(luò)合物-核酸綴合物是溶于溶液中還是在襯底上固定化。當(dāng)在溶液中時，可以通過某種形式的層析(例如凝膠過濾或離子交換)或通過沉淀(例如乙醇沉淀所述綴合物)，從未結(jié)合的金屬絡(luò)合物中分離所述綴合物。當(dāng)所述綴合物被固定化時，可以通過沖洗(例如用水或鹽水溶液)去除未結(jié)合的金屬絡(luò)合物。
步驟(3)可能需要相對強的還原劑。合適的化合物是氫化硼、尤其是氫化硼(BH4)的鹽、通式L∶BH3的路易斯堿∶硼烷絡(luò)合物(其中L可以為胺、醚、膦或硫化物)肼及衍生物、羥胺及衍生物、次磷酸鹽、連二亞硫酸鹽、甲酸鹽和H2。這些試劑中的有些試劑適于作非溶液相處理的氣態(tài)還原劑。
從現(xiàn)有技術(shù)了解到與步驟(4)有關(guān)的方法。簡而言之，在所述復(fù)合材料中的金屬納米粒子用作溶液中金屬離子還原的催化位點，它淀積在所述納米粒子上并增大所述納米粒子。所淀積的金屬可以與所述納米粒子中的金屬相同或不同。所述方法可以用來增強所述復(fù)合材料的導(dǎo)電性或賦予所述粒子磁性特性。
圖2顯示按照實施例4用GoldEnhance溶液處理之前，按照實施例1產(chǎn)生的Pt-DNA復(fù)合材料的AFM圖象。
圖3顯示按照實施例4用GoldEnhance溶液處理之后，按照實施例1產(chǎn)生的Pt-DNA復(fù)合材料的AFM圖象。
圖4顯示示于圖3中的樣品的另一斑點的AFM圖象。
圖5顯示按照實施例5用GoldEnhance溶液處理之前，按照實施例2產(chǎn)生的Pt-DNA復(fù)合材料的AFM圖象。
圖6顯示按照實施例6用GoldEnhance溶液處理之后，按照實施例2產(chǎn)生的Pt-DNA復(fù)合材料的AFM圖象。
圖7顯示核酸的嘌呤核苷酸(G和A)的N-7原子上的最可能的“金屬化”位置；圖8顯示金屬(M)-配體(L1、L2和L3，X或Z)絡(luò)合物的數(shù)種變化，(為了簡明已將電荷省略)；圖9圖示在寡核苷酸亞單位內(nèi)原有位點上的特定堿基的金屬化，(為了簡明已將電荷省略)；圖10圖示在寡核苷酸亞單位內(nèi)通過化學(xué)修飾引入的位點上的特定堿基的金屬化；(為了簡明已將電荷省略)；圖11顯示連接到通式INT-CON-LIG-M(L)n的核酸可相互作用基團的取代-惰性金屬(M)絡(luò)合物的實例；圖12圖示在雜交于更長核酸的互補區(qū)段上之前或之后，取代惰性的金屬絡(luò)合物共價連接于寡核苷酸亞單位內(nèi)的特定堿基；(為了簡明已將電荷省略)；和圖13顯示用GoldEnhance溶液處理之后，未修飾未鍍鉑的DNA的AFM圖象。
圖14顯示用GoldEnhance溶液處理之后，未修飾未鍍鉑的DNA的AFM圖象。
Pt(三聯(lián)吡啶(terpy))-金屬化DNA分子的兩張照片示于圖3和圖4中。圖3顯示覆蓋伸展的DNA區(qū)段的連續(xù)金屬鍍層的存在。這些結(jié)構(gòu)的總厚度在大多數(shù)的位置為3nm-6nm，但也有些島的厚度達到約50nm。圖4是在同一樣品上顯示金屬粒子沿所述伸展DNA區(qū)段的不連續(xù)絲。如圖6中所示，用順-Pt(NH3)2-金屬化DNA已獲得相似的結(jié)果。
將硼氫化鈉(2mg，Sigma-Aldrich制品號21，346-2)溶于0.02MHEPES/NaOH緩沖液(100μl)中，然后將20μl該溶液加入到2.0ml(terpy)Pt-DNA綴合物溶液中。溶液的顏色立即從淺黃色變成淺灰色，但溶液仍保持光學(xué)上透明。30分鐘后獲得的UV-可見光吸收光譜中所產(chǎn)生的變化與膠體Pt的形成一致(圖1)。溶液的pH為7.8。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)金屬納米粒子-核酸復(fù)合材料的方法，所述方法包括將一種核酸特異性金屬絡(luò)合物與一種核酸反應(yīng)，產(chǎn)生一種金屬絡(luò)合物-核酸綴合物，去除未綴合的金屬絡(luò)合物和/或未綴合的副產(chǎn)物，然后，將所述金屬絡(luò)合物-核酸綴合物與一種還原劑反應(yīng)，產(chǎn)生一種金屬納米粒子-核酸復(fù)合材料。
2.一種權(quán)利要求1的方法，其特征在于將所述核酸組分溶于一種溶液中、在一種襯底上固定化或在一種半固體狀態(tài)下例如在一種凝膠中固定化而進行反應(yīng)。
3.一種權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述核酸選自DNA、RNA、PNA、CNA、寡核苷酸、DNA的寡核苷酸、RNA的寡核苷酸、引物、A-DNA、B-DNA、Z-DNA、DNA的多核苷酸、RNA的多核苷酸、核酸的T-接頭、核酸的三鏈體、核酸的四鏈體、非核酸聚合物區(qū)-核酸嵌段共聚物及其組合。
4.一種權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其特征在于所述核酸為雙鏈核酸或單鏈核酸。
5.一種權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其特征在于所述金屬絡(luò)合物-核酸綴合物通過金屬化和/或可相互作用配體結(jié)合而形成。
