本發(fā)明涉及一種pH穩(wěn)定、粒徑均一殼聚糖微球免疫親和吸附劑的制備及其用途，屬于天然多糖開發(fā)應(yīng)用和功能材料制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

抗生素在臨床治療、畜牧業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域有著重要應(yīng)用，但長期和過量使用給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來了嚴重的危害，一方面是病原微生物耐藥性的產(chǎn)生，另一方面是抗生素農(nóng)產(chǎn)品和水環(huán)境中的殘留。包括我國在內(nèi)的許多國家和國際組織明確規(guī)定禁止或限量抗生素在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用，并開始相關(guān)的監(jiān)測工作。目前，針對農(nóng)產(chǎn)品中抗生素殘留檢測以HPLC、GC/MS或LC/MS等儀器分析方法為主，樣品前處理通常采用固相萃取方法進行凈化富集，但固相萃取特異性低、易引入雜質(zhì)干擾。免疫親合色譜(IAC)利用抗原-抗體特異性可逆結(jié)合，實現(xiàn)目標(biāo)物的分離分析，具有特異性高、操作簡便快速等優(yōu)點，因而備受關(guān)注。

目前最常用的商品化色譜填料載體是瓊脂糖凝膠，性能穩(wěn)定且具有良好的生物相容性，但在活化和再生過程中需要用到劇毒的溴化氰，價格也過于昂貴。因此，尋找開發(fā)一種性能優(yōu)良且經(jīng)濟實用的色譜填料載體是目前許多實驗室致力研究的方向。

殼聚糖，幾丁質(zhì)脫乙酰產(chǎn)物，自然界中僅次于纖維素的第二大天然多糖，來源豐富，具有安全無毒、易降解、良好的生物相容性等優(yōu)點。此外，殼聚糖表面含有大量的可修飾功能基團(羥基和氨基)，可以通過酰化、羥基化、醚化、希夫氏反應(yīng)、酯化、水解等反應(yīng)制備出各種衍生物。因而，殼聚糖不僅是一種天然資源，更是一種新材料在醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。目前制備得到的殼聚糖微球為載體色譜填料存在著微球大小不均一、酸性條件下不穩(wěn)定等缺點，限制了它的廣泛使用。為了解決這一問題，本發(fā)明通過優(yōu)化改良殼聚糖微球制備方法，并將其與抗生素抗體結(jié)合，獲得了一種pH穩(wěn)定、粒徑均一殼聚糖微球免疫親和吸附劑，利用所得的免疫親和吸附劑對食品樣品中的抗生素殘留進行凈化分離和分析測定。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種pH穩(wěn)定、粒徑均一殼聚糖微球免疫親和吸附劑的制備方法，用該方法制備的免疫親和吸附劑對食品樣品中的抗生素殘留進行吸附分離。

本發(fā)明中殼聚糖微球的制備采用乳化交聯(lián)法，以殼聚糖為原料，戊二醛為交聯(lián)劑，span 80為乳化劑。理化表征分析顯示，殼聚糖微球粒徑大小均一，且在pH 4-10范圍內(nèi)穩(wěn)定。將所得的殼聚糖微球與抗生素抗體偶聯(lián)得到的免疫親和吸附劑，并將其用于實際樣品中抗生素殘留的凈化分離和分析測定。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種殼聚糖微球免疫親和吸附劑的制備方法，按照下述步驟進行：

步驟(1)、配制殼聚糖溶液，量取含質(zhì)量濃度為2％乳化劑span 80的液體石蠟加入到殼聚糖溶液中，攪拌乳化得到混合液，加入交聯(lián)劑進行攪拌交聯(lián)，索氏抽提、乙醇漂洗、水洗、還原、再水洗得到殼聚糖微球；

步驟(2)、將步驟(1)中制備的殼聚糖微球與抗生素抗體進行攪拌偶聯(lián)，蒸餾水和PBS洗滌后得到免疫親和吸附劑。

本發(fā)明步驟(1)中，所述的殼聚糖分子量為600kD，殼聚糖濃度為2wt％。

本發(fā)明步驟(1)中，所述的殼聚糖(水相)：含2％span 80的液體石蠟(油相)體積比為1:8。

本發(fā)明步驟(1)中，所述的交聯(lián)劑為戊二醛，殼聚糖(氨基)：戊二醛(醛基)摩爾比為1:0.5。

本發(fā)明步驟(1)中，所述的攪拌速度為400rpm。

本發(fā)明步驟(2)中，所述的偶聯(lián)劑為環(huán)氧氯丙烷，體積濃度為20％。

所制備的pH穩(wěn)定、粒徑均一殼聚糖微球免疫親和吸附劑用于食品樣品中抗生素殘留的凈化分離和分析測定。

本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明開發(fā)了一種來源豐富、安全無毒天然多糖色譜填料載體；(2)本發(fā)明制備的殼聚糖微球粒徑大小均一，且具有較寬的pH穩(wěn)定性；(3)本發(fā)明制備的殼聚糖微球免疫親和吸附劑可用于實際樣品中抗生素殘留的凈化分離和分析測定。

