專利名稱：用于選擇和/或處理粒子，具體地用于選擇性地和/或最優(yōu)化地溶解細胞的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于選擇和/或處理粒子，特別是由細胞組成或包括細胞和/或細胞物質(zhì)的粒子的方法和裝置，例如用于選擇性地和/或最優(yōu)化地溶解細胞的方法和裝置，并且主要應(yīng)用于執(zhí)行具有單細胞拆分的方案。術(shù)語細胞的"處理"在此和以下意指能夠?qū)瘟Ｗ踊蚣毎?，或?qū)λ鼈兊慕M進行的任何類型的操作。
現(xiàn)有技術(shù)
授予G. Medoro的專利PCT/WO 00/69565描述了通過利用介電泳電位(dielectrophoretic potential)和可能的集成傳感器的封閉柵格(cages)對粒子進行操縱和鑒別/識別的裝置和方法。所述方法教導(dǎo)如何在兩維空間中控制獨立于全部其它粒子的每一粒子。用來捕獲懸浮在流體介質(zhì)中的粒子的力是負的介電泳。通過與集成在相同襯底中的電極陣列和傳感器的每一元件有關(guān)的存儲器元件和電路的編程，實現(xiàn)對操縱操作的單獨控制。該裝置容許分離細胞，但需要使它們向著第二微室移動，與第一個細胞流體地分離。而且，沒有預(yù)期用于轉(zhuǎn)化細胞的方法。
授予Becker等的美國專利6,294,063描述了一種方法和裝置，其通過可編程的力的分配來操縱固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)生物學(xué)材料的包裝。該專利也提及傳感器的使用。在該情形中，細胞的分離也可以僅通過使細胞物理地移動經(jīng)過整個裝置而發(fā)生。
操縱粒子的又一種力是由電流體動力學(xué)流(EHD)產(chǎn)生的粘滯摩擦力，例如電熱流(ETF)或AC電滲透。在NG. Green, A. Ramos和H.Morgan,物理學(xué)雜志D:應(yīng)用物理學(xué)(J.Phys.D: Appl.Phys.) 33(2000)中，EHD用來移動粒子。例如PCTWO 2004/071668 Al描述一種利用上述電流體動力學(xué)流將粒子濃縮在電極上的裝置。
在Medoro等的意大利專利申請BO2005A000481中，列出了一些用電
極陣列操縱粒子的方法，以及鑒別它們的方法和裝置。
替代地，國際專利申請PCT/IT02/00524描述了一種方法，其中，通過使第一生物實體與第二生物實體(例如，含有DNA的脂質(zhì)體、或微珠)相接觸，而轉(zhuǎn)化第一生物實體，其中，將第一生物實體固定在第一電極陣列所限定的表面上，所述電極可以至少部分被選擇性激活和控制，朝向至少一個第二電極放置，并且與借助于介電泳柵格移動的第二生物實體接觸。
相同申請人名下的專利申請PCT IB 2006000636涉及利用非均勻時變力場和集成光學(xué)或阻抗計傳感器(impedenziometric sensor)對粒子進行表征和/或計數(shù)的方法和裝置。力場可以具有正的或負的介電泳、電泳或電流體動力學(xué)運動，其特征在于粒子(固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài))的一組穩(wěn)定平衡點；利用已知的效應(yīng)，諸如電介質(zhì)上的電潤濕，同樣的方法可適用于操縱小滴(液態(tài)粒子)，其目的是對存在于樣本中的每一粒子的位置起控制作用，以便以確定性和統(tǒng)計學(xué)方法使這些粒子移動，用集成光學(xué)或阻抗計傳感器檢測它們的存在，和/或表征它們的類型，從而以有效的方法對它們進行計數(shù)和操縱。
在相同申請人名下的2006年3月27日的意大利申請?zhí)朤O2006A000226中，描述了用于處理(例如洗滌、培養(yǎng)、等)粒子的方法和裝置，其中，在層流條件下，將懸浮在第一流體中的粒子引入到至少一個第一微室或該微室的第一區(qū)域中，其中通過不與第一流體相混合的方式，在層流條件下，將第二流體引入到微室或第二微室的至少一個第二區(qū)域中，并且其中在該微室中激活作用于粒子上的至少一個力場(F)，從而引起粒子僅在預(yù)定的方向上移動，并轉(zhuǎn)移第二流體中的懸浮中的該粒子；優(yōu)選使用的裝置包括以一個方向彼此順次排列的至少三個微室，并且每個微室均與它前面和后面緊挨著的微室連接，具有處于與微室序列方向垂直的方向上的彼此偏移的兩個開口。
