本發(fā)明涉及，具體涉及一種雙相液液萃取與電泳分離集成微流控裝置及方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有的樣品分析測定、數(shù)據(jù)處理已有很多現(xiàn)代化的分析儀器可以處理完成，如氣相色譜、高效液相色譜、毛細管電泳技術(shù)等，這些技術(shù)自動化程度高，速度快。而樣品前處理多仍需手工參與，操作繁瑣，重現(xiàn)性差，且所需時間最長,約占整個分析時間的三分之二?，F(xiàn)有的微流控芯片萃取方法中，通常離線收集萃取所得物，再利用其它分離檢測方法進行分離檢測。該過程操作繁瑣，樣品萃取后由收集到檢測過程會造成部分樣品的損失，使最終檢測結(jié)果出現(xiàn)誤差，造成檢測結(jié)果的不準確。

微流控芯片是上世紀90年代起開始發(fā)展的一種新型分析技術(shù)，其目的是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。芯片電泳是微流控芯片最早期發(fā)展形勢，至今仍是微流控芯片分離方式的主體部分。將芯片液液萃取和芯片電泳分離檢測集成到同一塊芯片上的方法和應(yīng)用研究少見報道。

中國專利申請CN200610049115.5公開了一種液液萃取毛細管電泳聯(lián)用微流控分析芯片及其制備方法，芯片由上、中、下三層玻璃及夾在中下層玻璃之間的高聚物微孔膜所構(gòu)成。通過分步刻蝕、分步鍵合的加工工藝，把由中、下層玻璃和高聚物膜組成的“三明治”式支持液膜萃取反萃取單元，和由上、中玻璃組成的電泳分離單元構(gòu)建到該四層結(jié)構(gòu)的芯片之上。采用縱向的分流式接口，將處于不同層面上的分析單元耦聯(lián)成一個三維通道網(wǎng)絡(luò)，形成一個具有萃取反萃取試樣預(yù)處理功能的集成化毛細管電泳芯片。但該技術(shù)方案中的萃取部分以高聚物微孔膜為輔助結(jié)構(gòu)的三層玻璃，制作方法復(fù)雜，并且高聚物在有機溶劑中易于溶脹，該裝置不適用于水相和有機相之間的雙相萃取。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的旨在提供一種雙相液液萃取與電泳分離集成微流控裝置及方法，結(jié)構(gòu)簡單，所有通道在一塊玻璃片上刻蝕完成，制作方便，從萃取到電泳無需添加管道轉(zhuǎn)移，有利于提高檢測結(jié)果的精確度，實現(xiàn)在線樣品萃取、富集、分離與檢測的集成化分析功能。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種雙相液液萃取與電泳分離集成微流控裝置，包括玻璃片，該玻璃片上設(shè)置四個內(nèi)凹槽，該四個內(nèi)凹槽之間形成一四邊形的空間，該四邊形的空間內(nèi)設(shè)置有沿該四邊形空間的長度方向延伸的第一通道，刻蝕于玻璃片上的第一通道兩端分別經(jīng)四條第二通道就近連通四個內(nèi)凹槽，連通于第一通道一端的兩個內(nèi)凹槽分別設(shè)置為用于放置待萃取樣品的樣品槽和用于放置萃取溶劑的萃取溶劑槽，該樣品槽和萃取溶劑槽分別連接注射泵，連通于第一通道另一端的兩個內(nèi)凹槽分別設(shè)置為用于放置完成萃取樣品的廢液槽和用于收集萃取成品的集成槽，其中萃取溶劑槽與集成槽位于第一通道的同一側(cè)，連通萃取溶劑槽與第一通道、以及連通集成槽與第一通道的兩個第二通道內(nèi)表面均經(jīng)硅烷化處理，第一通道靠近萃取溶劑槽與集成槽的一側(cè)內(nèi)表面經(jīng)硅烷化處理，經(jīng)過硅烷化處理的兩個第二通道與第一通道一側(cè)內(nèi)表面具有憎水性；該玻璃片上還設(shè)置有作為電泳槽的第五個內(nèi)凹槽，集成槽經(jīng)第三通道連通該電泳槽，刻蝕于玻璃片上的第三通道兩側(cè)分別設(shè)置有第一分離槽和第二分離槽，該第一分離槽和第二分離槽之間經(jīng)刻蝕于玻璃片上的第四通道互相連通；

