一種利用熱凝膠發(fā)酵液直接生產(chǎn)β-1,3-葡寡糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用熱凝膠發(fā)酵液直接生產(chǎn)β -1, 3-葡寡糖的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]β_1，3-葡寡糖是一類具有重要功能的生物活性物質(zhì)。其具有的生物功能為:(I)促進(jìn)腸道有益菌群的生長。(2)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)?？股氐膹V泛使用提高了病原菌對抗原的抵御能力，功能性β_1，3-葡寡糖能夠作為抗原的增強(qiáng)劑提高免疫原性。(3)抵抗腫瘤。β -1, 3-葡寡糖在增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性，對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性的同時，還能夠使其產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF-α )、白介素-1 (IL-1)和干擾素(IFN-a )等，從而抵抗腫瘤。(4)誘導(dǎo)植物抵御病害。β -1, 3-葡寡糖能夠激發(fā)一系列信號反應(yīng)，從而促進(jìn)防御蛋白和植物抗毒素的合成，從而抵御致病菌的入侵。目前報道的能夠響應(yīng)β-1，3-葡寡糖激發(fā)子并產(chǎn)生抗生素的植物有大豆、葡萄、水稻、小麥、煙草和擬南芥等。
[0003]目前β-1，3_匍寡糖的制備方法主要包括以下二種:直接提取法、人工合成法和多糖水解法。直接提取法包括水提法、有機(jī)溶劑萃取法和微波提取法等。通過不同的方法抽提后通常需要除去其中的蛋白質(zhì)和脂肪等大分子物質(zhì)，然后經(jīng)脫色、除鹽、濃縮和干燥等步驟得到寡糖粗品。人工合成法包括酶法合成、化學(xué)合成法和微波合成法。酶法合成過程中用于寡糖合成的酶主要有糖苷轉(zhuǎn)移酶、糖基水解酶和糖基合成酶等。豐富的原料來源是多糖水解法制備寡糖的最顯著優(yōu)勢。多糖水解法包括酸水解法和酶水解法。水解常用的酸試劑有HCl、TFA和H2SO4等。自然界中有多種微生物可以生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖內(nèi)切酶，主要分為以下兩類:細(xì)菌和真菌。細(xì)菌中以芽孢桿菌為主，主要有枯草芽孢桿菌{Bacillus
、地衣芽孢桿菌{Bacillus Iicheniformis)等；真菌中以霉菌為主，主要有康氏木霉{Trichoderma、里氏木霉{Trichoderma /"eesei)、綠色木霉{Trichoderma
viride)和哈茨木霉{Trichoderma harzianum)等。
[0004]β-1，3-葡聚糖是由β-1，3-糖苷鍵連接而成的帶有不同分支的多糖。多糖水解法采用的制備原料主要有海帶多糖、裂褶多糖、香菇多糖、茯苓多糖和熱凝膠等，除熱凝膠夕卜，其他多糖都帶有不同程度的β_1，6-糖苷鍵分支。與其他多糖相比，熱凝膠分子結(jié)構(gòu)相對簡單，不帶β -1，6-糖苷鍵分支，可通過微生物發(fā)酵法大量獲得，具有純度較高，價格低廉等特點(diǎn)。利用熱凝膠水解制備β-1，3-葡寡糖，可有效避免其他原料中雜質(zhì)的去除工藝步驟及其帶來的環(huán)境污染，大大降低寡糖生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用熱凝膠發(fā)酵液直接生產(chǎn)β -1, 3-葡寡糖的方法，以獲得β _1, 3-匍寡糖粗制品。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:先利用土壤桿菌ATCC 31749通風(fēng)發(fā)酵獲得熱凝膠發(fā)酵液(Applied B1chemistry and Microb1logy, 2014，50 (I): 35 - 42)，加入 lOmol/L 的 NaOH溶液，使熱凝膠發(fā)酵液的pH升至9~12，加熱升溫至40~55°C，攪拌混合30~50 min，使土壤桿菌死亡，再用12 mol/L的濃HCl調(diào)節(jié)pH至偏酸性(pH為5~7)。