近期，在文章"單細胞電穿孔芯片(A single cell electroporation chip),芯片上的實驗室(Lab on a Chip), 2005， 5 (1), 38 - 43, Michelle Khine,Adrian Lau， Cristian Ionescu-Zanetti, Jeonggi Seo禾口 Luke P. Lee"中，描述 了如何通過在單細胞上進行的電穿孔增加細胞膜的滲透性；通過這種方 法，可以將以別的方式不能滲透過原生質(zhì)膜的極性物質(zhì)(諸如染料、藥物、 DNA、蛋白質(zhì)、肽和氨基酸)引入到細胞中。
文章"用于高效的單細胞遺傳操縱的流經(jīng)微-電穿孔芯片(Flow-through micro-electroporation chip for high efficiency single-cell genetic manipulation),傳感器和執(zhí)行器A:物理的(Sensors and Actuators A: Physical),巻104，刊3， 2003年5月15日，Yong Huang， Boris Rubinsky" 具體描述了各個細胞的遺傳操縱，這在諸如生物學(xué)和生物工藝學(xué)中非常令 人感興趣，所述細胞是通過利用微-流體通道精確操縱單細胞的電穿孔芯片 獲得的；如己知地，電穿孔是使用強電場誘導(dǎo)細胞膜中結(jié)構(gòu)重排的工藝； 由于當(dāng)跨膜電位超過膜的介電穿孔電壓(0,2-1.5V)時，穿膜形成孔，這容許 外部物質(zhì)滲入膜并到達其包含的細胞質(zhì)。
單細胞的電穿孔是有趣的技術(shù)，還因為它容許逐個細胞地研究發(fā)生在 細胞群中的變化，并還研究細胞內(nèi)化學(xué)，例如，通過激活或阻斷特異的和 個別的蛋白質(zhì)的表達而為各個細胞提供特異性表型。因此，利用基于使用 裝備在芯片上的陣列的工藝，可以產(chǎn)生用于HTS檢驗(高通量篩選)的 裝置，其與DNA和蛋白質(zhì)的表達以及指向特異性細胞靶標(biāo)(例如受體) 的化學(xué)化合物(例如藥物)均相關(guān)。
單細胞電穿孔與通常使用的大量電穿孔方案相比，也是有利的技術(shù)， 所述大量電穿孔方案需要非常高的電壓(>103 V)，并不容許有效地控制各 個細胞滲透性，因此，例如，很難重新關(guān)閉預(yù)先張開的孔。
迄今為了獲得單細胞電穿孔而作出的努力在將碳纖維微電極 (Lundqvist等，1998)用于其它技術(shù)諸如充滿電解質(zhì)的毛細管、微吸移管、 和顯微加工芯片中的范圍內(nèi)。
顯微加工裝置對分離單細胞和集中電場均是理想的。
最后，文章"利用介電泳力控制細胞破裂"("Controlling cell destruction using dielectrophoretic forces" ) ， A. Menachery禾口 R. Pethig, IEE 學(xué)報-納米生物技術(shù)(正EProc,Nanobiotechnol.),巻152,第4期，2005年 8月，報告了對齒形或多項式電極中不同類型的細胞進行的細胞溶解研究，并且提出了混合物中存在的不同類型細胞區(qū)別性溶解(選擇頻率和幅度， 諸如溶解一種類型而保存另 一種)。
然而，由于電極比細胞大得多，所以沒有提議使用該方法，并且在不 考慮其類型的條件下，可能不可以使用該方法選擇性破壞單細胞。事實上， 由于關(guān)于相對大的電極(和因此對它們起作用的場的強度)的位置顯著變 化，所以該方法不能均勻地作用于不同的細胞上。
優(yōu)選地，利用處于跨越頻率(超過該頻率細胞從負的介電泳(nDEP)到 達正的(pDEP))間的頻率間隔中，和低于這樣的頻率的場誘導(dǎo)溶解，超過 所述頻率，膜電位會由于超過膜松弛常數(shù)而削弱。
發(fā)明概述
本發(fā)明的目的是提供用于對包含粒子典型地是細胞的流體樣品進行操 作的方法，用于進行單細胞的純化和/或分離和/或一個或多個細胞的轉(zhuǎn)化 的方法，所述方法沒有關(guān)于現(xiàn)有技術(shù)所述的局限性和/或麻煩。
具體地，本發(fā)明的目的是在樣品中存在的每個粒子的位置控制上起作 用，從而以確定的方式移動所述粒子，從而選擇性地對每個細胞進行操作 和/或以更有效的方式，諸如溶解、融合、等進行操作。
在此和以下，復(fù)數(shù)的"粒子"或單數(shù)的"粒子"術(shù)語意指微米或納米 實體，天然的或人造的，如細胞、亞細胞組分、病毒、脂質(zhì)體、泡囊 (niosomes)。有時，將使用術(shù)語細胞，但除非另有說明，必須理解為是以 上述更充分描述的方式使用"粒子"的非限制性示例。
因此本發(fā)明涉及權(quán)利要求l、 11、 12、 13、 15中指定的方法。
本發(fā)明還涉及權(quán)利要求17中指定的裝置。
具體地，利用非均勻、時變力場和集成光學(xué)傳感器。力場可以具有正 的或負的介電泳、電泳或電流體動力學(xué)運動，其特征在于關(guān)于粒子的一組 穩(wěn)定平衡點。