6.一種權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其特征在于所述核酸的特定堿基被金屬化。
7.一種權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其特征在于所述核酸特異性金屬絡(luò)合物選自二氯·(2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶)合鉑(II)、順-二氯·二氨合鉑(II)和具有連接或整合的核酸可相互作用基團的金屬絡(luò)合物，所述核酸可相互作用基團像嵌入劑、溝結(jié)合劑和烷化劑。
8.一種權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其特征在于通過層析，例如凝膠過濾或離子交換層析；沉淀例如乙醇沉淀；或沖洗例如用水或鹽水溶液沖洗，從未綴合的金屬絡(luò)合物和/或未綴合的副產(chǎn)物中分離所述金屬絡(luò)合物-核酸綴合物。
9.一種權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其特征在于將所述金屬絡(luò)合物-核酸綴合物與至少一種還原劑反應(yīng)，所述還原劑選自氫化硼、氫化硼的鹽；通式L∶BH3的路易斯堿∶硼烷絡(luò)合物，其中L可以為胺、醚、膦或硫化物；肼及衍生物、羥胺及衍生物、次磷酸鹽、甲酸鹽、連二亞硫酸鹽和H2。
10.一種權(quán)利要求9的方法，其特征在于以氣態(tài)還原劑的形式使用所述還原劑。
11.一種權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其特征在于所述金屬納米粒子包含至少一種選自以下的金屬Fe、Co、Ni、Cu、Ru、Rh、Pd、Ag、Os、Ir、Pt、Au或這些金屬的組合(例如合金)。
12.一種權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其特征在于所述金屬納米粒子對于無電敷金屬有催化活性。
13.一種權(quán)利要求1-12中任一項的方法，其特征在于所述金屬納米粒子不可以通過原子力顯微鏡術(shù)進行觀測和/或所述金屬納米粒子的直經(jīng)為小于3nm。
14.一種權(quán)利要求1-13中任一項的方法，所述方法還包括以下步驟用一種無電敷鍍?nèi)芤禾幚硭鼋饘偌{米粒子-核酸復(fù)合材料中的金屬納米粒子，以便增大所述金屬納米粒子。
15.一種權(quán)利要求14的方法，其特征在于將所述金屬絡(luò)合物-核酸復(fù)合材料溶于一種溶液中，在一種襯底上固定化或在一種半固體狀態(tài)下例如在一種凝膠中固定化，來進行處理。
16.一種權(quán)利要求14或15的方法，其特征在于用包含至少一種選自以下的金屬的無電敷鍍?nèi)芤禾幚硭鼋饘偌{米粒子Fe、Co、Ni、Cu、Ru、Rh、Pd、Os、Ir、Ag、Pt、Au或這些金屬的組合(例如合金)。
17.一種權(quán)利要求14或15的方法，其特征在于用包含至少一種選自以下金屬的無電敷鍍?nèi)芤禾幚硭鼋饘偌{米粒子磁性的和/磁化的Fe、Co、Ni或這些金屬的組合(例如合金)或者這些金屬與B或P的組合(例如合金)。
18.一種金屬納米粒子-核酸復(fù)合材料，所述復(fù)合材料可按照權(quán)利要求1-13中任一項的方法獲得。
19.一種權(quán)利要求18的金屬納米粒子-核酸復(fù)合材料，其特征在于所述金屬納米粒子的直經(jīng)小于3nm和/或不可以通過原子力顯微鏡術(shù)進行觀測。
20.一種生產(chǎn)納米導(dǎo)線的方法，其特征為以下步驟提供一種權(quán)利要求18或19的金屬納米粒子-核酸復(fù)合材料，并且通過無電淀積一種權(quán)利要求16或17中任一項的金屬，而使所述納米粒子生長、最好是受控生長。
21.一種線性布置的金屬納米粒子或一種納米導(dǎo)線，所述線性布置的金屬納米粒子或納米導(dǎo)線可按照權(quán)利要求20的方法獲得。
22.一種小規(guī)模網(wǎng)絡(luò)或電路，所述小規(guī)模網(wǎng)絡(luò)或電路包含至少一根權(quán)利要求21的納米導(dǎo)線。
23.權(quán)利要求1-17中任一項的方法的用途，所述用途是用于對核酸選擇性敷金屬。
全文摘要
本發(fā)明提供通過原位產(chǎn)生的金屬納米粒子對核酸直接和選擇性敷金屬的改進方法,其中將一種核酸特異性金屬絡(luò)合物與核酸反應(yīng),產(chǎn)生一種金屬絡(luò)合物－核酸綴合物,去除未綴合的金屬絡(luò)合物和/或未綴合的副產(chǎn)物,然后將所述金屬絡(luò)合物－核酸綴合物與一種還原劑反應(yīng),產(chǎn)生一種金屬納米粒子－核酸復(fù)合材料。所述金屬納米粒子－核酸復(fù)合材料可以用于例如納米導(dǎo)線的形成、用于允許高密度布置的電子網(wǎng)絡(luò)和電路。
文檔編號B82B3/00GK1356336SQ0114291
公開日2002年7月3日 申請日期2001年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月24日
發(fā)明者W·福德, J·維塞爾斯, O·哈納克, A·雅蘇達 申請人:索尼國際(歐洲)股份有限公司