在引入親和性和大小兩者的微流體芯片上的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明包括通過富集樣品中的稀有細(xì)胞或其他顆粒而對患者的病癥進行診斷、診療或預(yù)后的方法和裝置。所述裝置可以是包含障礙物陣列以及一種或多種結(jié)合部分的微流體裝置。所述裝置和方法可以允許根據(jù)大小和親和性富集細(xì)胞、在微流體裝置上的位置回收細(xì)胞或其他顆粒、從微流體裝置釋放細(xì)胞或其他顆粒、使樣品流過微流體裝置，以及使來自從患有病癥的患者獲得的樣品的稀有細(xì)胞或其他顆粒滯留。
【專利說明】在引入親和性和大小兩者的微流體芯片上的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)和微流體學(xué)領(lǐng)域。
[0002]相關(guān)串請的交叉引用
[0003]本申請要求與2011年I月7日提交的美國臨時申請61/430，897、于2011年I月7日提交的美國臨時申請61/430,891、于2011年I月7日提交的美國臨時申請61/430，930和于2011年I月6日提交的美國臨時申請61/430，509的權(quán)益，這些申請均通過引用并入本文。
【背景技術(shù)】
[0004]癌癥是一種以異常細(xì)胞的不受控增殖為特征的疾病。在正常組織中，細(xì)胞響應(yīng)于周圍細(xì)胞發(fā)出的信號而進行分裂和在組織中組織化。癌細(xì)胞不以同樣的方式響應(yīng)于這些信號，這導(dǎo)致它們增殖并在許多器官中形成腫瘤。隨著腫瘤繼續(xù)生長，遺傳改變會積聚，而顯現(xiàn)為一種更具侵略性的癌細(xì)胞生長表型。若不治療，繼而會發(fā)生轉(zhuǎn)移，即癌細(xì)胞通過淋巴系統(tǒng)或血流擴散到身體遠端區(qū)域。轉(zhuǎn)移導(dǎo)致在多個部位形成繼發(fā)性腫瘤，損傷健康組織。大多數(shù)癌癥死亡是由這樣的繼發(fā)性腫瘤引起的。
[0005]盡管在癌癥診斷和治療方面有數(shù)十年的進展，但許多癌癥只有發(fā)展到晚期才能被檢測出來。舉一個例子，大部分早期肺癌無癥狀，因而無法及時檢測出來進行治愈性治療，這導(dǎo)致肺癌患者的五年總存活率低于15%。然而，在那些肺癌在早期就檢測出來并進行治療的情況下，預(yù)后就更加有利。因此，需要開發(fā)用于在疾病發(fā)展的較早階段檢測癌癥的新方法。
[0006]援引并入
[0007]本說明書中所提到的所有出版物和專利申請都通過引用以同樣程度并入本文，猶如每個單獨的出版物或?qū)＠暾執(zhí)貏e地和單獨地被指出為通過引用而并入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]在本發(fā)明的一個方面，微流體裝置包含輸入端、輸出端以及設(shè)置于其間的并且進一步包含支撐柱的障礙物陣列。每個支撐柱可具有至少100微米的直徑和至少300微米的中心距。每個支撐柱可具有至少45微米或至少60微米的直徑和至少150微米或至少200微米的中心距。每個支撐柱可具有至少60微米的直徑，并且可與輸入端間隔小于1000微米。支撐柱可具有與陣列中的障礙物不同的樣式(pattern)。每個支撐柱可具有大于陣列中最大障礙物的直徑，或可具有至少100微米的直徑。支撐柱可以按照方形陣列樣式化。支撐柱彼此之間可間隔至少30微米或比所述陣列中所述障礙物之間的任意距離大至少約50%的距離。支撐柱距輸入端可小于200微米。
[0009]在另一方面，障礙物陣列可包含第一間隙和第二間隙。該第二間隙可以小于第一間隙，并且可按照重復(fù)樣式位于陣列中。第二間隙可在陣列中均勻分布。[0010]在本發(fā)明的一個方面，微流體裝置包含樣品輸入端、樣品輸出端以及位于其間的障礙物陣列，其中該陣列可具有多個區(qū)域。該多個區(qū)域可包含第一區(qū)域，該第一區(qū)域包含位于所述第一區(qū)域中的多個障礙物之間的第一間隙和第二間隙。第一間隙和第二間隙可以不同。該多個區(qū)域可包含第二區(qū)域，該第二區(qū)域具有均勻分布的、其間具有單一間隙的障礙物。位于第一區(qū)域下游的第二間隙可包含障礙物，其中每個障礙物的直徑可小于第一區(qū)域中每個障礙物的直徑。第二區(qū)域可位于第一區(qū)域的下游。該多個區(qū)域可進一步包含一個或多個位于第二區(qū)域下游的額外區(qū)域。該一個或多個額外區(qū)域可具有均勻分布的、其間具有單一間隙的障礙物，其中所述單一間隙可從第二區(qū)域到額外區(qū)域的每個下游陣列逐漸變小。位于第二區(qū)域下游的一個或多個額外區(qū)域中的每一個可包含具有某一直徑的障礙物，其中障礙物直徑可從第二區(qū)域到額外區(qū)域的每個下游陣列逐漸變小。第二間隙可以以對稱樣式、均一樣式、重復(fù)樣式或非均一樣式分布。
[0011]在本發(fā)明的一個方面，微流體裝置可包含輸入端、輸出端以及設(shè)置于其間的障礙物陣列，該陣列具有多個區(qū)域，第一區(qū)域包含位于該第一區(qū)域中多個障礙物之間的第一間隙和第二間隙，其中第一間隙和第二間隙可以不同，而第二區(qū)域包含位于該第二區(qū)域中多個障礙物之間的第一間隙和第二間隙，其中第一間隙和第二間隙可以不同，并且其中第一區(qū)域和第二區(qū)域中的第一間隙可以相同，且其中第二區(qū)域中的第二間隙可以小于第一區(qū)域中的第二間隙。第二區(qū)域可位于第一區(qū)域的下游。位于第一區(qū)域下游的第二區(qū)域可包含具有某一直徑的障礙物，其中每個障礙物的直徑小于第一區(qū)域中每個障礙物的直徑。微流體裝置可包含一個或多個位于第二區(qū)域下游的額外區(qū)域，其中該一個或多個額外區(qū)域中的每一個可包含位于多個障礙物之間的第一間隙和第二間隙，其中第一間隙和第二間隙可以不同，其中多個區(qū)域中的每一個中的第一間隙可以相同，且其中第二間隙可從第二區(qū)域到額外區(qū)域的每個下游陣列逐漸變小。障礙物可以以非隨機樣式，重復(fù)樣式或均一樣式排布。
[0012]在本發(fā)明的一個方面，微流體裝置包含輸入端、輸出端以及設(shè)置于其間的障礙物陣列，其中至少障礙物的子集可以成簇排布，其中每個簇可包含至少三個障礙物，其中簇中相鄰障礙物間的距離可以小于該簇與其相鄰簇之間的距離。所有或基本上所有障礙物可以成簇排布。
[0013]在另一方面，所考慮的任何微流體裝置上的障礙物可用一種或多種結(jié)合部分涂覆。結(jié)合部分可以是親和標(biāo)記的配體。所考慮的任何微流體裝置上的陣列可包含各種大小的障礙物。所考慮的任何微流體裝置的陣列可包含至少100、200或300個彼此相鄰的簇。簇內(nèi)障礙物間的最大距離可以比第一簇和與第一簇相鄰的第二簇之間的最小距離至少小三倍。所考慮的任何微流體裝置上的簇在沿著流動方向的第一方向上可比垂直于流動方向的第二方向上具有更長的尺寸。所考慮的任何微流體裝置上的簇可定位成使得第一簇位于第二簇的上游居中，其中第二簇的中心可偏離第一簇的中心。第一簇可位于第二簇的上游居中，其中第二簇的中心可以以與流動方向水平線呈約0°至90°或小于45°的角度偏離第一簇的中心。所考慮的任何微流體裝置上的簇內(nèi)障礙物間的距離可小于40、30、20或15微米。
[0014]在另一方面，所考慮的任何微流體裝置上的陣列可包括多個串聯(lián)區(qū)域或并聯(lián)區(qū)域，其中每個區(qū)域的簇可具有不同的特征。該特征可選自簇內(nèi)一個或多個障礙物之間的不同間距、簇之間的不同間距、連接角、簇之間的不同角度、同一個簇中障礙物之間的不同角度，或其組合。本文所述的任何裝置或陣列可進一步包含位于第一區(qū)域和第二區(qū)域之間的過渡區(qū)，其中該過渡區(qū)可包含不同大小的障礙物。陣列可包含超過4個或5個區(qū)域。
[0015]所考慮的任何微流體裝置上的輸入端可流體連接至一個或多個額外陣列。簇可以以非均一的、非隨機的或重復(fù)的樣式排布。簇可由三個障礙物組成，該障礙物具有第一和第二迎角，每一個迎角小于45°、介于約10° -90°之間、介于約20° -40°之間或介于約30° -40° 之間。