這樣，現(xiàn)有技術(shù)的局限性可通過本發(fā)明予以克服。
按照本發(fā)明的方法的實現(xiàn)容許甚至從以低百分比存在的污染物精確 地純化細胞樣品。它還容許通過引入遺傳物質(zhì)而有效地和選擇性地轉(zhuǎn)化細 胞。最后，它容許從多相樣品中快速分離一些目的細胞。
9，從下列對本發(fā)明的非限制性實施方案的一些的 描述中，本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將是清楚的。
附圖簡述


圖1示意性地說明了按照本發(fā)明的第一個方法的步驟，所述本發(fā)明是 以正視圖形式的截面中所示的操縱裝置中進行的；
圖2顯示了利用與圖1中相同的裝置進行圖1中方法的步驟，但是以
俯視的布局圖所圖解；
圖3以與圖2相同的視圖顯示了圖l和2中方法的可能變化；
圖4用相片序列顯示了圖1中方法的啟動；
圖5以與圖2相同的視圖顯示了圖1中方法的另一種變化；
圖6以與圖2相同的視圖顯示了按照本發(fā)明的另一種操縱粒子的方
法；禾口
圖7-9顯示了特別有利地啟動本發(fā)明方法的裝置的不同實施方案。 發(fā)明詳述
本發(fā)明的目的是實現(xiàn)用于操縱和/或分離和/或分析粒子的方法和裝置。
本發(fā)明的方法是基于(圖1)非均勻力場(F)的使用，在其作用下將 單個粒子或粒子組(CELL)吸引到穩(wěn)定平衡位置(CAGE)。該場可以是 例如負的(NDEP)或正的(PDEP)介電泳場(DEP)，或電流體動力學(xué) 運動場(EHD)。
對細胞進行的處理基于能夠引起細胞膜永久破裂或兩個粒子融合的 局部化電場的施加。
該方法還可以使用集成傳感器，優(yōu)選地，使用光學(xué)和/或阻抗計類型， 例如在需要檢査接近特定電極的粒子類型的全部那些步驟中。備選地，借 助于與顯微鏡相連的非集成光學(xué)傳感器可以獲得類似的信息，這容許檢查 實現(xiàn)本發(fā)明方法的微室的內(nèi)容物。
力的產(chǎn)生
10根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，存在通過形成在襯底上的電極(EL)陣列用于產(chǎn)生移 動粒子的力的不同方法。典型地，按照相同申請人以前的專利(圖1)，使
用覆蓋物(LID)，它可以又是電極，它限定這樣的微室，其中粒子(CELL) 典型地懸浮在由液體組成的流體中。在介電泳(DED)的情況下，施加的 電壓以加號(+)標(biāo)示的是周期同相電壓(Vphip)，以減號(-)標(biāo)示的是 反相電壓(Vphin)。術(shù)語"反相電壓"意指電壓偏離180° 。這個場產(chǎn)生 作用于空間區(qū)域(CAGE)的粒子的力，從而將它們吸引到平衡點(PEQ)。 在負的DEP (NDEP)的情況下，根據(jù)已有技術(shù)，如果覆蓋物(LID)是 導(dǎo)電的電極，可以產(chǎn)生封閉的力柵格；在這種情況下，穩(wěn)定平衡點(MPEQ) 對應(yīng)于每一個與Vphin (-)相連的電極，其條件是如果相鄰電極與反相的 Vphip ( + )相連并且如果覆蓋物(LID)與同相的Vphin (-)相連。這個 平衡點(MPEQ)通常在液體中相對于電極在一定距離，因此，粒子(CELL) 以靜態(tài)懸浮。 '
在正的DEP (PDEP)的情況下，平衡點(ZPEQ)通常位于實現(xiàn)電極的 表面上，并且粒子(CELL)以靜態(tài)與其接觸。關(guān)于PDEP，在覆蓋物中不必 須具有其它電極，因為PDEP的平衡點對應(yīng)于電場的極大值。關(guān)于電流體 動力學(xué)運動(EHD)，電極的配置產(chǎn)生流動，其推動粒子趨向最小的流動 點。
為了簡便起見，純粹認(rèn)為以下是實施例，并且因此沒有限制本發(fā)明的 目的，使用具有負的介電泳的封閉柵格作為本發(fā)明的方法和裝置描述中粒 子運動步驟的激活力(為此需要使用起電極作用的覆蓋物)。對于本領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員來說，明顯的是，可以概括下述用于不同激活力和不同類 型粒子的方法和裝置。
用于選擇性溶解粒子的方法
通過上述啟動力的一種將待溶解的粒子在接近兩電極間的間隙定位， 對該電極用第一振幅(MA)和頻率(MF)的正弦電壓通電。該間隙優(yōu)選 地小于10pm，且典型地，大約l-3pm，因此，與集成電路提供的電壓(例 如，2.5、 3.3或5 V)相當(dāng)?shù)牡碗妷捍碳ぷ銐虼_定足以引起粒子不可逆破 裂的跨膜電位。
ii該刺激優(yōu)選地由第二振幅(ZA)和第二頻率(ZF)的一連串正弦脈 沖組成。
