復(fù)合納米微球固相萃取小柱及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)中與蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)的材料富集技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種介孔Si02/Ti02納米復(fù)合材料的制備方法，主要用于磷酸化蛋白的選擇性富集和檢測，富集后的樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測，從而大大提高對磷酸化蛋白的檢測靈敏度。
【背景技術(shù)】
[0002]磷酸化是一個(gè)共價(jià)磷酸基團(tuán)可逆結(jié)合到一個(gè)或者多個(gè)氨基酸，這是細(xì)胞調(diào)控機(jī)制中最常見的蛋白質(zhì)修飾。在生物學(xué)理論研宄中，磷酸化作用是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能最基本、最普遍，也是最重要的機(jī)制，參與多種細(xì)胞監(jiān)管功能，如控制細(xì)胞周期、信號傳導(dǎo)、分化、增殖、改造和新陳代謝作用；在醫(yī)藥學(xué)臨床實(shí)踐中，磷酸化蛋白起著誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、減少細(xì)胞凋亡、增加腦組織缺氧耐受性、促進(jìn)血管生成等重要醫(yī)療作用，參與各類疾病的臨床研宄，如腫瘤的研宄以及新的藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)等。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研宄是促進(jìn)其生物學(xué)理論與醫(yī)學(xué)應(yīng)用緊密結(jié)合的橋梁。因此，檢測被修飾的磷酸化蛋白，對深入研宄其細(xì)胞調(diào)控機(jī)制并將其運(yùn)用至各類頑疾的調(diào)查研發(fā)具有極為重要的意義。
[0003]為了分析蛋白的磷酸化作用，已有研宄者用蛋白酶消解蛋白，將所得的肽片段直接通過質(zhì)譜技術(shù)分析D [參見:(a)Pinkse，M.W.H.;Uitto，P.M.;Hilhorst，M.J.;Ooms，Β.;Heck，A.J.R.Anal.Chem.2004，76，3935-3943.(b) Yue，G.E.;Roper，M.G.;Balchunas，C.;Pulsipher，A.;Coon，J.J.；Shabanowitz? J.;Hunt，D.F.；Landers? J.P.;Ferrance，J.P.Anal.Chim.Acta 2006，564，116-122.]目前該方法遇到許多問題:一，，由于消化后的肽混合物過于復(fù)雜，磷酸化一般以亞化學(xué)計(jì)量方式發(fā)生，因此非磷酸化肽的豐度要比磷酸化肽高得多；二，用于檢測磷酸化肽的質(zhì)譜分析技術(shù)靈敏度低；三，在低壽命的質(zhì)譜條件下，磷酸根離子的離子化效率在檢測方面變得更低?？梢?，目前的質(zhì)譜分析技術(shù)對于磷酸化肽的檢測較為困難。為了解決檢測磷酸化肽的各種困難，各種技術(shù)都在向磷酸化肽的富集方向發(fā)展。[參見:(a) Leitner，A.Trends Anal.Chem.2010，29，177-185.(b)Dunn，J.D.;Reid，G.E.;Bruening，M.L Mass Spectrom.Rev.2010，29，29-54.(c) Rogers，L D.;Foster，L.J.Mo 1.B1syst.2009，5，1122-1129.(d)Han，G.;Ye，M.;Zou，H.Analyst 2008，133，1128-1138.(30)Mamone? G.;Picariello，G.;Ferranti，P.;Addeo，F(xiàn).Proteomics2010，10，380-393.]