還包括用于施加電壓的電力機構(gòu)。

進一步地，對第一通道分別連通萃取溶劑槽與集成槽的兩個第二通道、與第一通道一側(cè)進行硅烷化處理的方法包括：各通道內(nèi)表面干燥與干凈，分別往電泳槽、第一分離槽和第二分離槽內(nèi)加入超純水，該超純水在毛細作用下充滿第三通道與第四通道；往樣品槽內(nèi)輸入有機溶劑、使該有機溶劑充滿第一通道與第二通道，往萃取溶劑槽內(nèi)輸入硅烷化試劑，所述有機溶劑與硅烷化試劑在第一通道中形成層流；保持層流狀態(tài)20分鐘后，停止輸入硅烷化試劑、繼續(xù)輸入有機溶劑，待有機溶劑將第一通道內(nèi)的硅烷化試劑排出后、停止輸入有機溶劑；對第一通道和第二通道進行沖洗。

優(yōu)選地，輸入有機溶劑的流速為5μL/min。

優(yōu)選地，該有機溶劑為正丁醇溶液，該硅烷化試劑為含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液，采用甲醇溶液對第一通道和第二通道進行沖洗。

進一步地，玻璃片的底面上還設(shè)置有加熱片，該加熱片位于集成槽的正下方。

優(yōu)選地，該加熱片的最高加熱溫度低于50℃。

進一步地，該玻璃片包括經(jīng)鍵合連接的玻璃底片和玻璃蓋片，該玻璃底片上設(shè)置有7個通孔，該玻璃蓋片作為玻璃片的底面，該7個通孔與玻璃蓋片形成玻璃片上的7個內(nèi)凹槽，該7個內(nèi)凹槽形成樣品槽、萃取溶劑槽、廢液槽、集成槽、電泳槽、第一分離槽和第二分離槽，該第一通道、第二通道、第三通道和第四通道刻蝕于玻璃底片上。

進一步地，四個內(nèi)凹槽之間形成一四邊形的空間，該四邊形空間為矩形空間。

進一步地，玻璃片長6.3cm，寬2.1cm。

一種雙相液液萃取與電泳分離集成微流控方法，包含以下步驟：

S1、通過注射泵分別往樣品槽內(nèi)注射待萃取樣品、和往萃取溶劑槽內(nèi)注射作為萃取劑的有機溶劑；

S2、樣品槽內(nèi)的待萃取樣品和萃取溶劑槽內(nèi)的萃取劑同時流經(jīng)第一通道、并在流經(jīng)第一通道的過程中完成萃取，待萃取樣品中的被分析物被萃取至萃取劑中；

S3、完成萃取的樣品經(jīng)第一通道和第二通道流至廢液槽中，攜帶著被分析物的萃取液經(jīng)第一通道和另一第二通道流至集成槽中；

S4、往經(jīng)第三通道連通集成槽的電泳槽和集成槽內(nèi)加入電泳緩沖液，往分別設(shè)置于第三通道兩側(cè)的第一分離槽和第二分離槽內(nèi)加入電泳緩沖液，對電泳槽和集成槽之間施加第一電壓，使被分析物從集成槽流向電泳槽；

