專利名稱：用于選擇和/或處理粒子、特別是細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于選擇和/或處理粒子，特別是由細(xì)胞組成的或包括細(xì)胞 或細(xì)胞物質(zhì)的粒子的方法，并獲得其主要在實(shí)現(xiàn)具有單細(xì)胞上的拆分的方 案中的應(yīng)用。通過細(xì)胞"處理"，在這里和下文中，應(yīng)該理解為意指可以 對(duì)單粒子或細(xì)胞、或它們的組進(jìn)行的任何類型的操作。
現(xiàn)有技術(shù)
授予G. Medoro的PCT/WO 00/69565專利描述了通過利用封閉介電泳 電位(dielectrophoreticpotential)柵格(cages)和集成傳感器，若有的話， 對(duì)粒子進(jìn)行操縱和檢測(cè)/識(shí)別的裝置和方法。所述方法教導(dǎo)在兩維空間中如 何控制獨(dú)立于所有其它粒子的每一粒子。用來捕獲流體介質(zhì)中的懸浮粒子 的力是負(fù)的介電泳。通過對(duì)與集成在相同襯底中的電極陣列和傳感器的每 一元件關(guān)聯(lián)的存儲(chǔ)元件和電路的編程，實(shí)現(xiàn)對(duì)操縱操作的單獨(dú)控制。該裝 置容許分離細(xì)胞，但需要使這些細(xì)胞向著第二微室移動(dòng)，與第一個(gè)細(xì)胞流 動(dòng)地分離。而且，沒有預(yù)見到用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。
Becker等的美國(guó)6,294,063專利描述了一種方法和裝置，其通過可編 程的力的分配來操縱固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)生物材料的包裝(packages)。該專 利也提及傳感器的使用。在該情形中，細(xì)胞的分離也僅通過物理地移動(dòng)細(xì) 胞經(jīng)過整個(gè)裝置發(fā)生。
操縱粒子的又一種力是由電流體動(dòng)力學(xué)(EHD)流產(chǎn)生的粘滯摩擦力， 例如電熱流(ETF)或AC電滲透。在NG. Green, A. Ramos和H. Morgan,物 理學(xué)雜志D:應(yīng)用物理學(xué)(J.Phys.D: Appl.Phys.) 33(2000)中，EHD用來 移動(dòng)粒子。例如PCTWO 2004/071668 Al公開了一種通過利用所謂的電流 體動(dòng)力學(xué)流將粒子濃縮在一些電極上的裝置。
在Medoro等的意大利專利申請(qǐng)BO2005A000481中，報(bào)告了一些用電
6極陣列操縱粒子的方法，以及一些檢測(cè)它們的方法和裝置。此外，在國(guó)際
專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/IT02/00524中描述了一種方法，其中，通過使第一生物實(shí) 體與第二生物實(shí)體(例如，含有DNA的脂質(zhì)體、或微球體)相接觸，而 轉(zhuǎn)化第一生物實(shí)體，其中，將第一生物實(shí)體固定在第一電極陣列所限定的 表面上，所述電極是至少部分選擇地可激活的和可尋址的，朝向至少一個(gè) 第二電極安置，并且與借助于介電泳柵格移動(dòng)的第二生物實(shí)體接觸。
相同申請(qǐng)人名下的PCT IB 2006000636專利申請(qǐng)涉及利用非均勻時(shí)變 力場(chǎng)和集成光學(xué)或阻抗計(jì)傳感器(impedance meter sensor)對(duì)粒子進(jìn)行表 征和/或計(jì)數(shù)的方法和裝置。力場(chǎng)可以是正的或負(fù)的介電泳、電泳或電流體 動(dòng)力學(xué)運(yùn)動(dòng)，其特征在于粒子(固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài))的一組穩(wěn)定平衡點(diǎn)； 通過利用己知為電介質(zhì)上的電潤(rùn)濕的效應(yīng)，同樣的方法可適用于操縱小滴 (液態(tài)粒子)，其目的是對(duì)存在于樣本中的每一粒子的位置起控制作用， 以便以確定性和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使這些粒子移動(dòng)，以集成光學(xué)或阻抗計(jì)傳感器 檢測(cè)它們的存在，和/或表征它們的類型，從而以有效的方法對(duì)它們進(jìn)行計(jì) 數(shù)和操縱。