[0016]在另一方面，微流體裝置可包含樣品輸入端、樣品輸出端以及位于其間的障礙物陣列，該障礙物陣列具有位于所述障礙物的子集之間的第一間隙和位于所述障礙物的第二子集之間的第二間隙，其中第一間隙可大于所述第二間隙，且其中第二間隙可以以非均一、非隨機的樣式分布于整個陣列。第二間隙可以對稱或重復(fù)的樣式分布。第二間隙可分布成使得第二間隙的中心形成穿過流動方向的虛擬線。
[0017]在一個方面，微流體流通式裝置可包含輸入端、輸出端和障礙物陣列，其中該陣列可配置為當(dāng)樣品以約0.25mL/hr至約12.5mL/hr的速度流過裝置時,捕獲摻入血液樣品中的至少80%的表達捕獲實體例如EpCAM的細(xì)胞，該血液樣品不含表達捕獲實體例如EpCAM的細(xì)胞，體積為約1.5mL至約20mL。在一個方面，微流體裝置包含輸入端、輸出端和障礙物陣列，其中該陣列可配置為當(dāng)樣品以約0.25mL/hr至約12.5mL/hr的速率流過裝置時，捕獲摻入體積為約1.5mL至約20mL的、不含CTC的血液樣品中至少80%的CTC。在一個實施方案中，超過50%的被捕獲細(xì)胞可在所考慮的任何微流體裝置的陣列的上游半?yún)^(qū)中被捕獲。在一個實施方案中，可使用所考慮的任何微流體裝置基于大小而不是親和性捕獲超過10%的被捕獲細(xì)胞。
[0018]在本發(fā)明的一個方面，用于富集CTC的方法可包括使包含CTC的樣品流過本文所述的任何微流體裝置。
[0019]在另一方面,用于監(jiān)測癌癥復(fù)發(fā)的方法可包括計數(shù)(enumerating)或表征從多個在不同時間點取自患者的樣品中富集的CTC，計數(shù)或表征來自患者的CTC，以及利用該數(shù)據(jù)以至少80%的置信水平來確定患者癌癥復(fù)發(fā)的可能性。
[0020]在本發(fā)明的一個方面，用于監(jiān)測接受癌癥治療的患者的治療效果的方法可包括以下步驟:計數(shù)或表征從治療前取自患者的樣品以及至少一個治療后獲取的樣品中富集的CTC,以及利用該數(shù)據(jù)以至少80%的置信水平來確定治療是否可能有效。
[0021]在本發(fā)明的一個方面，用于篩查患者中的癌癥的方法可包括以下步驟:計數(shù)或表征從來自所述患者的樣品中富集的CTC，以及利用該數(shù)據(jù)來確定該患者是否罹患癌癥或是否應(yīng)該尋求進一步的檢測來確認(rèn)癌癥，其中該篩查的靈敏度為至少80%。
[0022]在本發(fā)明的另一方面，所述方法可進一步包括以下步驟:對捕獲的CTC進行分子分析，或?qū)Σ东@的CTC進行分類，以及利用該信息來確定患者癌癥復(fù)發(fā)的可能性，以至少80%的置信水平確定治療是否有效，或患者是否罹患癌癥或是否應(yīng)該尋求進一步的檢測來確認(rèn)癌癥，或其任意組合。
[0023]分子分析可包括測序、SNP檢測、基因表達分析、cDNA分析、mRNA分析、蛋白質(zhì)表達分析、修飾蛋白質(zhì)分析、翻譯后修飾蛋白質(zhì)分析、突變蛋白質(zhì)分析、蛋白質(zhì)修飾分析、miRNA譜分析、監(jiān)測酶活性(例如，從細(xì)胞裂解液中)、顯色原位雜交(CISH)分析或熒光原位雜交(FISH)分析。[0024]在一些實施方案中，分類可包括鑒定CTC亞群，其中可以根據(jù)所進行的分子分析的結(jié)果或被對于表I中標(biāo)記物特異性的結(jié)合部分所捕獲的能力來表征該亞群。
[0025]本文所述的方法可進一步包括比較在所述微流體流通式裝置的一個或多個區(qū)域中的每一個內(nèi)所捕獲的細(xì)胞，例如比較所捕獲細(xì)胞的數(shù)目，或比較所進行的分子分析的結(jié)
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[0026]本文所述的方法可進一步包括可至少為IOmL且可在少于20小時內(nèi)處理的樣品。在一些方面，樣品可以是至少7.5mL至約25mL且可以在少于20小時內(nèi)處理。
[0027]任何包含障礙物陣列的微流體裝置的表面可用一種或多種結(jié)合部分涂覆。結(jié)合部分可包含親和標(biāo)記的配體。結(jié)合部分可包含抗體。抗體可用碳水化合物例如葡聚糖或葡聚糖衍生物來功能化。在一個方面，本文所述的任何微流體裝置可包含用抗體涂覆的障礙物陣列，其中所述裝置的表面用葡聚糖或葡聚糖衍生物來功能化。在一個方面，本文所述的任何微流體裝置可包含用抗體涂覆的障礙物陣列，其中所述裝置的表面在至少10小時里具有小于15°的接觸角。親和標(biāo)記的配體或結(jié)合部分能捕獲上皮細(xì)胞、非上皮細(xì)胞、非上皮腫瘤細(xì)胞、經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞，或細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、核酸顆?；蚱湮⒘?，或其任意組合。
[0028]任何所述的微流體裝置可包含用兩種或多種不同聚合物功能化的表面，其中第一聚合物可以是碳水化合物而第二聚合物可以是聚乙二醇(PEG)?？刹捎脝我坏腜EG連接體(linker)長度，或可采用兩種或三種或更多種PEG連接體長度。碳水化合物可以是葡聚糖。碳水化合物的分子量可以是10K-70K。葡聚糖的濃度可以占表面的0.01%至5%或0.05%至2%(w/w)。PEG的分子量可以是1000-100000K。PEG的分子量可以是1000-20000K。PEG和碳水化合物的摩爾比可分別為1:10至10:1。表面可進一步包含結(jié)合部分。結(jié)合部分可包含抗生物素蛋白(avidin)、抗生物素蛋白衍生物、NeutrAvidin、鏈霉抗生物素蛋白(StreptAvidin), CaptAvidin、其他生物素結(jié)合蛋白質(zhì)、生物素、生物素衍生物或其他的抗生物素蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)。結(jié)合部分可共價地或非共價地與碳水化合物結(jié)合。結(jié)合部分可通過連接體與碳水化合物結(jié)合。連接體可包含生物素或生物素衍生物。連接體可包含官能團，例如酰亞胺或醇。連接體可包含生物素-PEG-NHS。連接體可包括核酸、氨基酸、生物素-PEG-馬來酰亞胺、生物素-PEG-COOH或生物素-PEG-SH。在一個方面，微流體裝置可包含由抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物涂覆的障礙物陣列。微流體裝置可進一步包含抗體的結(jié)合部分。微流體裝置可進一步包含DNA連接體。
[0029]任何微流體裝置可包含與一種或多種抗體偶合的塑性表面，其中抗體距塑性表面可以平均超過PEG3長度。本文所述的任何裝置的表面可以是塑料或環(huán)烯烴共聚物(COC)或環(huán)烯烴聚合物(C0P)。用于制造本文所述的任何裝置的器件(device)的方法可包括采用環(huán)烯烴共聚物(COC)材料或環(huán)烯烴聚合物(COP)材料來制造器件，其中COC或COP材料可用原還(blank)塑模。
[0030]微流體裝置可能能夠捕獲至少60%的摻入正常血液樣品中的CTC，其中該裝置用大量的抗體溶液功能化，例如20 μ g/mL的抗體溶液?？贵w溶液的體積可為約100 μ L至約 ImL,例如 100 μ L、150 μ L、200 μ L、250 μ L、300 μ L、350 μ L、400 μ L、450 μ L、500 μ L、550 μ L、600 μ L、650 μ L、700 μ L、750 μ L、800 μ L、850 μ L、900 μ L、950 μ L、或 lmL?？贵w溶液的濃度可為約 I μ g/mL 至約 100 μ g/mL,例如 I μ g/mL、2 μ g/mL、3 μ g/mL、4 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL、15 μ g/mL、20 μ g/mL、25 μ g/mL、30 μ g/mL、35 μ g/mL、40 μ g/mL、45 μ g/mL、50 μ g/mL、55 μ g/mL>60 μ g/mL、65 μ g/mL>70 μ g/mL>75 μ g/mL、80 μ g/mL、85 μ g/mL、90 μ g/mL、95 μ g/mL 或 100 μ g/mL。