將電脈沖施加到兩個選擇的電極之間，從而引起細胞的溶解。 圖1按照本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，在截面圖中顯示了力場和對電極應(yīng) 用的電壓"模式"(即電極(+ )或(_)狀態(tài)配置的復(fù)合體)隨時間推移
的發(fā)展。圖1 (a)中，細胞(CELL)處于nDEP,懸浮在處于第一平衡點 (MPEQ)的液體中。在圖1 (b)中，施加到電極(EL)的電壓模式改變， 因此施加的電壓的頻率和任選地，振幅，以及細胞受到的力改變?yōu)閜DEP (FZAP)。然而，由于電壓模式的改變，只有待溶解的細胞(CELLZ〉受到 顯著的力，因此，吸引該細胞趨向新的穩(wěn)定平衡點(ZPEQ)。在該點附近， 電場最大，且所述頻率引起溶解細胞的充分的跨膜電位。
圖2顯示了與圖l相同步驟(a)-(d)的電極配置布局圖，其中，通過顏 色表示具有施加到蓋子的電壓的同相和反相電極模式(同相灰色，反相白 色)。
該模式的序列是特別有利的，因為，在溶解過程中，附近區(qū)域中的其 它細胞由于覆蓋物和電極均處于同相而受到幾乎零電場的作用。如果施加 到覆蓋物的電壓振幅等于施加到電極的電壓振幅，則那些細胞上的場為 零。
備選地，可以采用圖3(a)-3(d)中顯示的模式系列。在這種情況中，如 由白色和灰色代表的同相和反相電極數(shù)量所顯示地，其優(yōu)勢在于每次需要 重新編程較少量的電極，如果為待啟動的電極模式書寫記憶細胞的過程很 緩慢，則這可以是有利的。否則，采用之前圖2中的方案通常是優(yōu)選的。
用限定微室底表面的電極陣列中集成的傳感器，例如光學(xué)類型的，利 用上述相同申請人的國際專利申請PCTIB 2006000636中所述的方法，將 容易地檢查何時發(fā)生溶解，從而觀察與溶解的細胞相對應(yīng)的柵格仍然是滿 的還是空的，或者更好地檢查由溶解產(chǎn)生的碎片的存在。
基本地，用所述方法，可以選擇或處理對施加外部刺激靈敏的粒子， 這是利用通常包括通過施加所述外部刺激產(chǎn)生至少一種選擇的粒子的破 裂或溶解步驟的方法實現(xiàn)的；且其中還預(yù)期了下列步驟
a)使粒子(CELL)接近可選擇的電極陣列的電極(EL)，所述電極具有與所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以對其施加第一模式 (PMAN)的電壓，從而任選地，如果需要，通過選擇性地為所述電極通
電，依靠第一力場(FMAN)，組織所述粒子(CELL);
b)對所述電極施加第二模式(PZAP)的電壓，從而創(chuàng)建第二力場 (FZAP)，所述第二力場位于基本接近至少一個選擇的待溶解粒子 (CELL)并且以致產(chǎn)生對所述至少一個選擇的粒子施加適合于引起其破
裂或溶解的刺激。
如果希望使用從nDEP到pDEP的轉(zhuǎn)變，則將粒子懸浮在選擇的流體 中，從而顯現(xiàn)相對低的電導(dǎo)率。
用于產(chǎn)生第一力場(FMAN)的第一模式(PMAN)的電壓呈現(xiàn)第一振幅 (MA)和第一頻率(MF);且用于產(chǎn)生第二力場(FZAP)的第二電壓模式 (PZAP)呈現(xiàn)第二振幅(ZA)和第二頻率(ZF)，至少其中之一與所述第一振幅 (MA)和第一頻率(MF)不同。在這種情況中，為了獲得細胞溶解所施 加的刺激由力組成，所述力可以通過第二力場(FZAP)施加到至少一個 選擇的粒子，并且第一和第二電壓模式均以AC (交流電)形式產(chǎn)生。具 體地，所述至少一個選擇的粒子是具有可溶解的膜的生物實體，在所述實 例中描述為細胞，并且施加的刺激包括使所述至少一個選擇的粒子的跨膜 電位達到引起膜破裂的數(shù)值。
按照本發(fā)明的方法的可能的變化，可在圖2(b)中對其進行考慮說明， 為了溶解所述選擇的粒子而對其應(yīng)用的刺激反之亦然地由位于流體中的
加熱組成，所述流體中懸浮了待溶解的所述選擇的粒子。
按照該可能的變化，特別有利地是，如果將所述粒子懸浮在呈現(xiàn)高電 導(dǎo)率的流體(液體)(例如，生理溶液)中，則第二模式(PZAP)的電壓 使得通過電極陣列中那些選擇的電極的焦耳(Joule)作用，產(chǎn)生選擇性加 熱，在圖2 (b)中，電極顯示為白色，其上，對所示裝置提供的完整電流 實際上是集中的。
在該情況中，明顯的是，可以以AC或DC (直流電)形式產(chǎn)生至少 第二模式的電壓。
無論如何，按照本發(fā)明所述的方法包括檢査至少一個選擇的粒子溶解 的步驟，優(yōu)選地，通過已經(jīng)提及的在單芯片中與電極陣列集成的傳感器實現(xiàn)。
最后，按照所述方法的另一個可能變化，如果對選擇性回收由溶解產(chǎn) 生的碎片感興趣，則在上述步驟b)之后，可以進行下列步驟
C)再次對所述電極施加所述第一模式(PMAN)的電壓；和