在相同申請(qǐng)人名下的2006年3月27日的意大利申請(qǐng)?zhí)?TO2006A000226中，描述了用于處理(例如洗滌、培養(yǎng)、等)粒子的方法 和裝置，其中，在層流方案中，將第一流體中懸浮的粒子引入到至少一個(gè) 第一微室或該微室的第一區(qū)域中，其中通過不與第一流體相混合的方式， 在層流方案中，將第二流體引入到微室的至少一個(gè)第二區(qū)域或第二微室 中，并且其中在該微室中激活至少一個(gè)作用于粒子的力場(chǎng)(F)，從而引起 粒子僅在預(yù)定的方向上移動(dòng)，并轉(zhuǎn)移第二流體中的懸浮中的該粒子；優(yōu)選 使用的裝置包括以沿著一個(gè)方向彼此順次排列的至少三個(gè)微室，并且每個(gè) 微室均通過兩個(gè)與微室序列方向垂直的方向彼此錯(cuò)開的開口，與它前面和 后面緊挨著的微室相連。
近期，在文章"單細(xì)胞電穿孔芯片(A single cell electroporation chip)， 芯片上的實(shí)驗(yàn)室(Lab on a Chip), 2005， 5 (1), 38 — 43， Michelle Khine， Adrian Lau， Cristian Ionescu-Zanetti， Jeonggi Seo禾口 Luke P. Lee，，中，描述 了如何通過在單細(xì)胞上進(jìn)行的電穿孔增加細(xì)胞膜的滲透性；通過這種方 法，可以將以別的方式不能滲透過原生質(zhì)膜的極性物質(zhì)(諸如染料、藥物、DNA、蛋白質(zhì)、肽和氨基酸)引入到細(xì)胞中。
文章"用于高效的單細(xì)胞遺傳操縱流經(jīng)微-電穿孔芯片(Flow-through micro-electroporation chip for high efficiency single-cell genetic manipulation),傳感器和執(zhí)行器A:物理的(Sensors and Actuators A: Physical),巻104，刊3， 2003年5月15日，Yong Huang, Boris Rubinsky"
具體描述了單細(xì)胞的遺傳操縱，這在諸如生物學(xué)和生物工藝學(xué)中非常令人 感興趣，所述細(xì)胞是通過利用微-流體通道精確操縱單細(xì)胞的電穿孔芯片獲 得的；如已知地，電穿孔是使用強(qiáng)電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞膜中結(jié)構(gòu)重排的工藝；由 于當(dāng)跨膜電位超過膜的電介質(zhì)穿孔電壓(0.2-1.5￥)時(shí)，穿膜形成孔，這容許
外部物質(zhì)滲入膜并到達(dá)其中包含的細(xì)胞質(zhì)。
單細(xì)胞的電穿孔是令人感興趣的技術(shù)，還因?yàn)樗菰S逐個(gè)細(xì)胞地研究 發(fā)生在細(xì)胞群中的變化，并還研究細(xì)胞內(nèi)化學(xué)，例如，通過為單細(xì)胞提供 特異性表型而激活或阻斷特異的和單一蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，利用基于使 用裝備在芯片上的陣列的工藝，可以實(shí)現(xiàn)HTS檢驗(yàn)(高通量篩選)的裝 置，其與DNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)以及指向特異性細(xì)胞靶標(biāo)(例如受體)的 化學(xué)化合物(例如藥物)均相關(guān)。
而且，單細(xì)胞電穿孔相對(duì)于通常使用的"大量"電穿孔方案而言，是 有利的技術(shù)，所述"大量"電穿孔方案需要非常高的電壓(>103 V)，并不 容許有效地控制單細(xì)胞滲透性，因此，例如，很難重新關(guān)閉預(yù)先張開的孔。
迄今為了獲得單細(xì)胞電穿孔而作出的努力包括使用由碳纖維制成的微 電極(Lundqvist等，1998)和其它技術(shù)諸如充滿電解質(zhì)的毛細(xì)管、微吸移 管和顯微加工芯片。
顯微加工的芯片對(duì)分離單細(xì)胞和集中電場(chǎng)均是理想的。
最后，文章"利用介電泳力控制細(xì)胞破裂"("Controlling cell destruction using dielectrophoretic forces")， A. Menachery禾卩R. Pethig, IEE 學(xué)報(bào)-納米生物技術(shù)(IEE Proc.-Nanobiotechnol.)，巻152,第4期，2005年 8月，報(bào)告了對(duì)齒形或多項(xiàng)式電極中不同類型的細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞溶解研究， 并且提出了混合物中存在的不同類型細(xì)胞的溶解和區(qū)別性電穿孔(選擇這 樣的頻率和幅度，以使得進(jìn)行一種類型的溶解或電穿孔，但保存另一種)。