附圖說明

圖1.本發(fā)明不同分子量殼聚糖制備微球的掃描電鏡圖；

圖2.本發(fā)明殼聚糖微球的粒徑分布圖；

圖3.本發(fā)明殼聚糖微球pH穩(wěn)定性圖；

圖4.本發(fā)明殼聚糖微球免疫親和柱外觀圖；

圖5.本發(fā)明icELISA評價方法標(biāo)準曲線圖；

圖6.本發(fā)明HPLC評價方法標(biāo)準曲線圖。

具體實施方式

本發(fā)明下面的實施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1一種pH穩(wěn)定、粒徑均一殼聚糖微球免疫親和吸附劑的制備

(1)pH穩(wěn)定、粒徑均一殼聚糖微球的制備：

a.取0.24g殼聚糖，在12mL 2％的醋酸溶液中溶解配成2％的殼聚糖溶液；

b.加入98mL含有2％span 80的石蠟油，乳化3h；

c.加入3.6mL的交聯(lián)劑交聯(lián)反應(yīng)3h，加入氫氧化鈉溶液以保持體系pH在9～10；

d.反應(yīng)完畢后，3000rpm，8min離心收集微球后用石油醚索氏抽提6h，乙醇梯度洗脫后蒸餾水洗至中性用5M NaBH₄還原過夜最后再用蒸餾水洗至中性，冷凍干燥后備用。

(2)免疫親和吸附劑的制備，本實施例以恩諾沙星為例：

a.稱取0.4g的交聯(lián)殼聚糖，用pH 8.3、0.1mol/L NaHCO₃(含0.5mol/L NaCl)的偶聯(lián)緩沖液洗滌2次后，沉淀重新懸浮于5mL的偶聯(lián)緩沖液中，再加入2mL0.15mg/mL的單克隆抗體溶液，攪拌吸附3h；

b.加入偶聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷，使其最終體積濃度為20％；在37℃下振蕩交聯(lián)5h；

c.交聯(lián)結(jié)束后，8000r/min離心3min取上清測定280nm和260nm處的吸光度，根據(jù)公式：C_protein(mg/mL)＝1.45A_280nm-0.74A_260nm計算未偶聯(lián)的抗體含量，進而計算偶聯(lián)率；

d.用大量水洗至中性，再用PBS洗滌2次。

試驗一、本發(fā)明所述pH穩(wěn)定、粒徑均一殼聚糖微球制備條件的優(yōu)化及性能表征

1、實施例1所制備的粒徑均一殼聚糖微球條件的確定：(1)殼聚糖分子量：本實驗中選擇殼聚糖的分子量為50kD、100kD、600kD，殼聚糖溶液濃度為2％，水相油相比為1:10，氨基醛基比為1:0.5，攪拌速率為500rpm；(2)氨基醛基比：實驗中殼聚糖分子量為600kDa，殼聚糖溶液濃度為2％，水相油相比為1:10，氨基醛基比為1:0.25，1:0.5，1:1，1:2，攪拌速率為500rpm；(3)殼聚糖溶液濃度：本實驗中分別稱取分子量為600kDa的殼聚糖0.1g、0.2g、0.3g、0.4g，溶于10ml 2％醋酸溶液中，制備成濃度為1％、2％、3％、4％殼聚糖溶液，水相油相比為1:10，氨基醛基比為1:0.5，攪拌速率為500rpm；(4)水相油相比：在本實驗中，殼聚糖分子量為600kDa，殼聚糖溶液濃度為2％，水相油相總體積為110mL，水相油相比選擇1:5、1:8、1:10、1:12，氨基醛基比為1:0.5，攪拌速率為500rpm；(5)攪拌速率：本實驗中采用600kDa分子量的殼聚糖，殼聚糖溶液濃度為2％，水相油相比為1:10，氨基醛基比為1:0.5，攪拌速率選擇200rpm、300rpm、400rpm、500rpm。按照實驗方法制備殼聚糖微球，掃描電鏡顯示600kD分子量的殼聚糖交聯(lián)制備的殼聚糖微球呈規(guī)則的球形(圖1)，激光粒度分析儀測定微球的粒徑分布與Span值，結(jié)果見表1。