[0031]用于捕獲和釋放感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片的方法可包括使包含感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片的樣品流過用碳水化合物和結(jié)合部分涂覆的表面，該結(jié)合部分能選擇性結(jié)合特異地存在于感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片上的細(xì)胞表面標(biāo)記物，并采用選擇性裂解碳水化合物的酶或競爭性釋放生物素偶聯(lián)物的生物素衍生物，或同時采用二者，從而使感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片從表面釋放。在一些實施方案中，選擇性裂解碳水化合物的酶可包括葡聚糖酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷水解酶、轉(zhuǎn)糖苷酶、磷酸化酶或裂合酶。在一些實施方案中，競爭性釋放生物素或脫硫生物素偶聯(lián)物的生物素或生物素衍生物可包括生物素、脫硫生物素或其他生物素偶聯(lián)物。用于捕獲和釋放感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片的方法可包括使包含感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片的樣品流過由DNA連接體和結(jié)合部分涂覆的表面，該結(jié)合部分能選擇性結(jié)合特異地存在于感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片上的細(xì)胞表面標(biāo)記物，并采用選擇性裂解(例如限制性內(nèi)切酶)或非特異性裂解(例如DNA酶)DNA連接體的核酸序列內(nèi)的核酸序列的酶，從而使感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片從表面釋放。用于捕獲和釋放感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片的方法可包括使包含感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片的樣品流過用抗體、肽或蛋白質(zhì)連接體以及結(jié)合部分涂覆的表面，該結(jié)合部分能選擇性結(jié)合特異地存在于感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片上的細(xì)胞表面標(biāo)記物，并采用競爭性地從抗體或其他結(jié)合部分釋放細(xì)胞或細(xì)胞碎片的蛋白質(zhì)或肽，或采用裂解肽或蛋白質(zhì)連接體的酶，例如諸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶等蛋白酶，從而使感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片從表面釋放。
[0032]親水性連接體可在水性環(huán)境中延伸，并可為固定的抗體提供最大的柔性/溶解度和活性?；赑EG和葡聚糖的交聯(lián)體均可使用。除了如PEG的高親水性，葡聚糖還具有獨特的性質(zhì)，因為它在對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA或RNA幾乎不造成損害至不造成損害的溫和條件下可被葡聚糖酶溶解。該性質(zhì)可用來從用于高級研究的芯片上釋放捕獲的稀有物質(zhì)，如CTC，和其他癌癥生物標(biāo)記物。
[0033]另一種選擇是親水性的、可光裂解的交聯(lián)體或僅僅是可光裂解的交聯(lián)體。這二者均可用于物質(zhì)從血液中的光誘導(dǎo)釋放。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1——示出了具有示例性排布的障礙物陣列的T7.2微流體裝置。
[0035]圖2——示出了具有示例性排布的障礙物陣列的T7.3微流體裝置。
[0036]圖3——示出了 C5.2微流體裝置，其具有多個含有示例性排布的障礙物陣列的區(qū)域。還示出了位于端區(qū)(end zone)和倉室(plenum)之間以及陣列之間的過渡區(qū)。
[0037]圖4——示出了 C5.3微流體裝置，其具有多個含有示例性排布的障礙物陣列的區(qū)域。
[0038]圖5——示出了 CSl.1微流體裝置，其具有示例性排布的、以三個障礙物為一簇的障礙物陣列。
[0039]圖6——示出了 C5.4微流體裝置，其具有示例性排布的、以三個障礙物為一簇的障礙物陣列。[0040]圖7——示出了 C5.4微流體裝置，其具有示例性排布的障礙物陣列以及包含支撐柱的倉室。示出了不同的柱子直徑以及支撐柱之間的距離。
[0041 ] 圖8——示出了血液樣品流過微流體裝置中的障礙物陣列的放大視圖，該障礙物陣列是以兩個障礙物為一簇(上圖)或三個障礙物為一簇(下圖)排布的，且在其間具有夾點。
[0042]圖9——示出了血液樣品流過微流體裝置中的障礙物陣列的放大視圖，其中障礙物陣列是以三個障礙物為一簇(上圖)或四個障礙物為一簇(下圖)排布的，且在其間具有夾點。從一列中的一個障礙物簇到相鄰一列中的障礙物簇的長度用A表示。從一列中的一個障礙物簇到同一列中的相鄰障礙物簇的長度用B表示。從一列中的一個障礙物簇到相鄰一列中的障礙物簇的寬度用C表示。障礙物簇中障礙物的直徑用D表示。
[0043]圖10—示出了血液樣品流過微流體裝置兩個區(qū)域中的障礙物陣列的放大視圖，該障礙物陣列是以三個障礙物為一簇排布的，在第一區(qū)域中的障礙物之間的夾點大于第二區(qū)域即下游區(qū)域中障礙物之間的夾點。
[0044]圖11——示出了并聯(lián)腔室設(shè)計中的微流體裝置，每個腔室具有多個區(qū)域，該區(qū)域具有四種不同的夾點大小，具有示例性排布的障礙物陣列。
[0045]圖12——示出了血液樣品通過微流體裝置的各種流動路徑的計算機模擬，該微流體裝置采用不同直徑的立柱(post)，具有以三個障礙物為一簇(上圖)或四個障礙物為一簇(下圖)的障礙物排布。
[0046]圖13—圖5—示出了血液樣品流過微流體裝置中的障礙物陣列的各種細(xì)胞遷移路徑的放大視圖。
[0047]圖14—示出了顯示微流體裝置內(nèi)捕獲的細(xì)胞上的作用力隨障礙物上細(xì)胞或顆粒相對于流動角度的角位置而變化的曲線圖。細(xì)胞上的作用力在細(xì)胞位于障礙物的一側(cè)時可能最大，當(dāng)細(xì)胞直接位于障礙物相對于流動角度的前方或后方時最小。
[0048]圖15—示出了顯示微流體裝置內(nèi)細(xì)胞上的最大剪應(yīng)力隨間隙大小而變化的曲線圖，還示出了顯示針對各種微流體裝置中具有各種流體動力學(xué)大小的細(xì)胞的最大剪應(yīng)力的表格。
[0049]圖16——示出了采用各種樣品體積和流速，因親和為主的捕獲、親和及大小混合的捕獲和大小為主的捕獲而導(dǎo)致的總捕獲百分比隨EpCAM (上圖)和IgG (下圖)芯片類型而變化的柱狀圖。
[0050]圖17——示出了兩張捕獲圖，其顯示由C5.4-抗-EpCAM和C5.4-抗-1gG微流體裝置所捕獲的細(xì)胞的空間定位。
[0051]圖18——示出了親和捕獲的曲線圖，其作為具有各種示例性障礙物排布的微流體裝置的每個區(qū)域中的總捕獲的百分比。
