本發(fā)明涉及一種生物酶涂層的制備及其涂布于填料表面的方法，具體為用于反應(yīng)精餾的填料表面均勻涂布用溶膠-凝膠法固定的南極假絲酵母脂肪酶b(calb)涂層，屬于固定化酶技術(shù)與反應(yīng)精餾相結(jié)合領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

酶作為生物催化劑，具有催化能力強(qiáng)、效率高，反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，具有常規(guī)的化學(xué)催化劑所無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。南極假絲酵母脂肪酶b(calb)是一種脂肪酶，它對(duì)非水溶性和水溶性物質(zhì)都有很強(qiáng)的催化活性，其在酯化、水解、轉(zhuǎn)酯等反應(yīng)中顯示了較其它脂肪酶更為出色的催化性能。

酶的固定化是通過(guò)化學(xué)或物理的處理方法，使原來(lái)水溶性的酶與固態(tài)非水溶性支持物相結(jié)合或被載體包埋。固定化方法主要有四大類(lèi)：共價(jià)結(jié)合法、離子交換法、吸附法(超濾膜吸附法)、包埋法。其中溶膠-凝膠材料具有優(yōu)良的光學(xué)性能、熱性能、化學(xué)惰性、生物相容性以及制備條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。

反應(yīng)精餾(reactiondistillation簡(jiǎn)稱(chēng)rd)，即將反應(yīng)與精餾兩個(gè)原本獨(dú)立的化工操作單元，相結(jié)合到同一個(gè)裝置的化工過(guò)程。在反應(yīng)精餾過(guò)程中，反應(yīng)與分離相互影響。分離過(guò)程可以將生成物及時(shí)從反應(yīng)區(qū)域移除，大大提高了轉(zhuǎn)化率和選擇性，強(qiáng)化了反應(yīng)過(guò)程；而反應(yīng)過(guò)程同時(shí)又強(qiáng)化了分離過(guò)程。因此反應(yīng)精餾技術(shù)具有選擇性強(qiáng)、投資少、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

將生物酶催化與反應(yīng)精餾過(guò)程的結(jié)合，避免了傳統(tǒng)催化劑在生產(chǎn)和使用過(guò)程中的環(huán)境污染問(wèn)題，是對(duì)反應(yīng)精餾技術(shù)的重大技術(shù)革新。若反應(yīng)精餾中使用游離酶，有如下幾個(gè)限制因素：1，游離酶的活性和穩(wěn)定性易受溫度ph等條件的嚴(yán)重影響；2，游離酶無(wú)法進(jìn)行回收利用，造成了浪費(fèi)與經(jīng)濟(jì)損失。3，游離酶與生成物的混合不利于后續(xù)步驟的分離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是針對(duì)當(dāng)前技術(shù)中存在的不足，提供一種最優(yōu)的生物酶涂層的制備方法和一種反應(yīng)精餾用填料表面涂布方法，是酶固定化技術(shù)與反應(yīng)精餾的結(jié)合。采用溶膠-凝膠方法固定的酶均勻涂布在填料表面后，此填料可填充到反應(yīng)精餾塔中使用，這樣具有生物酶涂層的填料就可以起到催化與分離的雙重效果。此方案是首次將生物酶作為催化劑引入到反應(yīng)精餾過(guò)程的有效途徑。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，條件溫和，工業(yè)應(yīng)用價(jià)值高。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種反應(yīng)精餾用酶催化填料，所述的酶催化填料由以下方法制得，包括以下步驟：

將填料浸沒(méi)在含有生物酶的溶膠中20～30秒，取出后干燥10～20秒；然后再次浸沒(méi)入溶膠中20～30秒，再次取出后干燥10～20秒；重復(fù)浸沒(méi)-干燥步驟8～15次；最后將填料干燥至重量不變，即得到附著有生物酶涂層的酶催化填料；

所述的溶膠的組成為組分a和組分b；所述的a組分包括含氧硅烷混合物和溶劑；所述的b組分包括催化劑、交聯(lián)劑、蛋白溶液和去離子水；

所述的含氧硅烷混合物為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6～9％的四甲氧基硅烷(tmos)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)27～30％的甲基三氧甲基硅烷(mtms)；

所述的溶劑為甲醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為31～35％；

所述的催化劑為氟化鈉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4～5％；

所述的交聯(lián)劑為聚乙二醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～2％；

所述的去離子水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10～13％；

所述的酶溶液為南極假絲酵母脂肪酶b(calb)溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6～21％；南極假絲酵母脂肪酶b溶液的蛋白含量為10.9mg/ml；

所用化學(xué)試劑皆為分析純，所說(shuō)各物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均指其占溶膠總質(zhì)量的的百分?jǐn)?shù)。