d)當(dāng)進行步驟C)時，引起所述流體的緩慢且受控的移動，從而回收 溶解至少一個選擇的粒子的選擇性產(chǎn)物。
事實上，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知地，在通過介電泳啟動粒子運動的 情況中，作用于粒子上的力由于施加的場，與粒子半徑的立方成比例，而 流體動力學(xué)粘滯摩擦力僅與粒子半徑成比例；因此，最小的粒子(在該具 體情況中是溶解的碎片)可以隨著懸浮所述粒子的流體的緩和沖洗而被帶 走，而最大的粒子(非溶解的細胞)被位于靜態(tài)模式并在其中捕獲細胞的
nDEP柵格保持在靜態(tài)位置(逆著粘滯沖洗作用)。
圖4中顯示了所述方法，具體地按照圖1和2的方法的功效。參見圖 4 (a)，通過施加的(MA)電場(MF)，對懸浮在具有甘露糖醇280 mM (毫摩爾)和KC16.25mM的水溶液中的兩個Raji細胞進行組織，其中，陣 列的電極具有含有3.3 V峰-峰振幅的正弦曲線，導(dǎo)電覆蓋物(LID)具有 振幅6.6V，都具有頻率50kHz。將細胞置于具有蓋子的同相電極上，所 述蓋子被反相(偏差1S0。)電極包圍。
之后，施加到所述電極的電壓模式改變，并且還將右下方細胞上的電 極設(shè)置為反相，其必須被保持。盡管不存在柵格，但是細胞由于慣性保持 在相同的位置。即刻地，施加的電場改變以產(chǎn)生正的介電泳(FZAP)，使 電場(ZF)的頻率達到400kHz，并且柵格中仍然存在的粒子(CELLZ) 由于正的介電泳的力進入新的穩(wěn)定平衡點，現(xiàn)在由所述場所產(chǎn)生，其在電 極之間的間隙上，參見圖4 (b)。那個區(qū)域與電場的最大值對應(yīng)，所述最 大電場在該頻率下，足以引起膜溶解，參見圖4 (c)。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員似乎明顯地，可以以不同的方式，具體地還(或僅) 在振幅上改變電場，或者可以不同地選擇用于操縱和溶解的最初電極模 式，例如如圖5中所示。
在該情況中，從nDEP模式開始，如5 (a)，其將粒子定位在平衡點 (MPEQ)，所述平衡點(MPEQ)處于與關(guān)于下一個電極模式的pDEP平
14衡點(ZPEQ)垂直。以這種方法，選擇的細胞不從其垂直線移動，并且能夠 加速溶解過程，因為細胞需要更少的時間到達發(fā)生溶解的最大電場區(qū)域。
由介電泳操縱協(xié)助的粒子融合方法
在該情況中，通過由電極(EL)產(chǎn)生的力(F)，兩個粒子在相同的穩(wěn) 定平衡點(MPEQ)中進行接觸。選擇緊挨著處于接觸中的細胞對所施加 的刺激具有一定的振幅和頻率，以便引起兩個細胞膜融合為單一實體(圖 6)。
用容納電極陣列的芯片中集成的傳感器，例如光學(xué)類型的，則可以在 不需要外界顯微鏡的條件下檢查融合的發(fā)生。
融合的應(yīng)用包括例如生成真核細胞和細菌、或植物的雜種。
例如，能夠考慮利用類似的方法，例如組合分化的細胞和無核干細胞 重新編程分化細胞朝向干細胞。
因此，按照該方法，產(chǎn)生了第一粒子與第二粒子的融合，其中所述第 一和第二粒子是具有可溶解的膜的生物實體，例如細胞或微生物，并且
其中所述粒子的膜對外部刺激的施加是敏感的，進行下列步驟
a) 使所述第一和第二粒子(CELL)接近可選擇的電極陣列的電極 (EL)，所述電極具有與所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以對其施
加第一模式(PMAN)的電壓，從而任選地，如果需要，通過選擇性地為 所述電極通電，依靠第一力場(FMAN)，組織所述第一和第二粒子 (CEIX);
b) 對所述電極施加第二模式(PZAP)的電壓，從而創(chuàng)建第二力場 (FZAP)，所述第二力場位于基本接近將融合在一起的至少一個第一和一
個第二選擇的粒子，并且以致產(chǎn)生與適合于引起所述第一和第二選擇的粒 子膜融合的刺激的相同的施加。
由活力分離細胞的方法
在具有電極陣列的微室中，在懸浮液中沖洗多種細胞。利用集成傳感 器(例如光學(xué)的和/阻抗計的)和/或外部傳感器(例如與具有或沒有熒光 的顯微鏡相連的光學(xué)傳感器)，識別了每個平衡點(PEQ)中存在的類型或細胞。然后選擇性地將用于溶解的刺激施加到全部非目的細胞，保存鄰 近的目的細胞的活力。 . 然后將樣品洗出，回收目的活細胞和非目的細胞的溶解產(chǎn)物。 因此，按照本說明書，進行用于從包括目的粒子的粒子群中分離目的 粒子的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟
a) 將流體中懸浮的粒子群引入到微室中，其中對所述微室提供了可 選擇的電極陣列；