[0004]目前，以共價(jià)或非共價(jià)相互作用為基礎(chǔ)的磷酸化肽富集方法在各項(xiàng)研究中使用。磷酸化肽在固定的金屬磷酸鹽離子對的相互作用下，通過結(jié)合螯合金屬離子采用金屬離子親和層析法(IMAC)[參見:(a) Andersson? L ;Porath，J.Anal.B1chem.1986，154，250-254.(b)Posewitz，M.C.;Tempst，P.Anal.Chem.1999，71，2883-2892.]。在金屬氧化物和磷酸基團(tuán)之間的相互作用下，金屬氧化物親和層析(M0AC，例如，二氧化鈦、氧化,告)也被用于磷酸化肽的富集[參見:(a) Larsen，KR.；Thingholm? Τ.Ε.；Jensen? 0.N.；Roepstorff，P.; Jorgensen，Τ.J.D.Mol.Cell.Proteomics 2005，4，873-886.(b)Kweon，H.K.;Hakansson，K.Anal.Chem.2006，78，1743-1749.]。雖有報(bào)道各種富集方法，但到目前為止，未曾有報(bào)道采用相關(guān)功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米材料實(shí)現(xiàn)選擇性富集。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于功能化介孔Si02/Ti0^合納米微球的固相萃取小柱及其制備方法，能夠用于富集生物體液以及復(fù)雜基質(zhì)中的磷酸化肽。
[0006]技術(shù)方案:一種功能化介孔Si02/Ti0^合納米微球的固相萃取小柱，所述的固相萃取柱的基質(zhì)為功能化的介孔S12Zt12復(fù)合納米微球，介孔S1 2納米微球直徑為50?150nm，平均孔徑為4?5nm，介孔S12納米微球表面附著T1 2納米球，T12納米球直徑為3?5nm ;固相萃取柱空管容積為100 μ L?lmL，填裝高度為0.2?0.5cm,空管材質(zhì)為聚烯烴。
[0007]制備所述的功能化介孔Si02/Ti0；^合納米微球的方法，由原始介孔S12納米微球經(jīng)胺基化修飾、T12納米球經(jīng)羧基化修飾，然后通過酰胺反應(yīng)所得，共價(jià)化學(xué)修飾按以下步驟進(jìn)行:
[0008](I)介孔S12納米微球表面胺基化:在無水乙醇溶劑中加入介孔S12納米微球和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，介孔S12納米微球與APS的質(zhì)量比為2:1?1: 5，介孔S1^米微球的質(zhì)量濃度為2mg/mL?20mg/mL，混合后通N 2半小時(shí)以排出空氣，然后在攪拌作用下于50?90°C條件下反應(yīng)5?24小時(shí)，反應(yīng)完成后離心分離5min，轉(zhuǎn)速為9000轉(zhuǎn)/min，用乙醇洗滌沉淀物，離心產(chǎn)物真空干燥，得干燥后的胺基化的介孔Si02m米微球；
[0009](2)T12納米球表面羧基化:在二氯甲烷溶劑中加入制備得到的T1 2納米球及3-巰基丙酸(MPA)，1102納米球和MPA的質(zhì)量比為20:1?4: 1，T1 2納米球的質(zhì)量濃度為2mg/mL?20mg/mL，混合后通N2半小時(shí)以排出空氣，然后在攪拌作用下于10?40°C條件下反應(yīng)0.5?2小時(shí)，反應(yīng)完成后離心分離5min，轉(zhuǎn)速為9000轉(zhuǎn)/min，用乙醇洗滌沉淀物，離心產(chǎn)物真空干燥，得干燥后的羧基化的打02納米球。
[0010](3)功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球的制備:在水溶液中加入制備得到的介孔S12納米微球和T12納米球以及交聯(lián)劑1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、琥珀酰亞胺(NHS)，Si02/Ti0,量比為4:1?3: 1，S1 2與EDC、NHS質(zhì)量比為(20?5):1: 1，介孔S12納米球的質(zhì)量濃度為2mg/mL?20mg/mL，混合后通1半小時(shí)以排出空氣，然后在攪拌作用下于10?40°C條件下反應(yīng)0.5?2小時(shí)，反應(yīng)完成后離心分離5min，轉(zhuǎn)速為9000轉(zhuǎn)/min，用乙醇洗滌沉淀物，離心產(chǎn)物真空干燥，得功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球。
[0011]所述的一種功能化介孔3102/1102復(fù)合納米微球的固相萃取小柱，制備方法為:
[0012](I)將一片多孔性聚乙烯下篩板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯篩板孔徑為5 ?20 μ m ;
[0013](2)將相當(dāng)于固相萃取柱空管容積三分之一到三分之二的功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球干法填裝入柱內(nèi)；
[0014](3)在填裝的功能化介孔3;102/1102復(fù)合納米微球上放入另一片多孔性聚乙稀上篩板，聚乙烯篩板孔徑為5?20 μ m，壓緊填料使填裝柱高度保持在0.2?0.5cm,制備得到固相萃取小柱。