然而，由于電極比細(xì)胞大得多，所以沒有提議使用該方法，且在獨(dú)立于其類型的條件下，可能不可以使用該方法選擇性破壞/電穿孔單細(xì)胞。事 實(shí)上，由于關(guān)于相對(duì)大的電極(和因此對(duì)它們起作用的場(chǎng)的強(qiáng)度)的位置 顯著變化，所以該方法不能以均勻方式作用于不同的細(xì)胞。
優(yōu)選地，利用處于跨越頻率(超過該頻率細(xì)胞從負(fù)的(nDEP)到達(dá)正 的(pDEP)介電泳)之間包括的頻率范圍中的，和低于這樣的頻率的場(chǎng)誘 導(dǎo)溶解，超過所述頻率，膜電位會(huì)由于超過膜松弛常數(shù)而削弱。
其它近期出版物文獻(xiàn)，諸如WO2005/075656和US2005/0070018A1涉 及基于微電極陣歹lj(array)或陣列(matrix)的使用而電穿孔單細(xì)胞的裝置，在 所述裝置上貼壁培養(yǎng)細(xì)胞(按照國(guó)際專利申請(qǐng))或裝備用于連接待電穿孔 的細(xì)胞和電極的導(dǎo)電微絲和用于移動(dòng)細(xì)胞的微流體通道。該裝置不提供以 確定的方式組織細(xì)胞的可能性，并且細(xì)胞相對(duì)于電極的位置引起偶然性。 因此，它們?cè)陔姶┛讜r(shí)受到的電場(chǎng)引起相當(dāng)?shù)母淖儯@樣施加的刺激有時(shí) 是統(tǒng)計(jì)學(xué)過量的(引起細(xì)胞死亡)，或不足量的，這引起細(xì)胞電穿孔的缺 乏。電穿孔過程中的成功百分比則導(dǎo)致次最優(yōu)的和較低的效率。
發(fā)明概述
本發(fā)明的目的是提供用于對(duì)包含粒子典型地是細(xì)胞的流體樣品進(jìn)行操 作的方法，用于進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的方法，所述方法沒有關(guān)于現(xiàn) 有技術(shù)所述的局限性和/或缺陷。
具體地，本發(fā)明的目的是在樣品中存在的每個(gè)粒子的位置控制上起作
用，目的是以確定的方式移動(dòng)所述粒子，從而以選擇性方式對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn) 行操作和/或以更有效的方式進(jìn)行操作，諸如電穿孔。
在此和以下，復(fù)數(shù)的"粒子"或單數(shù)的"粒子"術(shù)語意指天然的或人 造的微米或納米實(shí)體，如細(xì)胞、亞細(xì)胞組分、病毒、脂質(zhì)體、泡囊(niosomes)、 微球體。有時(shí)，將使用術(shù)語細(xì)胞，但除非另有說明，其應(yīng)該意指以上述最 廣義的方式用于檢測(cè)和表征粒子的非限制性示例。
因此本發(fā)明涉及權(quán)利要求1指定的方法。
具體地，利用非均勻、時(shí)變力場(chǎng)和集成光學(xué)傳感器。力場(chǎng)可以是正的 或負(fù)的介電泳、電泳或電流體動(dòng)力學(xué)運(yùn)動(dòng)，其特征在于關(guān)于粒子(固體、 液體或氣體的)的一組穩(wěn)定平衡點(diǎn)。這樣，現(xiàn)有技術(shù)的局限性可通過本發(fā)明予以克服。
按照本發(fā)明的方法的實(shí)現(xiàn)容許以有效和選擇性方式，例如通過引入外 源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。此外，還容許也從以低百分比存在的污染物精確地 純化細(xì)胞樣品，所述細(xì)胞可能是轉(zhuǎn)化的。最后，容許從多相樣品中快速分 離一些目的細(xì)胞。通過采用單一技術(shù)的全部基于相同的微電極陣列，所述 微電極用于在結(jié)合電極陣列的微室內(nèi)移動(dòng)細(xì)胞并引起其電穿孔。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將由本發(fā)明的一些非限制性實(shí)施方案的以 下描述表現(xiàn)為明顯的，這是參考附圖的圖進(jìn)行的。
附圖簡(jiǎn)述


圖1圖解顯示了按照本發(fā)明的方法的步驟，本發(fā)明是在截面圖和正視
圖中所示的操縱裝置中進(jìn)行的；
圖2利用以關(guān)于圖1中裝置的俯視平面圖獲得的照片序列顯示了圖1
的方法的實(shí)際實(shí)施；
圖3利用照片序列顯示了電穿孔之前和之后的一些細(xì)胞；
圖4、 5a、 5b概略地顯示了按照本發(fā)明的方法的可能實(shí)施方案。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的目的是進(jìn)行用于操縱和/或轉(zhuǎn)化和/或研究最佳電穿孔條件和/ 或檢測(cè)粒子的方法。