所述的含有生物酶的溶膠的制備方法，該方法包括以下步驟：

按照上述比例，將組分a中的物質(zhì)放入容器中，然后冰水浴攪拌3～5分鐘；另將組分b中的催化劑、去離子水、calb溶液和交聯(lián)劑加入到反應(yīng)器中，攪拌后后倒入組分a；混合后在400～500r/min的速率下進(jìn)行攪拌，反應(yīng)3～5分鐘即可得到含有生物酶的溶膠。

所述的反應(yīng)精餾用酶催化填料的應(yīng)用，可應(yīng)用于酯交換催化精餾反應(yīng)。

所述的酯交換催化精餾反應(yīng)優(yōu)選為應(yīng)用于乙酸乙酯和正丁醇的酯交換反應(yīng)精餾。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明介紹了一種生物酶涂層的制備和涂布方法，利用溶膠-凝膠原理，將生物酶溶膠均勻涂布在填料表面，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)生物酶固定化技術(shù)與反應(yīng)精餾技術(shù)的結(jié)合，具有新穎性與經(jīng)濟(jì)性。

此發(fā)明相對(duì)于傳統(tǒng)的反應(yīng)精餾，優(yōu)點(diǎn)有：1，生物酶和填料相結(jié)合的反應(yīng)精餾塔，省去了催化劑筐，降低了填料塔塔壓降。2，與塔釜添加催化劑的傳統(tǒng)操作方法相比，生物酶和填料的結(jié)合可以起到催化劑的重復(fù)使用與回收的作用。3，將生物酶固定到填料上，酶不易失活，穩(wěn)定性好，催化效率高。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，條件溫和，有明顯的經(jīng)濟(jì)型和新穎性。目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)與專(zhuān)利報(bào)道。

使用過(guò)程中，將此涂層填料裝填在內(nèi)徑50mm，塔高960mm的精餾塔內(nèi)，反應(yīng)物為乙酸乙酯和丁醇，每次反應(yīng)9小時(shí)，第一次反應(yīng)后涂層質(zhì)量損失約為20％，重復(fù)此過(guò)程三次，這三次實(shí)驗(yàn)涂層幾乎再無(wú)質(zhì)量損失(第一次質(zhì)量損失是由于實(shí)驗(yàn)中涂層表面的松散物質(zhì)被沖刷掉)。且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正丁醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)到99％以上，說(shuō)明填料涂層的穩(wěn)定性和活性很高。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中固定生物酶的凝膠表面掃描電鏡圖

圖2為實(shí)施例1中涂布生物酶凝膠的填料表面掃描電鏡圖

具體實(shí)施方式

本發(fā)明中所述的南極假絲酵母脂肪酶b為市售公知材料。

實(shí)施例1：

a溶液的配制：分別取四甲氧基硅烷(tmos)0.35g、甲基三氧甲基硅烷1.4g、甲醇1.6g混合，于冰水浴內(nèi)攪拌3分鐘。

b溶液的配制：分別取0.225g氟化鈉、聚乙二醇(400)0.075g、calb酶溶液0.8g(蛋白含量為10.9mg/ml)，、去離子水0.55g進(jìn)行混合，室溫下攪拌4分鐘。

將b溶液引流至a溶液中，在冰水浴內(nèi)攪拌3分鐘后移至室溫。

將此溶膠分等分為兩份，一份用磷酸緩沖液(ph＝7.5)沖洗三次后干燥得到凝膠，如附圖1所示。另一份將cy-500型填料浸入到溶膠內(nèi)20s后取出，室溫下放置20s后再次浸入溶膠內(nèi)，重復(fù)此步驟12次，直至溶膠溶液固化成凝膠。常溫下將涂布凝膠的填料干燥48小時(shí)直至重量不變，然后在低溫條件下儲(chǔ)存，其掃描電鏡圖如附圖2所示，填料涂層的比表面積為93m²/g，孔隙容積為0.2cm³/g。

經(jīng)過(guò)對(duì)比圖1和圖2可發(fā)現(xiàn)，固定在填料表面的凝膠與直接干燥凝膠相比，表面更加平整，比表面積更大，因而更有利于催化反應(yīng)的進(jìn)行。

測(cè)試上述制得的填料表面涂層中所含calb酶的活力：用乙酸乙酯和丁醇的酯交換反應(yīng)測(cè)量酶活性。乙酸乙酯和丁醇摩爾比為1:1，反應(yīng)溫度為60℃，轉(zhuǎn)速為400r/min。反應(yīng)后所測(cè)樣品在和乙腈混合后在離心機(jī)離心1.5min。然后用氣相色譜進(jìn)行分析。定義每分鐘催化消耗1μmol丁醇所需的酶量為一個(gè)活力單位(u)。測(cè)定值為110u/mg。結(jié)果顯示填料表面涂層所含酶的活性高。