處理后的熱凝膠發(fā)酵液作為培養(yǎng)哈茨木霉的培養(yǎng)基組分之一，添加經(jīng)高溫滅菌(121°C，30min)處理后的濃縮氮源溶液，添加比例為基礎(chǔ)配方體積的10%~20% (V/V)，濃縮氮源溶液的組成為胰蛋白胨10%~20%(ff/V)，NaNO3 5%~10%(ff/V), pH 為 5~7，以純凈水配制。接種 Trichoderma harzianum RifaiACCC 30371 (食品工業(yè)科技，2014，35 (12): 157-161)進(jìn)行通風(fēng)發(fā)酵，接種體積為5%~15%(V/V)，通風(fēng)條件為0.5-1.0 vvm,變速調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速使溶氧值達(dá)到30%以上，發(fā)酵溫度為25~32°C，發(fā)酵時間為3~5d，獲得富含β-1，3-葡聚糖內(nèi)切酶的哈茨木霉發(fā)酵液。未經(jīng)滅活處理的新鮮熱凝膠發(fā)酵液再與該哈茨木霉發(fā)酵液按一定體積比(10~20:1，V/V)混合，利用β -1, 3-葡聚糖內(nèi)切酶進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為40~60°C，反應(yīng)pH為4.0-6.5，反應(yīng)2~3h后得到富含β -1, 3-葡寡糖的混合液，反應(yīng)結(jié)束后再加熱反應(yīng)液溫度至70~90°C，維持20~40min使酶失活。所得的混合物再經(jīng)離心或過濾分離操作，離心工藝為3000~8000 r/min, 10-20 min,收集上清液。固液分離過程也可以采用板框過濾工藝，濾布孔徑為200~400目，過濾壓力為0.2-0.8MPa，收集濾液。最后進(jìn)行濃縮和干燥，獲得β -1, 3-匍寡糖粗制品，濃縮和干燥溫度不超過110°C。
[0007]本發(fā)明的有益效果:目前利用β-1，3-葡聚糖生物水解法制備β-1，3_葡寡糖的生產(chǎn)工藝多采用純化后的β_1，3-葡聚糖。以商品化的粉末狀熱凝膠、海帶多糖、裂褶多糖、香菇多糖、茯苓多糖等為出發(fā)原料，重新溶解或水化后，再加入經(jīng)初步分離純化后的商品化β-1，3-葡聚糖內(nèi)切酶溶液，生產(chǎn)工藝更復(fù)雜，操作步驟多，底物轉(zhuǎn)化率較低，特別是以熱凝膠為底物時，由于熱凝膠是不溶于水的多糖，商品化的熱凝膠由于經(jīng)過了干燥處理，易形成不可逆的三螺旋結(jié)構(gòu)，不僅不溶于水，水化過程也很困難，在水解過程中熱凝膠顆粒具有雙層結(jié)構(gòu):即一部分熱凝膠分子以水化膠體形式包裹在致密的不溶性內(nèi)核外圍，其外圍部分易被水解，但其內(nèi)核部分則很難被水解，導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化率顯著下降(AppliedMicrob1logy and B1technology, 2013, 97: 8495 - 8503)。本發(fā)明工藝直接米用新鮮的熱凝膠發(fā)酵液，熱凝膠顆粒不會形成核殼型雙層結(jié)構(gòu)，底物可被徹底水解，底物轉(zhuǎn)化率高。與此同時，以熱凝膠發(fā)酵液為哈茨木霉通風(fēng)發(fā)酵的主要原料之一，熱凝膠既是哈茨木霉生長的碳源物質(zhì)，又是β-1，3-葡聚糖內(nèi)切酶生物合成的誘導(dǎo)劑，有利于高效合成β _1，3-匍聚糖內(nèi)切酶，最終有利于尚效制備β _1，3-匍寡糖。本發(fā)明方法直接利用熱凝月父發(fā)酵液作為酶水解底物和哈茨木霉發(fā)酵生產(chǎn)β -1, 3-葡聚糖內(nèi)切酶的碳源和誘導(dǎo)劑，顯著減少了 β -1, 3-葡寡糖制備的操作單元數(shù)，既提高了產(chǎn)品生產(chǎn)效率，又減少了生產(chǎn)過程中三廢排放和能耗，有益效果明顯。
【附圖說明】
[0008]圖1 β -1，3-葡寡糖粗制品生產(chǎn)工藝流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009]實(shí)施例1:熱凝膠發(fā)酵液熱堿滅活工藝?yán)猛寥罈U菌ATCC 31749通風(fēng)發(fā)酵獲得熱凝膠發(fā)酵液，發(fā)酵方法同參考文獻(xiàn)(Applied B1chemistry and Microb1logy, 2014，50 (I): 35 - 42)。種子培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖20，酵母粉10,KH2PO4 1.74,MgSO