[0052]圖19——示出了采用各種流速的總捕獲的百分比隨芯片類型而變化的柱狀圖。
[0053]圖20—示出了使用各種流速，因親和為主的捕獲、親和及大小混合的捕獲和大小為主的捕獲導(dǎo)致的捕獲百分比隨芯片類型而變化的柱狀圖。
[0054]圖21—示出了使用各種流速，各種體積的血液樣品中細(xì)胞捕獲百分比隨抗-EpCAM和抗-1gG芯片類型而變化的柱狀圖。
[0055]圖22——示出了在C5.3或C5.4芯片上使用各種流速和樣品體積從多個血液樣品中捕獲的總捕獲平均百分比的柱狀圖。
[0056]圖23——示出了捕獲圖，其顯示采用各種孵育時間、樣品體積和流速，由C5.4-抗-EpCAM涂覆的微流體裝置所捕獲的細(xì)胞的空間定位。
[0057]圖24——示出了捕獲圖，其顯示由C5.3-抗-EpCAM微流體裝置所捕獲的、摻入到血液樣品中的、具有高、中和低EpCAM表達的細(xì)胞(H1650、PC3和MDA-MB-231)的空間定位及其平均捕獲百分比(回收百分比)。
[0058]圖25——示出了捕獲圖，其顯示由C5.4-抗-EpCAM微流體裝置所捕獲的、摻入到血液樣品中的、具有高、中和低EpCAM表達的細(xì)胞(H1650、PC3和MDA-MB-231)的空間定位及其平均捕獲百分比(回收百分比)。
[0059]圖26—示出了通道邊緣處的先前使用的陣列布圖，其可導(dǎo)致一些障礙物接近通道邊緣，這可導(dǎo)致可能撕裂的柔性工具(soft tool)。也示出了新的包含陣列的陣列布圖設(shè)計，其中所有離邊緣小于12微米的間隙都在通道邊緣處被去除并如圖所示排布。
[0060]圖27—示出了根據(jù)患者中檢測到的CTC的亞分類，隨時間推移的總存活率的Kaplan-Meier 曲線圖。
[0061]圖28——示出了用本發(fā)明的微流體裝置捕獲CTC和其他顆粒的總體方案(上圖)，以及用于微流體裝置中捕獲的細(xì)胞和顆粒的下游分析的表征策略(下圖)。
[0062]圖29——示出了用微流體裝置表面上涂覆的兩種上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)記物對摻入血液樣品中的Hs578t細(xì)胞的總捕獲百分比曲線。這證明其他結(jié)合部分可用于捕獲具有低EpCAM表達或無EpCAM表達的細(xì)胞。
[0063]圖30A和30B——示出了具有兩個(A，上圖)或四個(B，下圖)并聯(lián)腔室設(shè)計的微流體裝置，每個腔室包含多個具有多重特征的區(qū)域，每個區(qū)域具有各種不同排布的障礙物陣列，用以從同一樣品中捕獲細(xì)胞、顆?；蚱淙我饨M合。每個腔室顯示為含有不同捕獲部分，并用不同檢測部分染色。
[0064]圖31A和31B——示出了用本發(fā)明的微流體裝置捕獲CTC和其他顆粒的工作流程示例，以及用于微流體裝置中捕獲的細(xì)胞和顆粒的下游分析(A，上圖)和用于生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)(B，下圖)的表征策略。
[0065]圖32A和32B——示出了細(xì)胞捕獲后細(xì)胞在微流體裝置中生長的步驟示例(A，上圖)，以及在微流體裝置中捕獲細(xì)胞，隨后釋放被捕獲的細(xì)胞，隨后細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長的步驟示例(B,下圖)。
[0066]圖33—示出了可涂覆于所考慮的任何微流體裝置的一個或多個表面上的各種表面化學(xué)、結(jié)合部分和連接體的示例。
[0067]圖34——示出了在本發(fā)明的微流體裝置中使用以提高親和捕獲的表面化學(xué)方法的三個示例。
[0068]圖35——示出了比較采用用于親和捕獲的新表面化學(xué)方法、使用以不同濃度EpCAM抗體涂覆的微流體裝置的細(xì)胞捕獲百分比和性能的柱狀圖。
[0069]圖36——是捕獲圖，比較了采用直接共價連接或生物素-PEG-NHS交聯(lián)體，用抗-1gG和抗-EpCAM功能化的微流體裝置捕獲的血液樣品中的細(xì)胞的空間定位和平均捕獲百分比(回收百分比)。
[0070]圖37 不出了由微流體裝置所捕獲的各種細(xì)胞系中四種基因的相對mRNA表達的熱圖。
[0071]圖38——示出了可用于進一步表征所捕獲的細(xì)胞或顆粒的下游分析方法的示例。
[0072]圖39—示出了血液樣品通過C5.4微流體裝置的四個不同區(qū)域的各種流動路徑的計算機模擬，該裝置具有以三個障礙物為一簇的障礙物排布。
[0073]圖40——示出了血液樣品流過微流體裝置中的障礙物陣列的放大視圖的熱圖，顯示出流速和剪切力分布。
[0074]圖41——示出了包含示例性C5.4微流體裝置的各種參數(shù)的表格。
[0075]圖42——示出了 MPS化學(xué)結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0076]圖43A和43B——示出了柱狀圖，其評價采用兩種不同芯片設(shè)計對H1650和H29細(xì)胞系的總細(xì)胞捕獲百分比和芯片性能以及在EpCAM抗體和IgG涂覆的芯片上的捕獲百分比(A，上圖)，以及EpCAM抗體和IgG涂覆的芯片之間的捕獲百分比差異(B，下圖)。
[0077]圖44A和44B——示出了比較使用不同分子量的葡聚糖和PEG作為連接體對減少WBC計數(shù)的影響的柱狀圖(A，上圖)，以及顯示出用葡聚糖或用葡聚糖和PEG功能化的C5裝置捕獲的細(xì)胞的空間定位的捕獲圖(B，下圖)。
[0078]圖45-示出了通過堿性磷酸酶/PNPP試驗量化的、所加入的BSA對芯片表面上
固定的抗體量的影響的柱狀圖。
[0079]圖46A和46B——示出了 IgG對照芯片和EpCAM芯片在不同抗體濃度下的細(xì)胞捕獲率的柱狀圖(A，上圖)，以及當(dāng)NeutrAvidin共價連接于表面時這兩種芯片的捕獲率的差異的柱狀圖(B，下圖)。
[0080]圖47A和47B——示出了 IgG對照芯片和EpCAM芯片在不同抗體濃度下的細(xì)胞捕獲率的柱狀圖(A,上圖)，以及當(dāng)NeutrAvidin通過親水性交聯(lián)體連接于表面時這兩種芯片的捕獲率的差異的柱狀圖(B，下圖)。
[0081]圖48-示出了顯示出當(dāng)NeutrAvidin共價連接于表面時以及當(dāng)NeutrAvidin通
過親水性交聯(lián)體連接于表面時，C5IgG對照芯片和EpCAM芯片所捕獲的細(xì)胞的空間定位的捕獲圖。
[0082]圖49—示出了微流體裝置的陣列中各種可供選擇的障礙物排布(上圖)，和列出具有四個腔室、用于多參數(shù)處理樣品的微流體裝置的各種參數(shù)的表格。
[0083]圖50—示出了捕獲圖，顯示由具有所示障礙物陣列排布的IgG對照芯片和EpCAM芯片所捕獲的細(xì)胞的空間定位和總細(xì)胞百分比。
[0084]圖51——示出了在25μ L/min下，與原C5設(shè)計相比，采用C5.1和C5.2設(shè)計的總
捕獲百分比。
[0085]圖52——示出了捕獲圖，其顯示由IgG對照芯片和EpCAM芯片所捕獲的、摻入PBS或血液樣品中的細(xì)胞的空間定位和總細(xì)胞百分比。
[0086]圖53-示出了采用C5.1和C5.2設(shè)計，采用各種流速、表面化學(xué)和血液樣品類型
的總捕獲百分比。
[0087]圖54——示出了捕獲圖，其顯示采用C5.1和C5.2設(shè)計，采用各種流速和表面化學(xué)的細(xì)胞空間定位。
[0088]圖55—示出了在C5.2芯片設(shè)計上處理的回收的細(xì)胞數(shù)相對于摻入樣品中的細(xì)胞數(shù)的圖，這表明摻入樣品中的細(xì)胞的捕獲在0-790個摻入細(xì)胞的范圍內(nèi)呈線性。[0089]圖56——示出了在IgG或EpCAM抗體功能化的C5.2X5.3和C5.4設(shè)計芯片上以
4μ L/min或8 μ L/min的流速處理摻有已知數(shù)目CTC的樣品的總捕獲百分比圖。