本發(fā)明的方法基于不均勻力場(chǎng)(F)的使用，通過該力場(chǎng)吸引單個(gè)粒 子或粒子組(BEADS)趨向穩(wěn)定平衡位置(CAGE)。該場(chǎng)可以是例如負(fù) 的(NDEP)或正的(PDEP)介電泳場(chǎng)(DEP)、電泳場(chǎng)(EF)或電流體 動(dòng)力學(xué)(EHD)運(yùn)動(dòng)場(chǎng)。
對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的處理基于能夠?qū)е录?xì)胞膜暫時(shí)滲透的局部化電場(chǎng)的施加。
該方法，例如在需要檢查接近特定電極的粒子類型的全部那些步驟 中，還可以使用集成傳感器，優(yōu)選地，光學(xué)和/或阻抗計(jì)類型的。備選地， 通過與顯微鏡相連的非集成光學(xué)傳感器可以獲得類似的信息，所述顯微鏡 容許檢查微室的內(nèi)容物。力的產(chǎn)生
根據(jù)已知的技術(shù)，通過提供在襯底上的電極(EL)陣列，存在不同的 方法用于產(chǎn)生移動(dòng)粒子的力。典型地，按照相同申請(qǐng)人以前的專利權(quán)(圖
1)，使用覆蓋物(LID)，它又可以是電極，它限定微室，在所述微室中粒 子(BEADS)典型地存在于液體懸浮液中。在介電泳(DED)的情況下，施 加的電壓以加號(hào)(+)標(biāo)示的是同相周期電壓(Vphip)，和以減號(hào)(-)標(biāo) 示的是反相周期電壓(Vphin)。術(shù)語"反相電壓"意指相位差180度的電 壓。這個(gè)場(chǎng)產(chǎn)生作用于空間區(qū)域(CAGE)中的粒子的力，吸引它們趨向 平衡點(diǎn)(PEQ)。在負(fù)的DEP (NDEP)的情況下，根據(jù)已有技術(shù)如果覆蓋物 (LID)是導(dǎo)電的電極，則可以產(chǎn)生封閉的力柵格；在這種情況下，將平 衡點(diǎn)(PEQ)建立為對(duì)應(yīng)于每一個(gè)與Vphin (-)相連的電極，其條件是如果 相鄰電極與反相的Vphip ( + )相連并且如果覆蓋物(LID)與相Vphin (-) 相連。這個(gè)平衡點(diǎn)(PEQ)通常在液體中與電極隔離，因此，粒子(BEADS) 以靜態(tài)懸浮。在正的DEP (PDEP)的情況下，平衡點(diǎn)(PEQ)通常處于與在 其上提供電極的表面相對(duì)應(yīng)，并且粒子(BEADS)以靜態(tài)與其接觸。關(guān)于 PDEP，在覆蓋物(帽蓋)中不必需具有其它電極，因?yàn)镻DEP的平衡點(diǎn) 對(duì)應(yīng)于電場(chǎng)的最大值。關(guān)于電流體動(dòng)力學(xué)(EHD)運(yùn)動(dòng)，電極的配置產(chǎn)生 某些流動(dòng)，它們推動(dòng)粒子趨向流動(dòng)最小值的點(diǎn)。
以下，為了簡(jiǎn)便起見，在本發(fā)明的方法描述中，使用封閉的負(fù)的介電 泳柵格作為粒子移動(dòng)的執(zhí)行力僅被認(rèn)為是為了本發(fā)明的目的的本發(fā)明的 非限制性實(shí)施例(為此原因，需要使用起電極作用的蓋子)。對(duì)于本領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員來說，如何概括下述使用不同執(zhí)行力和不同類型粒子的方 法和裝置，是明顯的。
通過介電泳操縱協(xié)助的粒子電穿孔
借助于上述執(zhí)行力之一，例如通過對(duì)該電極自身通以第一振幅和頻率 的正弦電壓，將粒子定位在兩電極間間隙附近。該間隙優(yōu)選地小于10拜， 且典型地是1-2,的量級(jí)，因此，與集成電路的供給電壓(例如，2.5、 3.3或5 V)相當(dāng)?shù)牡碗妷捍碳ぷ銐虼_定能夠引起粒子不可逆破裂的跨膜電
ii位。
該刺激優(yōu)選地由第二振幅和第二頻率的正弦脈沖串組成。 圖1按照本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，在截面圖中顯示了力場(chǎng)和對(duì)電極施 加的電壓"模式"(或電極(+ )或(_)狀態(tài)配置的復(fù)合體)的時(shí)間發(fā)展。
圖1 (a)中，細(xì)胞(CELL)處于nDEP中，以第一平衡點(diǎn)(MPEQ)以懸浮 狀態(tài)出于液體中。在圖1 (b)中，施加到電極(EL)的電壓模式，以及 施加的電壓的頻率和任選地，振幅發(fā)生改變，因此細(xì)胞受到的力也改變?yōu)?pDEP(FZAP)。然而，由于電壓模式的改變，只有待電穿孔的細(xì)胞(CELLZ) 受到顯著的力，因此，吸引它趨向新的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(ZPEQ)。在該點(diǎn)附近， 電場(chǎng)最高，且頻率是這樣的，以致確定足以電穿孔細(xì)胞的跨膜電位。這樣， 以懸浮狀態(tài)存在的化合物(PL)能夠滲透在細(xì)胞內(nèi)。