S5、對經(jīng)第四通道互相連通的第一分離槽和第二分離槽之間施加第二電壓，使流至第三通道與第四通道相交處的被分析物在第四通道內(nèi)得到分離。

進一步地，S3中攜帶著被分析物的萃取液經(jīng)第一通道和另一第二通道流至集成槽中，對集成槽加熱使萃取液揮發(fā)。

進一步地，在步驟S1之前進行步驟S0，該步驟S0為對第一通道一側(cè)和連通第一通道與萃取溶劑槽和集成槽的第二通道進行硅烷化處理，處理方法包括：各通道內(nèi)表面干燥與干凈，分別往電泳槽、第一分離槽和第二分離槽內(nèi)加入超純水，該超純水在毛細作用下充滿第三通道與第四通道；往樣品槽內(nèi)輸入正丁醇溶液、使該正丁醇溶液充滿第一通道與第二通道，往萃取溶劑槽內(nèi)輸入含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液，該正丁醇溶液與含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液在第一通道中形成層流；保持層流狀態(tài)20分鐘后，停止輸入含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液、繼續(xù)輸入正丁醇溶液，待正丁醇溶液將第一通道內(nèi)含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液排出后、停止輸入正丁醇溶液；使用甲醇溶液對第一通道和第二通道進行沖洗。

本發(fā)明的有益效果在于：

1)四個內(nèi)凹槽和第一通道、第二通道形成雙Y型多通道層流萃取結(jié)構(gòu)，利用分子在芯片通道的短距離內(nèi)快速擴散的特征，相較于傳統(tǒng)的萃取技術(shù)具有更加快速、高效和不乳化的優(yōu)勢，有利于提高檢測效率和檢測質(zhì)量；

2)將液液萃取與電泳分離集成于玻璃片上，實現(xiàn)萃取與電泳分離無縫連接，解決了傳統(tǒng)方法從萃取到分離過程中容易產(chǎn)生誤差和損壞的問題，減小了檢測誤差，提高了檢測的精準度；

3)通過往實際樣品中加入內(nèi)標物，用內(nèi)標法對被分析物定量，重現(xiàn)性好，方法評價滿足要求，可用于藥品、食品等微量、痕量物質(zhì)的富集提取和檢測；

4)將本發(fā)明應(yīng)用于萃取PBS緩沖溶液中的血根堿，萃取率達74.2％，以Rh123做內(nèi)標物，對不同濃度血根堿進行方法學(xué)考察，線性范圍0.01mg/mL-0.1mg/mL，峰面積比的RSD值1.3％，一次萃取分離的檢測限為0.5ng/mL，靈敏度比未經(jīng)萃取的直接芯片電泳方法高4倍，并可通過多次萃取多次蒸發(fā)收集以實現(xiàn)樣品的富集濃縮進一步降低檢測限；應(yīng)用本發(fā)明對不同濃度血漿中血根堿進行萃取分離檢測，萃取率達41.7％，比傳統(tǒng)的萃取方法高37.68％，血樣用量僅需20μL，17min即可完成從萃取到分離檢測的整個過程，而傳統(tǒng)萃取離心以及液相色譜檢測的方法則至少需要血樣1ml、和3h的萃取分離檢測時間；

5)其中玻璃片由玻璃底片和玻璃蓋片鍵合而成，以玻璃蓋片作為底面，在玻璃底片上進行打孔和刻蝕通道，有利于簡化制作工藝，并且便于拆卸和清洗裝置；

6)制作簡單、分析速度快、樣品用量少、降低檢測限、可在線富集，易于實現(xiàn)，具備推廣使用的前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中實施例1提供的一種雙相液液萃取與電泳分離集成微流控裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明中實施例1提供的一種雙相液液萃取與電泳分離集成微流控裝置的俯視圖；

圖3是本發(fā)明中實施例2提供的一種雙相液液萃取與電泳分離集成微流控裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4是本發(fā)明中一種雙相液液萃取與電泳分離集成微流控方法的流程圖。

附圖標記：01、第一通道；02、第二通道；03、第三通道；04、第四通道；1、玻璃片；11、玻璃底片；110、通孔；12、玻璃蓋片；2、樣品槽；3、萃取溶劑槽；4、廢液槽；5、集成槽；6、電泳槽；7、第一分離槽；8、第二分離槽；9、注射泵；10、加熱片。