[0090]圖57——示出了捕獲圖，其顯示在用IgG或EpCAM抗體功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片設(shè)計上以4 μ L/min或8 μ L/min的流速處理摻有已知數(shù)目CTC的樣品所得到的細(xì)胞的空間定位。
[0091]圖58——示出了采用7hr和4hr抗體孵育時間和各種流速，采用C5.3 (上圖)和C5.4 (下圖)芯片設(shè)計處理的各個區(qū)帶中的總細(xì)胞捕獲百分比圖。
[0092]圖59——示出了使用三種不同的血液樣品，在相同的抗體孵育時間下，在用EpCAM功能化的C5.2X5.3和C5.4芯片設(shè)計上以4 μ L/min,25 μ L/min和75 μ L/min的流速處理
3.75mL血液樣品得到的總細(xì)胞捕獲百分比圖。
[0093]圖60——示出了捕獲圖，其顯示在用EpCAM抗體功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片設(shè)計上以4 μ L/min的流速處理摻有已知數(shù)目CTC的3.75mL血液樣品所獲得的細(xì)胞的空間定位。
[0094]圖61——示出了捕獲圖，其顯示在用EpCAM抗體功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片設(shè)計上以25 μ L/min的流速處理摻有已知數(shù)目CTC的3.75mL血液樣品所獲得的細(xì)胞的空間定位。
[0095]圖62——示出了捕獲圖，其顯示在用EpCAM抗體功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片設(shè)計上以75 μ L/min的流速處理摻有已知數(shù)目CTC的3.75mL血液樣品所獲得的細(xì)胞的空間定位。
[0096]圖63-不出了在相同的抗體孵育時間下，米用4μ L/min>25 μ L/min和75μ L/
min的流速，在用EpCAM功能化的C5.2、C5.3和C5.4芯片設(shè)計上處理三個不同的3.75mL血液樣品而從血液中捕獲(非特異性捕獲)的白細(xì)胞的總數(shù)圖。
[0097]圖64——示出了在相同的處理條件下，使用相同數(shù)目的摻入細(xì)胞，在用EpCAM功能化的C5.2和C5.4芯片設(shè)計上以4 μ L/min或8 μ L/min的流速處理體積為3.75mL的4種不同血液樣品時，3種不同細(xì)胞系的總細(xì)胞捕獲百分比的圖。
[0098]圖65—示出了捕獲圖，其顯示在相同的處理條件下，使用相同數(shù)目的摻入細(xì)胞，在用EpCAM抗體功能化的C5.2芯片設(shè)計上以4 μ L/min的流速處理體積為3.75mL的血液樣品，或以8 μ L/min的流速處理體積為7.5mL的血液樣品時，3種不同細(xì)胞系的空間定位。
[0099]圖66—示出了捕獲圖，其顯示在相同的處理條件下，使用相同數(shù)目的摻入細(xì)胞，在用EpCAM抗體功能化的C5.4芯片設(shè)計上以4 μ L/min的流速處理體積為3.75mL的血液樣品，或以8 μ L/min的流速處理體積為7.5mL的血液樣品時，3種不同細(xì)胞系的空間定位。
[0100]圖67——示出了一個表格，其總結(jié)了采用C5.2、C5.3和C5.4芯片設(shè)計比較各種參數(shù)的試驗的一些重要結(jié)果。
[0101]定義
[0102]所謂“抗體”是指任何免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，S卩，含有能與抗原特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點的分子。能與本公開內(nèi)容中的多肽特異性結(jié)合的分子是能與多肽或其片段結(jié)合，但基本不與天然含有多肽的樣品如生物樣品中的其他分子結(jié)合的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實例包括可通過用諸如胃蛋白酶的酶處理抗體以及其他本領(lǐng)域中已知的技術(shù)生成的F(ab)和F(ab' )2片段。本公開內(nèi)容提供了能與本公開內(nèi)容中的多肽結(jié)合的多克隆抗體和單克隆抗體。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指一群抗體分子，它們只包含一種類型的能夠與本公開內(nèi)容中的多肽的特定表位發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點。
[0103]在長度、尺寸、面積或其它測量值的上下文中使用的“約”是指等于10%、5%、4%、3%、2%或甚至1%以內(nèi)。
[0104]所謂“生物樣品”是指生物來源的或含有或可能含有生物粒子的任何樣品。優(yōu)選的生物樣品為細(xì)胞樣品。
[0105]所謂“血液成分”是指全血的任何成分，包括宿主紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板或上皮細(xì)胞，特別是CTC。血液成分還包括血漿成分，例如，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和碳水化合物，以及例如由于當(dāng)前或過去的妊娠、器官移植、感染、損傷或疾病而可能存在于血液中的任何其他細(xì)胞。
[0106]所謂“細(xì)胞碎片或顆?！笔侵冈谒越橘|(zhì)中不溶的任何生物來源的物質(zhì)。其實例包括顆粒狀的細(xì)胞組分、病毒和包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、膜、核酸和碳水化合物的復(fù)合物。
[0107]所謂“細(xì)胞樣品”是指含有細(xì)胞或其組分的樣品。這類樣品包括天然存在的流體(例如，血液、汗液、淚液、耳流出物(ear flow)、痰、淋巴、骨髓懸浮液、尿液、唾液、精液、陰道流出物、腦脊髓液、宮頸灌洗液、腦液、腹水、乳汁、呼吸道、腸道或泌尿生殖道分泌物、羊水和水樣品)和其中已引入細(xì)胞的流體(例如，培養(yǎng)基和液化的組織樣品)。該術(shù)語還包括裂解液。
[0108]所謂“通道”是指流體可以流動通過的間隙。通道可以是毛細(xì)管、導(dǎo)管或位于疏水性表面上的、其中可限制水性流體的親水性樣式。
[0109]所謂“循環(huán)腫瘤細(xì)胞”(CTC)是指從原發(fā)腫瘤器官的所在位置擴散出來的、包含非正常形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和基因表達模式特征的任何稀有細(xì)胞。CTC可利用循環(huán)血液作為導(dǎo)管遷移到遠端位置或次級轉(zhuǎn)移部位，并可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性疾病。CTC可包括上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的細(xì)胞、經(jīng)歷間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)的細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞或其他稀有的細(xì)胞譜系。其他稀有的細(xì)胞譜系可包括循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞以及循環(huán)干細(xì)胞。
[0110]所謂細(xì)胞的“組分”是指采用本領(lǐng)域中已知的方法如裂解可以至少部分地從細(xì)胞中分離出來的細(xì)胞的任何組分。細(xì)胞組分可以是細(xì)胞器(例如細(xì)胞核、核周區(qū)室、核膜、線粒體、葉綠體或細(xì)胞膜)、聚合物或分子復(fù)合物(例如，脂質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)(膜蛋白、跨膜蛋白或細(xì)胞溶質(zhì)蛋白質(zhì))、核酸(天然核酸、治療性核酸或病原性核酸)、病毒顆?；蚝颂求w)、微粒(例如，各種細(xì)胞來源的顆粒)或其它分子(例如，激素、離子、輔因子或藥物)。