經(jīng)過單因素實驗得到優(yōu)化條件：殼聚糖分子量為600kD，殼聚糖溶液濃度為2％，氨基醛基比1:0.5，水相油相比為1:8，攪拌速率為400rpm，制備獲得的殼聚糖微球呈球形(圖1)，平均粒徑124.8μm，粒徑分布度SPAN 1.1(圖2)。SPAN值按照下式計算：

SPAN＝(D₉₀-D₁₀)/D₅₀

表1不同制備參數(shù)對殼聚糖微球粒徑分布的影響

2、實施例1所制備得到的粒徑均一的殼聚糖微球化學(xué)穩(wěn)定性的確定：將0.1g交聯(lián)殼聚糖分別懸浮于50mM HAc-NaAc(pH 4.0),50mM PBS(pH 6.0),50mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM NaHCO₃-Na₂CO₃(pH 10.0)溶液中，4℃保存30h，掃描電鏡結(jié)果顯示殼聚糖微球結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化(圖3)。

試驗二、本發(fā)明所述殼聚糖微球恩諾沙星免疫親和吸附劑的制備與應(yīng)用

1、實施例1所制備得到的殼聚糖微球恩諾沙星免疫親和吸附劑結(jié)合容量的測定：取0.5mL制備的免疫親和吸附劑填充到SPE柱中得到免疫親和柱(圖4)，將10mL 400ng/mL(共4000ng)的恩諾沙星標(biāo)準品溶液過柱，上樣液每1.0mL收集一管，用間接競爭ELISA(icELISA)測定每組份中恩諾沙星含量。根據(jù)下式計算：柱容量(即被吸附的恩諾沙星總量)＝恩諾沙星上樣總量－洗下的恩諾沙星總量。結(jié)果顯示，第1～5mL上樣液中不含有恩諾沙星，上樣第6mL時開始有恩諾沙星(204ng)被洗下。因此，IAC柱的最大柱容量約為：2196/0.5＝4392ng恩諾沙星/mL凝膠。

2、實施例1所制備得到的殼聚糖微球恩諾沙星免疫親和吸附劑用于牛奶樣品中恩諾沙星的加標(biāo)回收：在5mL空白牛奶樣品中加入含量為25ng/mL、50ng/mL的ENR標(biāo)準品，每組三個平行，使用0.8％NaOH-PBS進行稀釋，振蕩15min，靜置5min后，4℃9000rpm離心15min，收集上清液，沉淀重復(fù)加入0.8％NaOH-PBS處理一次，上清液合并。分別過柱，充分洗脫后，收集洗脫液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，0.8％NaOH-PBS定容至5mL，HPLC檢測，計算回收率。

表2殼聚糖微球恩諾沙星免疫親和吸附劑用于牛奶樣品中恩諾沙星的加標(biāo)回收

試驗三、本發(fā)明所述殼聚糖微球恩諾沙星免疫親和吸附劑的性能評價方法

1、icELISA評價方法的建立：包被封閉后，先加入50μL系列濃度(0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100、1000、10000ng/mL)的標(biāo)準品溶液，每種濃度3個平行，再加入50μL最佳稀釋倍數(shù)的一抗，加入酶標(biāo)二抗，顯色封閉后用酶標(biāo)檢測儀測定各個濃度在450nm的吸光度A_i和對照(即濃度為0ng/mL時)的吸光度A₀，以A_i/A₀為縱坐標(biāo)，標(biāo)準溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)作圖。后經(jīng)Origin軟件擬合，得到標(biāo)準曲線的線性范圍為0.01～1000ng/mL。該方法標(biāo)準曲線圖見說明書附圖5。

2、HPLC評價方法的建立：HPLC的色譜條件：Shim-pack VP-ODS色譜柱(250×4.6mm)；流動相：V(乙腈):V(0.05mol/L磷酸溶液)＝19:81；UV檢測器檢測波長：λ＝280nm；柱溫：25℃；進樣量：20μL；流速：1.0mL/min。

取標(biāo)準工作液(1mg/mL)，配制成系列濃度(5、25、50、100、200、300ng/mL)，用HPLC測定，以各濃度和其對應(yīng)的峰面積進行線性擬合。該標(biāo)準曲線線性關(guān)系較好，其線性回歸方程為：y＝100.85x+990.66(R²＝0.9969)，線性范圍為5～300ng/mL。該方法標(biāo)準曲線圖見說明書附圖6。

綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。