[0015]所述介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球固相萃取小柱用于富集的步驟包括:在進(jìn)行富集之前，首先用(5?20)mL甲醇、乙腈或者相應(yīng)的緩沖溶液活化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球，然后在負(fù)壓驅(qū)動(dòng)下使樣品溶液流過柱子，采用適量體積清洗液洗去基體的雜質(zhì)，使用合適的洗脫液把分析物洗脫收集到容器中，然后進(jìn)行分析。
[0016]與現(xiàn)有的固相富集小柱相比，本發(fā)明所提供的功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球固相萃取小柱具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0017](I)環(huán)境友好:本發(fā)明的介孔型Si02/Ti02納米復(fù)合材料本身是環(huán)境友好的，并且在制備過程中，步驟簡單，只需消耗少量的有機(jī)溶劑，不會(huì)引入其他有毒有害物質(zhì)；
[0018](2)穩(wěn)定性好，可再生和重復(fù)利用。吸附在介孔型Si02/Ti02納米復(fù)合材料上的目標(biāo)物能容易地用少量有機(jī)溶劑洗脫下來，鍵合的官能團(tuán)不會(huì)被破壞，可以重復(fù)利用。
[0019](3) 二氧化硅被胺功能化可固定磷酸化多肽基團(tuán)，而二氧化鈦通過螯合金屬離子捕獲、富集。本發(fā)明是由經(jīng)胺基化修飾后的二氧化硅納米顆粒與經(jīng)羧基化修飾后的二氧化鈦納米顆粒，通過酰胺化作用結(jié)合，從而制得對磷酸化蛋白具有多重富集作用的納米復(fù)合型材料；
[0020](4)在完成發(fā)明的過程中，選擇酪蛋白作為研宄目標(biāo)物，對所述固相萃取小柱的各項(xiàng)性能指標(biāo)進(jìn)行了反復(fù)測試。結(jié)果表明對于上述樣品中的磷酸化多肽的加標(biāo)回收率均能達(dá)到92% -105%，解吸過程簡單，2mL的乙腈或者其鹽溶液就可將上述物質(zhì)洗脫下來，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將固相萃取小柱用乙腈、甲醇各5mL依次洗滌，無需其他操作，即可重復(fù)使用。
【附圖說明】
[0021]圖1為功能化多孔硫化鋅納米微球固相萃取柱示意圖，圖中為:固相萃取柱管1、上篩板2、下篩板3、功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球填料4 ;
[0022]圖2為合成得到的介孔型S12納米微球透射電鏡圖A(TEM)，T1 2納米球透射電鏡圖B以及復(fù)合后的介孔型Si02/Ti02納米復(fù)合材料透射電鏡圖C ；
[0023]圖3為Si02、T12、介孔型Si02/Ti02m米復(fù)合材料的FT-1R表征圖；
[0024]圖4為本發(fā)明的固相萃取小柱富集后的酪蛋白的質(zhì)譜圖；
[0025]圖5為β -酪蛋白沒有經(jīng)過富集的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下通過實(shí)施例形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0027]下面結(jié)合附圖，通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳述。
[0028]實(shí)施例1:功能化介孔Si02/Ti02復(fù)合納米微球填料的制備
[0029]實(shí)驗(yàn)材料:十六烷基三甲基溴化銨，批號為J1315062，購自上海阿拉丁試劑有限公司；油酸鈉，批號為20120920，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鈦酸正四丁酯，批號為:20140121，購自上海阿拉丁試劑有限公司;1，3，5-三甲苯，批號為:11329044，購自上海阿拉丁試劑有限公司；硅酸四乙酯，批號為:L1306074，購自上海阿拉丁試劑有限公司；2，5-二羥基苯甲酸，批號為J1312017，購自南京化學(xué)試劑有限公司；3_巰基丙酸，批號為:38194，購自上海阿拉丁試劑有限公司；胰蛋白酶(1:250)，批號為20130929，上海阿拉丁試劑有限公司；β-酪蛋白，批號為SLBK9882V，上海阿拉丁試劑有限公司；3_氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)，批號Κ1220037，上海阿拉丁試劑有限公司；1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，批號090M14531V，上海阿拉丁試劑有限公司；琥珀酰亞胺(NHS)，批號MKBG7914V，上海阿拉丁試劑有限公司。
[0030]實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備:圓底燒瓶、KQ-500DE超聲波清洗器、聚四氟乙烯反應(yīng)釜、DHG-9143BS電熱鼓風(fēng)干燥箱、DF-101S磁力加熱攪拌器、AY120電子分析天平、TGL-16C離心機(jī)。
[0031]實(shí)驗(yàn)過程:
[0032](l)Si02m米微球的制備
[0033]將3.5ml的2mol/L氫氧化鈉溶液和480ml離子水混合于大燒杯中，依次加入1.0g十