[0111]所謂細(xì)胞樣品的“組分”是指樣品中所含的細(xì)胞的子集，或其組分。
[0112]關(guān)于障礙物陣列的“密度”是指每單位面積上障礙物的數(shù)目，或者這些障礙物所占的體積的百分比。抑或通過將障礙物更緊密地放置在一起，抑或通過增大障礙物相對于障礙物之間間隙的大小，或通過二者的組合，可以增加陣列密度。抑或通過相距較遠地放置障礙物，抑或通過減小障礙物相對于障礙物之間間隙的大小，可以減小陣列密度。
[0113]所謂“富集的樣品”是指這樣一種含有組分的樣品:其可被處理以增加感興趣的組分相對于樣品中通常存在的其它組分的相對總數(shù)。例如，可通過將感興趣的細(xì)胞的相對總數(shù)增加至少 10%、25%、50%、75%、100%，或至少 I, 000、10，000、100，000、1，000，000 或甚至100，000, 000倍而富集樣品。[0114]所謂“間隙”是指流體或顆?？梢粤鲃油ㄟ^的開口。例如，間隙可以是毛細(xì)管，兩個障礙物間的、流體可以在其中流動的空隙，或在其它疏水性表面上的、其中可限制水性流體的親水性樣式。
[0115]所謂“流體動力學(xué)大小”是指顆粒在與流、障礙物或其他顆粒相互作用時的有效大小。它被用作流中的顆粒體積、形狀和可變形性的通用術(shù)語。
[0116]所謂“細(xì)胞內(nèi)激活”是指導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子激活的第二信使途徑的激活，或激酶或其他代謝途徑的激活。通過外部細(xì)胞膜抗原調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)激活還可導(dǎo)致受體運輸?shù)淖兓?br> [0117]所謂“標(biāo)記試劑”是指能與分析物結(jié)合、被內(nèi)化或以其他方式吸收、并通過例如形狀、形態(tài)、顏色、熒光、發(fā)光、磷光、吸光度、磁特性或放射性發(fā)射而被檢測的試劑。
[0118]所謂“微流體”是指具有至少一個小于Imm的維度。
[0119]關(guān)于表面的“微結(jié)構(gòu)”是指表面的顯微結(jié)構(gòu)，其包括一個或多個在至少一個維度上測量小于Imm的個體特性。示例性的微特征可以是微障礙物、微柱、微槽、微肋和微波紋。
[0120]所謂“障礙物”是指對通道中的流動的阻礙，例如，從一個表面上的突起或立柱。例如，障礙物可指在基板上突出的立柱或水性流體的疏水性屏障。障礙物可以是不可滲透的或部分滲透的。例如，障礙物可以是由多孔材料制成的立柱，其中的孔允許水性成分穿透，但其可能太小，而使被分離的顆粒無法進入。
[0121]發(fā)明詳沭
[0122]本發(fā)明特征性描述了用于檢測、富集和分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)和其它顆粒的裝置和方法。本發(fā)明還特征性描述了通過分析取自受試者的細(xì)胞樣品來診斷受試者的病癥例如癌癥的方法。本發(fā)明的設(shè)備可包括障礙物陣列，該陣列允許發(fā)生CTC、其他稀有細(xì)胞、細(xì)胞衍生物、細(xì)胞組分、生物實體或其它流體組分的移位。該新設(shè)計的一些目的包括通過消除經(jīng)?？赡芊e存氣泡的倉室角落以改進裝置的預(yù)處理(priming),對膠帶增加支撐物以防止其在組裝和加工過程中塌陷到倉室中，對最小的柱子增加壓印支撐物，通過結(jié)合目前設(shè)計中最有效的捕獲區(qū)帶以利用更多的捕獲面積，探索對一系列細(xì)胞類型的捕獲效率(特異性的和非特異性的)與間隙大小、夾點相對于流動的角度以及夾點密度之間的關(guān)系，構(gòu)建并聯(lián)捕獲室?guī)缀谓Y(jié)構(gòu)以開始測試多腔室設(shè)計的預(yù)處理和操作，在降低通過陣列的細(xì)胞上的剪切力的同時仍保持C5設(shè)計的高捕獲效率，降低對被捕獲細(xì)胞的拖曳力以促進更多的親和捕獲，在相關(guān)的大小范圍內(nèi)提供捕獲冗余度，以及依賴計算機模擬在流的可視化/模擬結(jié)果的基礎(chǔ)上優(yōu)化陣列幾何結(jié)構(gòu)。
[0123]盡管之前的C5和C5.1設(shè)計可具有高捕獲效率，但捕獲位置可能出現(xiàn)在陣列的最后區(qū)域。此外，這些設(shè)計對于壓印制造來說可能是一個挑戰(zhàn)，可能容易受損，芯片的特征大小可能不適合注射成型，并且可能顯現(xiàn)出對細(xì)胞的高剪切力和對被捕獲細(xì)胞的高作用力(圖14和圖15)。盡管適合于以計數(shù)為基礎(chǔ)的比較研究，但是為了親和捕獲和表征，以及穩(wěn)定的長期制造，設(shè)計了新的障礙物和間隙的幾何結(jié)構(gòu)。新間隙幾何結(jié)構(gòu)的一些優(yōu)勢包括對細(xì)胞的剪切力和拖曳力的降低(圖40)、對于捕獲機制的更大親和組分(更容易清楚區(qū)分EpCAM-和EpCAM+細(xì)胞)、可降低細(xì)胞上的作用力從而使加工能在更高的流速下進行的基準(zhǔn)間隙(base gap)區(qū)域，以及導(dǎo)致更加穩(wěn)定的制造并且可能更適合于注射成型的更大的基礎(chǔ)間隙和更大的障礙物。
[0124]微流體方法可能是為了診斷目的而探詢(interrogate)生物流體成分的有效手段，這恰恰是因為他們可用于精確測量和分析其他分析過程，如藥物篩選、核酸擴增和酶反應(yīng)。對于CTC分析的特定微流體挑戰(zhàn)在于，為了獲得關(guān)于循環(huán)中稀有細(xì)胞的關(guān)鍵信息，必須評價相對大的樣品體積。因此，芯片設(shè)計的小尺寸特征和復(fù)雜的流體動力學(xué)可能會干擾特定稀有細(xì)胞的有效、大規(guī)模捕獲，除非其格式和微流體可以被設(shè)計成能滿足特定要求。來自癌癥的細(xì)胞可按照其任意分子特征而區(qū)分開來；但絕對地確定CTC可能是一個具有挑戰(zhàn)性的難題。一個主要的困難在于CTC的屬性是多樣性的，因此基于細(xì)胞的特征的選擇已提供了翔實的信息。
[0125]此外，盡管循環(huán)細(xì)胞、微粒、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)和核酸具有巨大的診斷潛能，但是要從生物流體中有效地捕獲這些物質(zhì)可能還是一個挑戰(zhàn)。諸如血液的生物流體通常含有大量與診斷目的可能無關(guān)的正常細(xì)胞和物質(zhì)。而且，這些物質(zhì)的存在可能會提出由于低信噪比而出現(xiàn)這樣的診斷困難的可能性。因此，需要有效地富集方法以允許非常高效地捕獲有用的疾病相關(guān)物質(zhì)，但最小化對其他無關(guān)生物物質(zhì)的捕獲。本公開內(nèi)容特征性描述了用于處理細(xì)胞樣品的、具有獨特格式和結(jié)構(gòu)的裝置。
[0126]采用本文所述的裝置和方法對一種或多種稀有細(xì)胞如CTC進行計數(shù)和表征可能在評估癌癥診斷、診療和預(yù)后中是有用的，包括，例如，癌癥早期檢測和治療失敗的早期檢測。采用本文所述的裝置和方法對一種或多種稀有細(xì)胞進行計數(shù)和表征還可能對在患者中選擇并監(jiān)測治療是有用的。
[0127]除了循環(huán)細(xì)胞、微粒、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)和核酸的富集，被捕獲物質(zhì)的表征可能對獲得診斷信息是有用的。而且，為了得到可靠的診斷信息，可能需要在具有各種特征的循環(huán)細(xì)胞、微粒、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、核酸或其任意組合之間進行定量比較。這通過采用有限量的、可常規(guī)取自患者的生物樣品可能很難實現(xiàn)。本發(fā)明的方法和裝置可以用于解決這些困難。