b) 對所述粒子群施加上述選擇性溶解的方法，從而產(chǎn)生除目的粒子
外全部粒子的選擇性溶解；
c) 回收所述目的粒子。
通過對所述電極施加多種電壓模式，對所述粒子群的全部粒子同時和
/或重復(fù)地應(yīng)用步驟b)，特別是在這樣的情況中，其中通過推理不知道目
的粒子相對于電極陣列的位置，且目的粒子具有特性以致僅對確定強度和 /或類型的刺激(通過推理也未知)敏感的特征，所述多種電壓模式是適合 于對所述粒子施加一定強度和/或類型的刺激，從而以該方式，產(chǎn)生選擇性 溶解所述粒子群中除目的粒子外的全部粒子。
不同的類型可以例如包括施加具有確定頻率的AC電壓，已知所述確 定的頻率不能溶解目的粒子，但有效地溶解其余粒子。不同的強度可以例 如是增長的強度。
關(guān)于基于目的細胞移動進入第二微室從而進行回收的分離，上述方法 表現(xiàn)出下列優(yōu)勢
1. 實施的速度
細胞在所述啟動力(DEP， ETF, EHD)下緩慢移動，并且基于細胞移動進 入用于回收的微室從而進行分類因此相對緩慢。反之亦然，完成基于活力 的分類操作的時間僅需要一個細胞到達穩(wěn)定平衡點(PEQ)最近處，和溶 解該細胞的時間(大約l秒)，并且不需要將其移動經(jīng)過整個選擇微室。
2. 不需要冷卻系統(tǒng)
通過微室亞區(qū)的工作，可以連續(xù)地溶解待消除的細胞。以這種方式，不需要具有冷卻系統(tǒng)，即使為了在具有相對導(dǎo)電的緩沖劑的非常大芯片上 工作，因為產(chǎn)生的熱量與通電面積成比例，可以將所述面積做到任意小。
3. 芯片可以具有非常大的尺寸
因為不需要同時對完整芯片進行通電，所以相對地減少對不同電極進
行剌激的軌道上的電阻降低(resistive drop on the tracks)的問題。首先， 用相對導(dǎo)電的緩沖劑，并且用電極間的低間距，所以如果對整個電極陣列 通電，則芯片中軌道中電阻降低和/或蓋子導(dǎo)電層上的降低(當(dāng)使用NDEP 柵格進行啟動時)是不能忽視的。僅對所述層的一部分進行通電，則待處 理的電阻負載是有限的，且減小了軌道中電壓的降低。
4. 還對不能用力場操縱的細胞進行操作
如果電極陣列足夠密集(具有與細胞相似或更小的尺寸)，從而能夠 在甚至不預(yù)先選擇它們的條件下，對細胞進行選擇性溶解，則仍能夠完成 本發(fā)明的方法，特別是如果待保留的細胞，其表現(xiàn)出與非目的細胞不同的 特征，對于施加到電極的電壓的不同頻率進行的刺激是敏感的。
5. 簡化微流體包裝
不需要具有雙微室，而單一隔間是足夠的，且回收不需要是選擇性的， 因此，污染與回收流的特征無關(guān)。
應(yīng)該將芯片中集成的任何傳感器用于
1. 確定目的粒子。
2. 檢査不需要的細胞的溶解。
細胞超純化方法
利用富集技術(shù)，通常容易消除以比目的細胞大若干數(shù)量級比例存在的 細胞(例如，利用密度梯度離心或用磁珠富集，等)。然而，有時難以消 除剩余的少量污染細胞(例如以0.1-10%的比例存在)，從而獲得100%純 樣品。這需要例如如果希望培養(yǎng)目的細胞，但是這些比非目的細胞增殖得
17慢，所述非目的細胞即使以低百分比存在，然后將會在增殖的下游占多數(shù)。 如在前述的選擇方法中，將細胞引入到微室中，細胞任選地在接近電 極(PEQ)的穩(wěn)定平衡點中排列起來，并且通過用電極溶解它們而消除污 染的細胞，顯然地，這發(fā)生在用合適的集成或外部傳感器或基于固有的區(qū) 別諸如對產(chǎn)生溶解的電極施加的電壓頻率識別它們之后。
也在該情況中，集成的傳感器，如果存在，能夠任選地用于
1. 確定目的粒子。
2. 檢査不需要的細胞的溶解。 然后回收100%純細胞，將其從樣品中洗出。
因此，基于本發(fā)明的這個方面，啟動了用于從污染的粒子中超純化目 的粒子的方法，所述兩種粒子均存在于粒子群中，其特征在于應(yīng)用了 上述分離方法，其中僅對污染的粒子應(yīng)用步驟b)。
細胞分析方法
在單細胞中的DNA和/或蛋白質(zhì)的生物分子水平上的研究日益是有興
趣的。按照本發(fā)明的一個方面，提出了用于從第一多種點選擇和移動可能 從多種細胞中選擇出的細胞，并將它們引到微米尺寸分析的第二多種點， 所述每個分析點包括最多一個單細胞。溶解細胞并在芯片上分析其內(nèi)容
物，例如按照已知技術(shù)諸如PCR和/或芯片上的毛細管電泳。
因此，基于本發(fā)明，提供了用于分析粒子的方法，其特征在于該方法
包括下列步驟
a) 將流體中懸浮的所述粒子引入微室；
b) 選擇性地移動所述粒子，將每一個移動到預(yù)先確定的分析點中，
所述分析點與所述微室分離，但與所述微室水力連接；
c) 對所述預(yù)先確定的分析點中存在的所述粒子應(yīng)用如上所述的選擇
性溶解方法； .