具體實施方式

下面，結(jié)合附圖以及具體實施方式，對本發(fā)明做進一步描述：

實施例1

如圖1及圖2所示，一種雙相液液萃取與電泳分離集成微流控裝置，包括玻璃片1，該玻璃片1上設(shè)置四個內(nèi)凹槽，該四個內(nèi)凹槽之間形成一矩形空間，該矩形空間內(nèi)設(shè)置有沿該矩形空間的長度方向延伸的第一通道01，刻蝕于玻璃片1上的第一通道01兩端分別經(jīng)四條第二通道02就近連通四個內(nèi)凹槽，連通于第一通道01一端的兩個內(nèi)凹槽分別設(shè)置為用于放置待萃取樣品的樣品槽2和用于放置萃取溶劑的萃取溶劑槽3，該樣品槽2和萃取溶劑槽3分別連接注射泵9，連通于第一通道01另一端的兩個內(nèi)凹槽分別設(shè)置為用于放置完成萃取樣品的廢液槽4和用于收集萃取成品的集成槽5，玻璃片1的底面上還設(shè)置有加熱片10，該加熱片10位于集成槽5的正下方，該加熱片的最高加熱溫度低于50℃，其中萃取溶劑槽3與集成槽5位于第一通道01的同一側(cè)，連通萃取溶劑槽3與第一通道01、以及連通集成槽5與第一通道01的兩個第二通道02內(nèi)表面均經(jīng)硅烷化處理，第一通道01靠近萃取溶劑槽3與集成槽5的一側(cè)內(nèi)表面經(jīng)硅烷化處理，經(jīng)過硅烷化處理的兩個第二通道02與第一通道01一側(cè)內(nèi)表面具有憎水性，經(jīng)過硅烷化處理的兩個第二通道02與第一通道01一側(cè)形成萃取通道，從而使親水的電泳緩沖溶液保留在電泳通道(第三通道03與第四通道04)中，憎水的萃取用有機溶劑保留在萃取通道部分，通道表面性質(zhì)穩(wěn)定以保證萃取的重現(xiàn)性以及電泳分離的重現(xiàn)性；該玻璃片1上還設(shè)置有作為電泳槽6的第五個內(nèi)凹槽，集成槽5經(jīng)第三通道03連通該電泳槽6，刻蝕于玻璃片1上的第三通道03兩側(cè)分別設(shè)置有第一分離槽7和第二分離槽8，該第一分離槽7和第二分離槽8之間經(jīng)刻蝕于玻璃片1上的第四通道04互相連通；玻璃片1長6.3cm，寬2.1cm，第一通道01長15mm，分別連通第一通道01與樣品槽2、萃取溶劑槽3的兩條第二通道02之間形成90度的夾角，分別連通第一通道01與廢液槽4、集成槽5的兩條第二通道02之間形成90度的夾角，樣品槽2、萃取溶劑槽3、廢液槽4和集成槽5與第一通道01之間的垂直距離均為100μm，第一分離槽7與第三通道03之間的垂直距離為45mm，第二分離槽8與第三通道03之間的垂直距離為5mm，集成槽5和電泳槽6與第四通道04之間的垂直距離均為50μm；還包括用于施加電壓的電力機構(gòu)(未圖示)。

其中，對第一通道分別連通萃取溶劑槽與集成槽的兩個第二通道、與第一通道一側(cè)進行硅烷化處理的方法包括：各通道內(nèi)表面干燥與干凈，分別往電泳槽、第一分離槽和第二分離槽內(nèi)加入超純水，該超純水在毛細作用下充滿第三通道與第四通道；以5μL/min的流速往樣品槽內(nèi)輸入正丁醇溶液、使該正丁醇溶液充滿第一通道與第二通道，往萃取溶劑槽內(nèi)輸入含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液，該正丁醇溶液與含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液在第一通道中形成層流；保持層流狀態(tài)20分鐘后，停止輸入含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液、繼續(xù)輸入正丁醇溶液，待正丁醇溶液將第一通道內(nèi)含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液排出后、停止輸入正丁醇溶液；使用甲醇溶液對第一通道和第二通道進行沖洗。