按照現(xiàn)有技術(shù)，所述化合物可以是在其中浸漬粒子的流體溶液中的化 學(xué)化合物(染料、藥物、肽)，或可以是例如質(zhì)粒，等，或者理想類型和 數(shù)量的第二 PL粒子可以以懸浮狀態(tài)存在于該流體中。
圖2顯示單細(xì)胞的電穿孔。將細(xì)胞，圖2 (a)捕獲在nDEP (頻率=50 kHz，電極的峰-峰電壓3.3 V，蓋子的峰-峰電壓6.6V)中。圖2 (b)顯示 熒光圖像。然后在pEDP(兩個(gè)500kHz脈沖，電極的峰-峰電壓的振幅2V， 蓋子的峰-峰電壓的振幅4V)中突變所述場(chǎng)，并且選擇的細(xì)胞經(jīng)歷孔張開， 這引起鈣熒光素(為了進(jìn)行試驗(yàn)，預(yù)先裝載在細(xì)胞中)的釋放和熒光降低 (圖2 (c))。
利用具有熒光檢測(cè)的光學(xué)-類型集成傳感器(參見相同申請(qǐng)人先前的專 利)，例如通過綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，可以檢查有效的轉(zhuǎn)化。
用于優(yōu)化電穿孔刺激的方法
在電極陣列上，可以安置細(xì)胞，并且可以對(duì)它們中的每一個(gè)或它們的 組試用具有不同振幅和/或頻率參數(shù)的刺激，以便迅速地確定更有效的刺 激。
例如，如上所述，可以用集成光學(xué)傳感器，或者利用監(jiān)測(cè)細(xì)胞中可能 引入的通常不能穿透膜的染料(染料或顏色物質(zhì))(例如，錐蟲藍(lán))來檢 査電穿孔。圖3顯示按照上述方案電穿孔之前圖3 (a)和之后圖3 (b)錐蟲藍(lán) 中的細(xì)胞。在圖3 (b)中，可以注意到錐蟲藍(lán)滲透到細(xì)胞內(nèi)。利用集成光 學(xué)傳感器，可以檢測(cè)到染料的入口以及電穿孔的發(fā)生。
備選地，可以控制在孔開口處向外的染料擴(kuò)散引起的細(xì)胞內(nèi)存在的染 料的消散。例如，如上所述，細(xì)胞內(nèi)的熒光鈣熒光素可以向外釋放，并且 決定細(xì)胞熒光的降低。
該方法預(yù)見到對(duì)單細(xì)胞反復(fù)施加增長(zhǎng)強(qiáng)度的刺激，測(cè)量電穿孔的細(xì)胞
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用于調(diào)節(jié)對(duì)每個(gè)細(xì)胞電穿孔刺激的方法
可以將細(xì)胞定位在電極陣列上，并可以將增長(zhǎng)強(qiáng)度的刺激在其上嘗 試，并且可以用集成光學(xué)傳感器控制通常不能穿透膜的染料的可能入口。
基于上述內(nèi)容，明顯的是，本發(fā)明容許進(jìn)行對(duì)外部剌激的施加是靈敏 的第一粒子的選擇或處理，并通過施加所述外部刺激提供引起至少一個(gè)所
述第一選擇的粒子滲透的步驟；具體地，本發(fā)明提供下列步驟
a) 使第一粒子(CELL)接近可選擇的電極陣列的電極(EL)，所述 電極具有與所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，對(duì)其可以施加第一配置
(PMAN)的電壓，從而通過由對(duì)所述電極(EL)選擇性通電引起的第一 力場(chǎng)(FMAN)組織所述第一粒子(CELL);
b) 對(duì)所述電極施加第二配置(PZAP)的電壓，從而產(chǎn)生第二力場(chǎng) (FZAP)，所述第二力場(chǎng)基本接近至少一個(gè)第一選擇的待滲透粒子 (CELL)定位，并且由此引起對(duì)所述至少一個(gè)第一選擇的粒子施加刺激，
所述刺激適合于使所述至少一個(gè)第一選擇的粒子在滲透狀態(tài)中達(dá)所述刺 激長(zhǎng)度的至少一部分。
按照本發(fā)明的方法還包括步驟
c) 使處于滲透狀態(tài)的所述至少一個(gè)第一選擇的粒子與至少一個(gè)第二 粒子接觸，其中進(jìn)行步驟b)和c)，從而引起所述至少一個(gè)第二粒子滲透 到處于滲透狀態(tài)的所述至少一個(gè)第一選擇的粒子內(nèi)部，如圖1中示意性顯 示。
將第一粒子浸漬于流體中，并且通過將第二粒子浸漬在該流體中并且延長(zhǎng)步驟b) —段時(shí)間而進(jìn)行步驟C)，所述時(shí)間足以容許至少一個(gè)所述第 二粒子滲透到處于滲透狀態(tài)的所述至少一個(gè)第一選擇的粒子內(nèi)部。
備選地，將第二粒子浸漬在該流體中，并且然后優(yōu)選地，通過對(duì)至少
所述選擇的第二粒子施加力場(chǎng)(FMAN)，將至少一個(gè)選擇的所述第二粒 子對(duì)著保持在滲透狀態(tài)的所述至少一個(gè)第一選擇的粒子移動(dòng)，所述力場(chǎng)是 通過對(duì)可選擇的電極陣列的電極(EL)進(jìn)行選擇性通電而獲得的，對(duì)所述 電極施加一系列適當(dāng)選擇的電壓配置。