d) 對所述粒子溶解的各個碎片現(xiàn)場應(yīng)用所限定的分析方案；
其中，所述限定的分析方案選自包括PCR、芯片上的毛細管電泳； 它們的組合。細胞分析裝置
為了進行所述方法，具體地以上分析方法，優(yōu)選地使用如圖7、 8和9
所示的裝置。該裝置(圖7)包括如現(xiàn)有技術(shù)中的電極陣列，但是其特征 在于主微室(CHM)和多種第二微室(CHJ)?？梢酝ㄟ^各個進口 (IM1) 和出口 (OMl)，使主微室充滿包括至少一個細胞的樣品。每個第二微室 (CHJ)具有較大尺寸，優(yōu)選地基本與細胞尺寸相似，如圖7所示。優(yōu)選 地，每個第二微室通過具有這樣配置(長度和/或形狀)的通道(LCHG)與 主微室相連，所述配置足以在分析所需的時間內(nèi)，防止(避免或至少限制) 通過擴散的樣品分散和對于其它微室的污染。按照可能的變化(圖8)，存 在多種用于溶解的第二微室(CHLJ)，所述第二微室與用于芯片上毛細管電 泳的通道相連，例如具有交叉連接(TJ)。備選地，按照現(xiàn)有技術(shù)，利用 雙T連接可以產(chǎn)生一系列用于毛細管電泳的通道。任選地，在用于毛細管 電泳的通道的末端存在阻抗計和/或光學(xué)類型的集成傳感器(SENS一J)，其能 夠產(chǎn)生基于從所述連接(交叉或雙T)到傳感器本身分析的化合物移動時 間的電泳圖。在圖9中說明了另一種變化，其中所述多種微室中的每一個 通過每個第二微室的流體出口 (OJ)與用于電泳的毛細管(CAPJ)相連。
19
權(quán)利要求
1. 用于選擇或處理對外部刺激的施加敏感的粒子的方法，所述方法包括通過施加所述外部刺激產(chǎn)生至少一個選擇的粒子破裂/溶解的步驟，其特征在于所述方法包括下列步驟a)使所述粒子(CELL)接近可選擇的電極陣列的電極(EL)，所述電極具有與所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以對所述電極施加第一模式(PMAN)的電壓，從而任選地，如果需要，通過選擇性地為所述電極(EL)通電，依靠第一力場(FMAN)，組織所述粒子(CELL)；b)對所述電極施加第二模式(PZAP)的電壓，從而創(chuàng)建第二力場(FZAP)，所述第二力場基本上位于接近至少一個選擇的待溶解粒子(CELL)并且以致對所述至少一個選擇的粒子產(chǎn)生適合于引起其破裂或溶解的刺激的施加。
2. 按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述刺激由流體的局部加熱組 成，在所述流體中浸沒所述至少一個選擇的待溶解粒子。
3. 按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述第二模式(PZAP)的電壓使得通過所述電極陣列中那些選擇的電極的焦耳作用，產(chǎn)生選擇性加熱， 利用所述電極產(chǎn)生所述第二力場(FZAP)。
4. 按照權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于以AC或DC方式無區(qū)別 地產(chǎn)生所述第二電壓模式。
5. 按照權(quán)利要求l的方法，其特征在于用于產(chǎn)生所述第一力場(FMAN) 的第一模式(PMAN)的電壓表現(xiàn)出第一振幅(MA)和第一頻率(MF);并 且其中用于產(chǎn)生所述第二力場(FZAP)的所述第二模式(PZAP)的電壓表現(xiàn) 出第二振幅(ZA)和第二頻率(ZF)，至少其中之一與所述第一振幅(MA) 和第一頻率(MF)不同。
6. 按照權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述刺激由力組成，所述力能 夠通過所述第二力場(FZAP)施加到所述至少一個選擇的粒子；所述第 二電壓模式以AC方式產(chǎn)生。
7. 按照權(quán)利要求6的方法，其中所述至少一個選擇的粒子是具有可溶解的膜的生物實體，例如細胞，其中所述刺激由下列所組成使所述至少 一個選擇的粒子的跨膜電位達到弓I起所述膜破裂的數(shù)值。
8. 按照以上權(quán)利要求中任一項的方法，其特征在于所述方法包括檢查 所述至少一個選擇的粒子溶解的步驟，優(yōu)選地，通過在單芯片中與所述電 極陣列集成的傳感器而進行。
9. 按照以上權(quán)利要求中任一項的方法，其中將所述粒子懸浮在流體 中，其特征在于所述方法在步驟b)后，還包括下列步驟C)對所述電極施加所述第一模式(PMAN)的電壓；和 d)當(dāng)進行步驟C)時，引起所述流體的緩慢且受控的移動，從而回收 所述至少一個選擇的粒子的溶解的選擇的產(chǎn)物。
10. 按照以上權(quán)利要求中任一項的方法，其中將所述粒子懸浮在流體、 中，其特征在于以表現(xiàn)出相對低的電導(dǎo)率的方式選擇所述流體。