實(shí)施例2：

a溶液的配制：分別取四甲氧基硅烷(tmos)0.4g、甲基三氧甲基硅烷1.45g、甲醇1.7g混合，于冰水浴內(nèi)攪拌3分鐘。

b溶液的配制：分別取0.25g氟化鈉、聚乙二醇(400)0.075g、calb酶溶液0.525g(蛋白含量為10.9mg/ml)、去離子水0.6g進(jìn)行混合，室溫下攪拌4分鐘。

將b溶液引流至a溶液中，在冰水浴內(nèi)攪拌3分鐘后移至室溫。

將cy-500型填料浸入到溶膠內(nèi)20s后取出，室溫下放置20s后再次浸入溶膠內(nèi)。重復(fù)此步驟13次。常溫下將此填料干燥48小時(shí)直至重量不變，然后在低溫條件下儲(chǔ)存。

測(cè)試上述制得的填料表面涂層中所含calb酶的活力：用乙酸乙酯和丁醇的酯交換反應(yīng)測(cè)量酶活性。乙酸乙酯和丁醇摩爾比為1:1，反應(yīng)溫度為60℃，轉(zhuǎn)速為400r/min。反應(yīng)后所測(cè)樣品和乙腈混合后在離心機(jī)離心1.5min。然后用氣相色譜進(jìn)行分析。定義每分鐘催化消耗1μmol丁醇所需的酶量為一個(gè)活力單位(u)。測(cè)定值為125u/mg。結(jié)果顯示填料表面涂層所含酶的活性高。

將此填料分別存放于2℃、20℃、60℃條件下存放，50天后測(cè)其酶活性。酶活性分別為：121u/mg、116u/mg、70u/mg。此實(shí)驗(yàn)表明含填料表面涂層穩(wěn)定性很好。

實(shí)施例3：

a溶液的配制：分別取四甲氧基硅烷(tmos)0.9g、甲基三氧甲基硅烷2.7g、甲醇3.1g混合，于冰水浴內(nèi)攪拌3分鐘。

b溶液的配制：分別取0.4g氟化鈉、聚乙二醇(400)0.2g、calb酶溶液1.4g(蛋白含量為10.9mg/ml)、去離子水1.3g進(jìn)行混合，室溫下攪拌4分鐘。

將b溶液引流至a溶液中，在冰水浴內(nèi)攪拌3分鐘后移至室溫。

將cy-500型填料浸入到溶膠內(nèi)20s后取出，室溫下放置20s后再次浸入溶膠內(nèi)。重復(fù)此步驟10次。常溫下將此填料干燥48小時(shí)直至重量不變，然后在低溫條件下儲(chǔ)存。

測(cè)試上述制得的填料表面涂層中所含calb酶的活力：用乙酸乙酯和丁醇的酯交換反應(yīng)測(cè)量酶活性。乙酸乙酯和丁醇摩爾比為1:1，反應(yīng)溫度為60℃，轉(zhuǎn)速為400r/min。反應(yīng)后所測(cè)樣品和乙腈混合后在離心機(jī)離心1.5min。然后用氣相色譜進(jìn)行分析。定義每分鐘催化消耗1μmol丁醇所需的酶量為一個(gè)活力單位(u)。測(cè)定值為120u/mg。結(jié)果顯示填料表面涂層所含酶的活性高。

將此實(shí)施例3的填料共12塊填充到塔內(nèi)徑50mm，塔高960mm的玻璃精餾塔內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)精餾，反應(yīng)物為乙酸乙酯和丁醇，摩爾比為7:3，塔內(nèi)壓力10kpa，塔釜溫度65℃。12塊填料共負(fù)載凝膠38.6g，反應(yīng)6.5小時(shí)后達(dá)到平衡，經(jīng)分析丁醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)到99％以上，負(fù)載凝膠質(zhì)量損失約為20％。重復(fù)此實(shí)驗(yàn)三次，每次反應(yīng)9小時(shí)(在不更換填料的情況下，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，每次9小時(shí),每次結(jié)束后對(duì)涂層質(zhì)量和塔釜含氮量進(jìn)行分析)，后三次負(fù)載的凝膠幾乎再無(wú)質(zhì)量損失。對(duì)塔釜進(jìn)行含氮量分析可知，所負(fù)載的凝膠平均酶損失量為3％。

上述以乙酸乙酯和正丁醇為例的酯交換反應(yīng)精餾，可使丁醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到99％以上，體現(xiàn)了此催化填料的高效性。使用此催化填料進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，丁醇轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定在99％以上，且凝膠質(zhì)量和酶質(zhì)量穩(wěn)定不易損失，說(shuō)明此催化填料穩(wěn)定性很好，具有工業(yè)推廣的價(jià)值。

本發(fā)明未盡事宜為公知技術(shù)。