[0128]盡管稀有細(xì)胞如CTC或上皮細(xì)胞的檢測、富集和分析是本申請的優(yōu)選實施方案，但是本發(fā)明的裝置和方法可用于處理眾多的其他細(xì)胞、碎片、分析物和顆粒。這些細(xì)胞和顆?？梢允前┘?xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、上皮細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CEC)、循環(huán)干細(xì)胞(CSC)、干細(xì)胞、未分化的干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、祖細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、循環(huán)上皮細(xì)胞、循環(huán)子宮內(nèi)膜細(xì)胞、營養(yǎng)細(xì)胞、免疫系統(tǒng)細(xì)胞(宿主或移植物)、結(jié)締組織細(xì)胞、細(xì)菌、真菌、病原體(例如細(xì)菌或原生動物)、微粒、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、核酸(即DNA或RNA)、膜、細(xì)胞器、脂質(zhì)體、核小體、外來體、其他細(xì)胞組分(例如線粒體和細(xì)胞核)和病毒。
[0129]各種來源的循環(huán)細(xì)胞可在患有各種疾病的患者的血流中檢測到。例如，CTC和CSC可在癌癥患者的外周血中識別出來。CEC和內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)數(shù)目增多可見于，例如患有癌癥、心血管病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE )、糖尿病和其他各種與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的疾病的患者的血液中。
[0130]原發(fā)性腫瘤包含可由腫瘤細(xì)胞、支撐基質(zhì)和內(nèi)皮的正常組織以及炎癥細(xì)胞組成的異質(zhì)細(xì)胞群。所有這些都可導(dǎo)致大小的快速擴張、血管化能力、遺傳不穩(wěn)定性、營養(yǎng)物剝奪、常氧和缺氧、程序重排、壞死、脫落或其任意組合。因此，腫瘤的動態(tài)且異質(zhì)的特征可形成令人生畏的一系列進入血液的生物分子、顆粒、細(xì)胞和細(xì)胞聚集體。許多由腫瘤釋放的成分本身可能并不能形成轉(zhuǎn)移的定殖細(xì)胞。盡管如此，這些物質(zhì)可以提供腫瘤進展的相關(guān)指征，也可以是生物標(biāo)記物和疾病癥態(tài)和反應(yīng)的其他指示物的來源。例如，腫瘤來源的微泡可以很容易地從癌癥患者的血流中純化得到，而沒有任何細(xì)胞污染。這些微泡可以由腫瘤(細(xì)胞)不斷脫落至循環(huán)中，而水平相當(dāng)?shù)姆悄[瘤來源的微泡產(chǎn)生可能極其少見。
[0131]本發(fā)明的裝置和方法被設(shè)計成能夠考察亞細(xì)胞組分、生物分子、顆粒、細(xì)胞和細(xì)胞聚集體，例如游離的或復(fù)合的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、RNA, DNA、微粒或諸如核小體和外來體的亞細(xì)胞顆粒。雖然其他技術(shù)可以選擇性地只探詢從腫瘤釋放的部分物質(zhì)，但并不能允許對腫瘤細(xì)胞進行組合分離和分析以及對這些細(xì)胞的組分進行后續(xù)分析，而具有本文所述用途的微流體裝置和方法可以提供靈活的平臺，具有將CTC捕獲與多種分子分析結(jié)合在一起的優(yōu)點。
[0132]人血液中的微粒(MP)可以來源于血小板，也可以是從白細(xì)胞、紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞中釋放出來。作為一個非限制性的實例，內(nèi)皮微?？梢允强蓮膬?nèi)皮細(xì)胞釋放的、并可發(fā)現(xiàn)在血液中循環(huán)的小囊泡。該微粒包含圍繞少量細(xì)胞溶質(zhì)的質(zhì)膜。該內(nèi)皮微粒的膜包含受體和其他細(xì)胞表面分子，該受體和分子能使微粒的內(nèi)皮起源得到識別，并使其區(qū)別于來自其他細(xì)胞如血小板的微粒。它們可以是諸如癌癥進展、炎癥、凝血和血管內(nèi)平衡等細(xì)胞過程的重要介質(zhì)。此外，MP還可攜帶各種核酸種類作為負(fù)載，并可在正常個體的血液中少量檢測到。幾乎所有在靜脈和動脈床中發(fā)生的血栓性疾病都記錄了血小板源性MP(PDMP)、內(nèi)皮細(xì)胞源性MP (EDMP)和單核細(xì)胞源性MP (MDMP)濃度的升高。在癌癥患者中，MP允許“非遺傳的”細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，該轉(zhuǎn)移為性狀在癌細(xì)胞之間的細(xì)胞獲得和傳播提供了途徑，如多藥耐藥性(MDR)。
[0133]微粒(例如循環(huán)內(nèi)皮微粒)數(shù)目的增加已在患有某些疾病(即高血壓、心血管疾病、先兆子癇和各種形式的血管炎)的個體中得到鑒定。該內(nèi)皮微粒在一些疾病癥態(tài)中顯示出具有一系列細(xì)胞表面分子，指示內(nèi)皮功能障礙的狀態(tài)。因此，內(nèi)皮微?？捎米骷膊≈袃?nèi)皮的生物狀態(tài)的指標(biāo)或指數(shù)，并可能在某些疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。
[0134]本文所述的任何稀有細(xì)胞、顆?；蚱淙我饨M合可從來自患者的樣品中獲得。稀有細(xì)胞可以是最多可占樣品中所有細(xì)胞的0.5%、1%、5%或10%的細(xì)胞。樣品可以是取自患者的任何細(xì)胞樣品，優(yōu)選流體樣品。
[0135]體液可以是血液(如外周血)、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊髓液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聹、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(Cowper’ sfluid)、射精前液、女性噴射液(female ejaculate)、汗液、糞便物、毛發(fā)、淚液、囊腫液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、膽汁、間隙液、月經(jīng)血、膿液、皮脂、陰道流出物或分泌物、粘膜分泌物、大便水、胰液、鼻竇腔灌洗液、支氣管肺吸出物、囊胚腔流體、骨髓懸浮液、腦脊髓液、腦液、腹水、乳汁、呼吸道、腸道或泌尿生殖道分泌物、羊水、水樣或臍帶血。生物樣品還可以是囊胚腔或臍帶血。生物樣品還可以是組織樣品或活檢樣品。典型的樣品是血液樣品。來自患者的流體樣品或已經(jīng)溶解的樣品可以是至少約1、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、
10、20、50、75、100、200、500、1000 或 1500mL 或大于 5,7.5、10、50、75、100、500 或 750mL。本發(fā)明的示例性裝置和方法在下文詳細(xì)描述。
[0136]芯片設(shè)計
[0137]本發(fā)明的微流體裝置獨特地設(shè)計成有助于在復(fù)雜過程中通過微流體與表面的相互作用而對細(xì)胞或顆粒的捕獲。捕獲的主要因素可包括親和性相關(guān)(例如，通過腫瘤抗原識別)、細(xì)胞或顆粒的大小以及細(xì)胞或顆粒的特定粘附性質(zhì)。此外，對于被排除而言至關(guān)重要的細(xì)胞或顆粒的已知性質(zhì)可能是重要的。