由所述場(chǎng)施加的刺激可以是這樣的，用于在去除了刺激本身后，還將 選擇的第一粒子在滲透狀態(tài)保持預(yù)定的時(shí)間；因此通過將第二粒子浸漬在 浸漬第一粒子的流體中并通過對(duì)著施加相同力場(chǎng)(FMAN)的第二粒子移 動(dòng)處于滲透狀態(tài)中的第一粒子而進(jìn)行步驟c)，所述力場(chǎng)(FMAN)是通過 對(duì)可選擇的電極陣列的電極(EL)進(jìn)行選擇性通電而獲得的，對(duì)所述電極 施加一系列預(yù)定的電壓配置。
參考圖4、 5a、 5b，可以將第一粒子浸漬于第一流體中，例如它們可 以已經(jīng)以懸浮狀態(tài)包含在所述第一流體中；并且可以通過將第二粒子浸漬 在接近第一流體的第二流體中(例如，在所述第二流體中可以已經(jīng)浸漬了 第二粒子)和通過對(duì)粒子施加合適的力場(chǎng)(FMAN)，將第一流體中存在 的處于滲透狀態(tài)(電穿孔的)粒子，從第一流體移動(dòng)到第二流體而進(jìn)行步 驟c)，所述力場(chǎng)通過對(duì)電極施加一系列預(yù)定的電壓配置而對(duì)相同的電極通 電。隨后，為了在第一粒子內(nèi)接收第二粒子而轉(zhuǎn)化的第一粒子，可以被引 回到第一流體中，再次對(duì)電極施加合適的配置或電壓配置的序列。
當(dāng)將第一粒子浸漬在流體中時(shí)，所述方法可以備選地包括下列步驟
c) 向浸漬第一粒子的流體中引入至少一種溶液化合物；和
d) 容許所述化合物滲透到處于滲透狀態(tài)(預(yù)先通過電極電穿孔的) 的第一粒子內(nèi)部。
當(dāng)將第一粒子浸漬在裝備電極陣列的微室設(shè)備中包含的第一流體中 時(shí)，按照本發(fā)明(圖4)的方法包括步驟
c) 通過以層流運(yùn)動(dòng)形式操作，將第二流體引入到微室內(nèi)部，從而使 第二流體不與第一流體混合(圖5a);
d) 向所述第二流體中引入至少一種溶解的化合物(在微室中第二流體的引入步驟之前還明顯可以進(jìn)行的操作，圖5a);
e) 通過對(duì)粒子施加力場(chǎng)(FMAN)，將處于滲透狀態(tài)的第一粒子從第 一流體移動(dòng)到第二流體，所述力場(chǎng)是通過對(duì)所述可選擇的電極陣列的所述 電極進(jìn)行選擇性通電而獲得的，這是通過對(duì)所述電極施加一系列預(yù)定的電
壓配置而實(shí)現(xiàn)的(圖5b);
f) 容許所述化合物滲透在處于滲透狀態(tài)的選擇的第一粒子內(nèi)，進(jìn)行所 述選擇的第一粒子的電穿孔，所述電穿孔是當(dāng)所述第一粒子浸漬在第二液 體/流體時(shí)可以發(fā)生的操作，或者如果給予的刺激適合于在去除刺激后也維 持受其施加的第一粒子處于滲透狀態(tài)達(dá)預(yù)定的時(shí)間，而第一粒子仍然處于 第一流體中，則從而在它們?nèi)匀惶幱跐B透狀態(tài)下，將它們移動(dòng)到第二流體 中。
一般而言，可以將第一粒子浸漬在裝備了所述電極陣列的微室中的多 種不同流體中，并且通過以層流運(yùn)動(dòng)操作將第一粒子引入所述微室中，這 樣所述不同流體不混合在一起。
優(yōu)選地，如上所述，第一粒子是具有可滲透和可溶解膜的生物實(shí)體， 例如，細(xì)胞，且所述刺激由使選擇的粒子的跨膜電位達(dá)到引起膜滲透的數(shù) 值組成。按照本發(fā)明通常選擇浸漬待電穿孔粒子的流體具有相對(duì)低的電導(dǎo)
率，這樣可以傳到pEDP，從而在場(chǎng)的最大值中吸引細(xì)胞，足以引起產(chǎn)生 孔的跨膜電位。
最后，按照本發(fā)明方法的可能變化，提供了對(duì)多種所述選擇的第一粒 子施加增長(zhǎng)強(qiáng)度的刺激，并且針對(duì)每種施加的刺激，通過在單芯片上與所 述電極陣列集成的傳感器，測(cè)量存在于滲透狀態(tài)中的粒子的數(shù)量。例如， 將第一粒子浸漬在流體中，且該流體含有這樣的化合物，所述化合物至少 在滲透到那些所述處于滲透狀態(tài)的第一粒子內(nèi)部時(shí)，適合于通過傳感器檢 測(cè)。
用于調(diào)節(jié)關(guān)于每個(gè)細(xì)胞的推定電穿孔刺激的方法
如果根據(jù)細(xì)胞特征能夠獲得關(guān)于刺激最佳值的信息(例如，遵循按照 上述方法的特征)，則可以"推定地"采用下列方法。
在電極陣列上，可以通過傳感器(優(yōu)選地，集成在芯片內(nèi)的光學(xué)和/或阻抗計(jì)傳感器)預(yù)先檢測(cè)每個(gè)待電穿孔的細(xì)胞的特征，諸如例如尺寸， 并對(duì)局部施加的刺激進(jìn)行編程，從而逐個(gè)位置地，或逐個(gè)電極地，局部最 優(yōu)化關(guān)于每個(gè)具體細(xì)胞的電穿孔成功百分比。