11. 用于從包括目的粒子的粒子群中分離所述目的粒子的方法，其特 征在于所述方法包括下列步驟a) 將流體中懸浮的所述粒子群引入微室，并使所述粒子(CELL)接 近所述微室中提供的可選擇的電極陣列的電極(EL)，所述電極具有與所 述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以對所述電極施加第一模式(PMAN) 的電壓，從而任選地，如果需要，通過選擇性地為所述電極(EL)通電，依 靠第一力場(FMAN)，組織所述二粒子(CELL);b) 對所述電極施加第二模式(PZAP)的電壓，從而創(chuàng)建第二力場 (FZAP)，所述第二力場基本上接近除目的粒子外所述粒子群中的全部粒子，并且以致將適合于引起除所述目的粒子外全部粒子的選擇性溶解的相 同刺激施加到所述電極；c) 回收所述目的粒子。
12. 按照權(quán)利要求11的方法，其特征在于通過對所述電極施加多種電 壓模式，對所述粒子群的全部粒子同時和/或重復(fù)地應(yīng)用步驟b)，所述多 種電壓模式適合于對所述粒子施加一定強度和/或類型的刺激，以致引起除 所述目的粒子外的所述粒子群中全部粒子的選擇性溶解。
13. 用于從污染的粒子中超-純化目的粒子的方法，所述兩種粒子均存 在于粒子群中，其特征在于應(yīng)用了按照權(quán)利要求11或12的分離方法，其中僅對所述污染的粒子應(yīng)用步驟b)。
14. 用于分析粒子的方法，其特征在于所述方法包括下列步驟a) 將流體中懸浮的所述粒子引入到微室中；b) 選擇性地移動所述粒子，將每一個移動到預(yù)先確定的分析點中，所述分析點與所述微室分開但水力連接到所述微室；c) 對所述預(yù)先確定的分析點中存在的所述粒子應(yīng)用按照權(quán)利要求1-8 中任一項的方法；d) 對所述粒子溶解的各個碎片現(xiàn)場應(yīng)用限定的分析方案。
15. 按照權(quán)利要求14的方法，其中所述限定的分析方案選自包括下列 的組PCR、芯片上的毛細管電泳；上述的組合。
16. 用于引起第一粒子與第二粒子融合的方法，其中所述第一和第二 粒子是具有可溶解的膜的生物實體，例如細胞或微生物，并且其中所述 粒子的膜對外部刺激的施加敏感，其特征在于所述方法包括下列步驟a) 使所述粒子(CELL)接近可選擇的電極陣列的電極(EL)，所述 電極具有與所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以對所述電極施加第一 模式(PMAN)的電壓，從而任選地，如果需要，通過選擇性地為所述電 極(EL)通電，依靠第一力場(FMAN)，組織所述粒子(CELL);b) 對所述電極施加第二模式(PZAP)的電壓，從而產(chǎn)生第二力場 (FZAP)，所述第二力場基本上接近將融合在一起的至少一個第一和一個第二選擇的粒子(CELL),并且以致對所述粒子產(chǎn)生刺激的施加，所述刺 激適合于產(chǎn)生所述第一和第二選擇的粒子膜的融合。
17. 用于選擇和處理所述類型的粒子的裝置，所述裝置包括至少一個 第一微室，所述第一微室適合于容納流體中懸浮的所述粒子，并且提供可 選擇的和可尋址的電極陣列，所述電極具有與所述粒子的尺寸基本相似或 更小的尺寸，并且適合于產(chǎn)生與對所述電極施加第一模式(PMAN)電壓所 對應(yīng)的第一力場(FMAN);其特征在于所述裝置還包括多個第二微室，每 個所述第二微室具有與所述粒子尺寸相似但更大的尺寸，并提供至少一個 可選擇性激活和選擇的電極，并且適合于產(chǎn)生第二力場(FZAP)，所述第二 力場位于基本上接近所述第二微室的所述至少一個電極，對應(yīng)于將第二模 式(PZAP)的電壓施加到所述至少一個電極；其中所述第二微室以這樣的方式水力連接到所述至少一個微室，以便適合于通過各個具有這樣配置的通 道接收所述流體中懸浮的至少一個選擇的所述粒子中的每一個，所述配置 防止或至少基本減緩所述至少一個第一微室和所述第二微室之間以及所 述第二微室自身之間的任何擴散現(xiàn)象。
18. 按照權(quán)利要求17的裝置，其特征在于至少一些所述第二微室連接到用于芯片上毛細管電泳的通道，優(yōu)選地，通過交叉連接。
19. 按照權(quán)利要求18的裝置，其特征在于在所述用于芯片上毛細管電 泳的通道末端存在至少一個光學(xué)或阻抗計(impedenziometric)傳感器。
20. 按照權(quán)利要求17的裝置，其特征在于至少一些所述第二微室通過 所述第二微室的各個流體出口連接到用于電泳的毛細管。
全文摘要
用于選擇和處理對施加外部刺激敏感的粒子的方法和裝置，其中通過應(yīng)用外部刺激，產(chǎn)生了至少一個選擇的粒子的破裂/溶解或第一和第二選擇的粒子的融合，通過利用由對可選擇的電極陣列的電極(EL)選擇性通電引起的第一力場(FMAN)組織粒子(CELL)，所述電極具有與粒子尺寸相似或更小的尺寸，對所述電極施加第一配置(PMAN)的電壓；和對所述電極施加第二配置(PZAP)的電壓，從而創(chuàng)建第二力場(FZAP)，所述第二力場位于基本接近至少一個選擇的待溶解粒子(CELL)或接近待融合的一對第一和第二粒子，并且以致產(chǎn)生適合于引起它們?nèi)芙饣蛉诤系拇碳さ氖┯谩?br> 文檔編號B03C5/00GK101484245SQ200780021577
公開日2009年7月15日 申請日期2007年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月12日
發(fā)明者尼科洛·馬納雷西, 梅拉尼·阿博南, 詹內(nèi)伊·梅多羅 申請人:硅生物系統(tǒng)股份公司