實施例2

如圖1、圖2及圖3所示，本實施例提供的雙相液液萃取與電泳分離集成微流控裝置基于實施例1中的雙相液液萃取與電泳分離集成微流控裝置，其中玻璃片1包括經(jīng)鍵合連接的玻璃底片11和玻璃蓋片12，該玻璃底片11上設(shè)置有7個通孔110，該玻璃蓋片12作為玻璃片1的底面，該7個通孔110與玻璃蓋片12形成玻璃片1上的7個內(nèi)凹槽，該7個內(nèi)凹槽形成樣品槽2、萃取溶劑槽3、廢液槽4、集成槽5、電泳槽6、第一分離槽7和第二分離槽8，第一通道01、第二通道02、第三通道03和第四通道04刻蝕于玻璃底片11上。

實施例3

如圖4所示，一種雙相液液萃取與電泳分離集成微流控方法，包含以下步驟：

S01、對萃取通道(第一通道一側(cè)和連通第一通道與萃取溶劑槽和集成槽的第二通道)進行硅烷化處理：各通道內(nèi)表面干燥與干凈，分別往電泳槽、第一分離槽和第二分離槽內(nèi)加入超純水，該超純水在毛細作用下充滿第三通道與第四通道；以5μL/min的流速往樣品槽內(nèi)輸入正丁醇溶液、使該正丁醇溶液充滿第一通道與第二通道，往萃取溶劑槽內(nèi)輸入含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液，該正丁醇溶液與含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液在第一通道中形成層流、對充滿含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液的第一通道一側(cè)進行硅烷化處理，也對第一通道分別連通萃取溶劑槽與集成槽的第二通道進行硅烷化處理；保持層流狀態(tài)20分鐘后，停止輸入含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液、繼續(xù)輸入正丁醇溶液，待正丁醇溶液將第一通道內(nèi)含25％二氯二甲基硅烷的正丁醇溶液排出后、停止輸入正丁醇溶液；使用甲醇溶液對第一通道和第二通道進行沖洗；

S02、往電泳槽、第一分離槽和第二分離槽中加入親水性電泳緩沖溶液，從集成槽抽取負壓，用親水性電泳緩沖溶液沖洗電泳通道(第三通道和第四通道)10min；再往電泳槽、第一分離槽和第二分離槽中加入超純水，電泳槽、第一分離槽和第二分離槽中，用超純水沖洗電泳通道(第三通道和第四通道)10min；沖洗完畢后，對集成槽進行干燥處理，往電泳槽、第一分離槽和第二分離槽中加適量超純水，使超純水充滿電泳通道(第三通道和第四通道)、但不進入集成槽及其它通道；

S1、通過注射泵分別往樣品槽內(nèi)注射待萃取樣品、和往萃取溶劑槽內(nèi)注射作為萃取劑的有機溶劑；

S2、樣品槽內(nèi)的待萃取樣品和萃取溶劑槽內(nèi)的萃取劑同時流經(jīng)第一通道、并在流經(jīng)第一通道的過程中完成萃取，待萃取樣品中的被分析物被萃取至萃取劑中；

S3、完成萃取的樣品經(jīng)第一通道和第二通道流至廢液槽中，攜帶著被分析物的萃取液經(jīng)第一通道和另一第二通道流至集成槽中，對集成槽加熱使萃取液揮發(fā)，其中加熱溫度低于50℃，若加熱溫度過高，集成槽內(nèi)溶液會流往其它通道，被分析成分將會流失；

S4、往經(jīng)第三通道連通集成槽的電泳槽和集成槽內(nèi)加入電泳緩沖液，往分別設(shè)置于第三通道兩側(cè)的第一分離槽和第二分離槽內(nèi)加入電泳緩沖液，對電泳槽和集成槽之間施加第一電壓，使被分析物從集成槽流向電泳槽；

S5、對經(jīng)第四通道互相連通的第一分離槽和第二分離槽之間施加第二電壓，使流至第三通道與第四通道相交處的被分析物在第四通道內(nèi)得到分離。

對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍之內(nèi)。