權(quán)利要求
1. 用于選擇或處理對(duì)施加外部刺激敏感的第一粒子的方法，所述方法包括通過施加所述外部刺激獲得至少一個(gè)選擇的第一粒子滲透的步驟，其特征在于所述方法包括下列步驟a)使所述第一粒子(CELL)接近可選擇的電極陣列的電極(EL)，所述電極具有與所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以對(duì)所述電極施加第一配置(PMAN)的電壓，用于通過將所述電極(EL)選擇性通電產(chǎn)生的第一力場(chǎng)(FMAN)組織所述粒子(CELL)；b)對(duì)所述電極施加第二配置(PZAP)的電壓，從而提供第二力場(chǎng)(FZAP)，所述第二力場(chǎng)基本定位于接近至少一個(gè)選擇的待滲透的第一粒子(CELL)處，并且由此對(duì)所述至少一個(gè)選擇的第一粒子產(chǎn)生刺激的施加，所述刺激適合于使所述至少一個(gè)第一選擇的粒子處于滲透狀態(tài)達(dá)所述刺激長(zhǎng)度的至少一部分。
2. 按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述方法還包括下列步驟c) 使所述至少一個(gè)選擇的處于滲透狀態(tài)的第一粒子與至少一個(gè)第二粒 子接觸；進(jìn)行所述步驟b)和c)，從而引起所述至少一個(gè)第二粒子在所述至少 一個(gè)選擇的處于滲透狀態(tài)中的第一粒子內(nèi)部滲透。
3. 按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于將所述第一粒子浸漬在流體中； 對(duì)也浸漬在所述流體中的所述第二粒子進(jìn)行所述步驟c)并且將所述步驟 b)延長(zhǎng)一段時(shí)間，所述時(shí)間足以容許至少一個(gè)所述第二粒子在所述至少 一個(gè)選擇的第一粒子內(nèi)部滲透，所述第一粒子處于滲透狀態(tài)。
4. 按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于將所述第一粒子浸漬在流體中； 對(duì)也浸漬在所述流體中的所述第二粒子進(jìn)行所述步驟c)，并通過對(duì)至少所 述選擇的第二粒子施加力場(chǎng)(FMAN)，對(duì)著保持在滲透狀態(tài)中的所述至 少一個(gè)選擇的第一粒子移動(dòng)至少一個(gè)所述選擇的第二粒子，所述力場(chǎng)是通 過對(duì)所述可選擇的電極陣列的所述電極(EL)的選擇性通電獲得的，對(duì)所 述電極施加一系列預(yù)定的電壓配置。
5. 按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述刺激適合于在去除所述刺 激后，還將所述至少一個(gè)選擇的第一粒子在滲透狀態(tài)中保持預(yù)定的時(shí)間； 所述第一粒子浸漬在第一流體中；對(duì)也浸漬在所述第一流體中的所述第二 粒子進(jìn)行所述步驟c)，并對(duì)著所述第二粒子移動(dòng)至少一個(gè)選擇的處于滲透 狀態(tài)的第一粒子，對(duì)所述粒子施加力場(chǎng)(FMAN)，所述力場(chǎng)是通過對(duì)所 述可選擇的電極陣列的所述電極(EL)的選擇性通電獲得的，對(duì)所述電極 施加一系列預(yù)定的電壓配置。'
6. 按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述第一粒子浸漬在第一流體 中；且通過將所述第二粒子浸漬在接近所述第一流體的第二流體中而進(jìn)行 步驟c)，并且通過對(duì)所述粒子施加力場(chǎng)(FMAN)，將所述至少一個(gè)選擇 的第一粒子，從所述第一流體移動(dòng)到所述第二流體，所述力場(chǎng)是通過對(duì)所 述可選擇的電極陣列的所述電極(EL)的選擇性通電獲得的，對(duì)所述電極 施加一系列預(yù)定的電壓配置。
7. 按照權(quán)利要求6的方法，其特征在于當(dāng)所述至少一個(gè)選擇的第一粒 子浸漬在所述第二流體中時(shí)，在所述至少一個(gè)選擇的第一粒子上進(jìn)行步驟 b)和c);或備選地，當(dāng)所述至少一個(gè)選擇的第一粒子浸漬在所述第一流 體中時(shí)，進(jìn)行步驟b)和c)，只要所述刺激適合于在也去除所述刺激后將 所述至少一個(gè)選擇的第一粒子在滲透狀態(tài)中保持預(yù)定的時(shí)間，足以容許將 所述粒子從第一流體移動(dòng)到所述第二流體。
8. 按照權(quán)利要求l的方法，其特征在于所述第一粒子浸漬在流體中； 所述方法還包括下列步驟c) 浸漬第一粒子的流體中具有至少一種溶液化合物；和d) 容許所述化合物滲透在處于滲透狀態(tài)中的所述至少一個(gè)選擇的第 一粒子內(nèi)部。
9. 按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述第一粒子浸漬在裝備有所 述電極陣列的微室中包含的第一流體中；所述方法還包括下列步驟c) 通過處于層流運(yùn)動(dòng)形式的操作，在所述微室中引入第二流體，從 而使所述第二流體不與所述第一流體混合，所述第二流體含有至少一種溶 解的化合物；d) 通過對(duì)所述至少一個(gè)第一粒子施加力場(chǎng)(FMAN)，將所述粒子從所述第一流體移動(dòng)到所述第二流體，所述力場(chǎng)是通過對(duì)所述可選擇的電極陣列的所述電極(EL)的選擇性通電而獲得的，對(duì)所述電極施加一系列預(yù) 定的電壓配置；e)容許所述化合物滲透在所述至少一個(gè)處于滲透狀態(tài)中的第一粒子 內(nèi)部；當(dāng)所述至少一個(gè)第一粒子在所述第二流體中時(shí)，進(jìn)行所述步驟a) 和b)，或備選地，只要所述刺激適合于在去除所述刺激后還將所述至少一 個(gè)選擇的第一粒子在在滲透狀態(tài)中保持預(yù)定的時(shí)間，足以容許從所述第一 流體到所述第二流體的移動(dòng)，當(dāng)所述至少一個(gè)第一粒子在所述第一流體內(nèi) 時(shí)，進(jìn)行所述步驟a)和b)。
10. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述第一粒子浸 漬在裝備有所述電極陣列的微室中包含的多種不同的流體中，并且通過層 流運(yùn)動(dòng)形式的操作將其引入到所述微室中，以致所述不同的流體不混合在 一起。
11. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述第一粒子是 具有可滲透和可溶解膜的生物實(shí)體，例如，細(xì)胞，其中所述刺激由使所述 至少一個(gè)選擇的粒子的跨膜電位在引起膜滲透的這樣一種數(shù)值組成。
12. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述方法包括檢 查所述至少一個(gè)選擇的粒子是否發(fā)生滲透的步驟，優(yōu)選地，通過在單芯片 中與所述電極陣列集成的傳感器進(jìn)行。
13. 按照權(quán)利要求2或8的方法，其特征在于所述方法包括檢査所述 至少一個(gè)所述第二粒子或所述至少一個(gè)選擇的第一粒子中的所述化合物 是否發(fā)生滲透的步驟，優(yōu)選地，通過在單芯片中與所述電極陣列集成的傳 感器進(jìn)行。
14. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述粒子懸浮在流體中， 其特征在于以這樣一種方式選擇所述流體，即提供相對(duì)低的電導(dǎo)率。
15. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述方法提供將 具有增長(zhǎng)強(qiáng)度的刺激施加到多種所述選擇的第一粒子，并且對(duì)于每種施加 的刺激，通過在單芯片中與所述電極陣列集成的傳感器，測(cè)量滲透狀態(tài)中 存在的粒子的數(shù)量。
16. 按照權(quán)利要求15的方法，其特征在于所述第一粒子浸漬在流體中，且所述流體含有這樣的化合物，所述化合物至少在處于滲透狀態(tài)的那 些所述第一粒子內(nèi)部滲透時(shí)，適合于從所述傳感器檢測(cè)。
17.按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其特征在于提供下列步驟 -根據(jù)所述第一粒子的已知特征，收集關(guān)于通過所述電極施加的刺激的最佳數(shù)值的信息；-通過優(yōu)選地集成在芯片上的傳感器，預(yù)先檢測(cè)所述已知的特征，用于確定選擇的第一粒子；和-編程待局部施加的刺激，以便優(yōu)化每個(gè)特異性選擇的第一粒子滲透的 成功百分比。
全文摘要
用于選擇或處理對(duì)施加外部刺激敏感的第一粒子的方法，所述方法包括通過施加外部刺激引起至少一個(gè)選擇的第一粒子滲透的步驟，其存在于通過第一力場(chǎng)(FMAN)組織第一粒子(CELL)，從而產(chǎn)生第二力場(chǎng)(FZAP)，所述第二力場(chǎng)基本位于接近至少一個(gè)選擇的待滲透第一粒子。
文檔編號(hào)B03C5/00GK101479044SQ200780021606
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2007年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者尼科洛·馬納雷西, 梅拉尼·阿博南, 詹內(nèi)伊·梅多羅 申請(qǐng)人:硅生物系統(tǒng)股份公司