[0138]本文所描述的微流體裝置的設(shè)計和已實現(xiàn)的特征可針對于CTC、顆粒和非腫瘤血細(xì)胞的已知性質(zhì)。這些特征可包括循環(huán)癌細(xì)胞的不同大小、腫瘤表面抗原的不同表達水平和粘附性質(zhì)的可變性。高表面:體積比的發(fā)展可能是微流體捕獲的一個重要技術(shù)原理。本發(fā)明的微流體裝置和捕獲技術(shù)可以由雙重捕獲機制(親和性和大小)組成。在一些方面，本發(fā)明的微流體裝置和捕獲技術(shù)可包含單一捕獲機制，其中捕獲機制可以是親和性或大小。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)化學(xué)可將抗體固定于塑性表面上，使經(jīng)典的親和捕獲能夠進行。具有遞減的間隙間距的立柱梯度樣式(C5設(shè)計)能夠捕獲腫瘤細(xì)胞，同時允許較小的紅細(xì)胞和白細(xì)胞通過。通過兩種機制對CTC的富集具有提高捕獲效率的潛力，從而提供更廣泛的一系列癌細(xì)胞用于隨后的分析和表征。
[0139]以前及本文所述的微流體裝置在中空腔室中包含立柱區(qū)域，微流體流使得含有細(xì)胞和微粒的樣品通過其中以進行捕獲。之前這些裝置的設(shè)計引入交錯分布的立柱以最大化細(xì)胞和表面間的接觸。這種捕獲表面通過構(gòu)建在整個芯片表面以線性模式排布的圓柱體或微柱(直徑100 μ m，高度100 μ m)而建立。這些之前的裝置由深蝕刻的硅表面組成，該表面又由位于該裝置捕獲區(qū)中的78000個立柱的陣列構(gòu)成。后來曾經(jīng)使用塑料，提高了可靠性，并為表面化學(xué)提供了更多的多樣性。
[0140]本發(fā)明的裝置含有可根據(jù)所形成的原型進行調(diào)節(jié)的立柱尺寸。對立柱分布的描述中，一些最重要的特征可包括但不限于立柱數(shù)目、立柱直徑、相同或不同大小的立柱之間的間隙大小、立柱的排布，以及該裝置的入口和出口之間整個微流體立柱區(qū)域中相同或不同大小的立柱的區(qū)帶。這些屬性已經(jīng)被工程設(shè)計到不同的裝置設(shè)計中，并且在本文中描述。
[0141]本文所述的微流體裝置提供了幾項系統(tǒng)優(yōu)勢，因為該技術(shù)可針對于在不同癌癥或其他疾病或病癥中的應(yīng)用。當(dāng)流過塑料芯片并且通過立柱的迷宮、排列或陣列時，剪切力可被最小化(圖40)，以便減小對細(xì)胞的任何進一步損害，或防止細(xì)胞從它們與諸如抗體的表面結(jié)合部分的相互作用中脫離出來。在其流過芯片表面時，血液中以數(shù)十億比一的比例在數(shù)目上超過CTC的正常細(xì)胞組分也可對被捕獲的CTC施加巨大的物理力。障礙物陣列可排布成能保持之前設(shè)計的高捕獲效率，并且進一步降低對通過陣列的細(xì)胞的剪切力(圖15)，降低對被捕獲的細(xì)胞的拖曳力(圖14)，并提高捕獲橫截面以促進更強的親和捕獲(圖13)。障礙物陣列可排布成能促進均一流體流過整個通道，并使細(xì)胞暴露于障礙物，以根據(jù)捕獲發(fā)生的區(qū)域進行親和捕獲和大小捕獲。而且，這些設(shè)計可允許保持高流速而不發(fā)生總捕獲效率的顯著降低(圖19、圖20和圖21)。此外，微流體裝置的表面可在比之前所用的方法更短的時間內(nèi)用結(jié)合部分進行功能化(圖22和圖23)。另外，這些設(shè)計可在相關(guān)的大小范圍內(nèi)提供細(xì)胞捕獲的冗余度，這可以提供關(guān)于細(xì)胞是通過何種方式被捕獲的信息，例如通過大小或親和性(圖16和圖17和圖18和圖20)。
[0142]本發(fā)明的裝置可用于產(chǎn)生富含具有期望的流體動力學(xué)大小的細(xì)胞或顆粒的樣品。此種富集的應(yīng)用包括濃縮CTC或其他感興趣的細(xì)胞，和大小分級分離，例如大小過濾(選擇特定大小范圍內(nèi)的細(xì)胞)。裝置還可用于富集細(xì)胞或顆粒的組分，例如，細(xì)胞核和本文所述的其他構(gòu)成性碎片化細(xì)胞組分。理想地，本發(fā)明的方法可保留與初始混合物相比至少約50%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的期望顆粒，同時相對于一種或多種非期望的顆粒而言可能富集期望的顆粒至少約 100,1, 000,10, 000,100, 000,1, 000，000,10, 000，000 或甚至 100，000，000
倍。理想地，若裝置除富集的樣品以外還產(chǎn)生任何輸出樣品，則此額外的輸出樣品可包含與初始混合物相比少于約 50%、25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的期望顆粒，或甚至不包含期望顆粒。富集還可導(dǎo)致富集的顆粒與原始樣品相比的稀釋，盡管富集顆粒的濃度相對于樣品中的其他顆粒而言可能已經(jīng)增力口。優(yōu)選地，稀釋可以最多約為90%，例如，最多約為75%、50%、33%、25%、10%或1%。
[0143]本文所述的微流體裝置可以結(jié)合諸如通過固定的結(jié)合部分(例如抗-EpCAM抗體)的親和捕獲和諸如通過具有各種間隙大小的立柱梯度系統(tǒng)的大小捕獲兩者。由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，這種雙重捕獲機制可能很有價值。此外，許多細(xì)胞或顆粒特異性的靶向部分的表達水平可能顯著變化，例如，通過采用本文所述的裝置的方法所捕獲的腫瘤細(xì)胞在其表面上的EpCAM表達。例如，一些CTC可表達高水平的EpCAM，而其他CTC可表達低水平的或無法檢測的水平的EpCAM。本發(fā)明的設(shè)計可允許對這些細(xì)胞和顆粒，甚至對具有靶向部分低表達的細(xì)胞和顆粒進行有效總捕獲和親和性介導(dǎo)的捕獲(圖24和圖25)。這些設(shè)計不僅可以促進親和捕獲，而且允許對捕獲的細(xì)胞和顆粒進行表征，并允許更加穩(wěn)定的長期制造。
[0144]現(xiàn)已知不是所有的CTC都表達EpCAM (EpCAM-),因此不能采用涂覆在微流體裝置表面上的EpCAM結(jié)合部分根據(jù)親和性進行捕獲。EpCAM-細(xì)胞及EpCAM+細(xì)胞都可在本發(fā)明的裝置中被捕獲，因為這些裝置可以基于大小和親和性來捕獲細(xì)胞。因此，單獨的基于親和性的捕獲可以選擇CTC的高表達亞群。此外，腫瘤細(xì)胞還在大小上有所不同，小的細(xì)胞能夠通過捕捉大于特定直徑的細(xì)胞的過濾器。采用雙重機制可以允許捕獲任一單獨機制可能漏過的細(xì)胞。捕獲更多的細(xì)胞可以允許對這些細(xì)胞進行更多、更全面的表征。
[0145]本文所述的任何微流體裝置可包含輸入端、輸出端和障礙物陣列，其中該陣列可以配置為在使摻雜樣品以一定的流速流過本發(fā)明的任何裝置時，捕獲至少約80%的表達特定靶向部分的細(xì)胞或顆粒，這些細(xì)胞或顆粒已經(jīng)摻入一定體積(例如7.5mL)的不含表達該靶向部分的細(xì)胞或顆粒的血液樣品中。例如，該陣列可以配置為在使摻雜樣品以0.25mL/hr或更高的流速流過本發(fā)明的任何裝置時，捕獲至少約80%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的表達特定靶向部分的細(xì)胞或顆粒，這些細(xì)胞或顆粒已摻入一定體積(例如7.5mL)的不含表達該靶向部分(如EpCAM)的細(xì)胞或顆粒的血液樣品中。該靶向部分可以是表I中的任何靶向部分或任何可與期望捕獲的細(xì)胞或顆粒特異性結(jié)合的部分，例如EpCAM。樣品通過本文所述的任何微流體裝置的流速可以是至少約0.01ml/hr或至少約0.25ml/hr,例如0.01mL/hr、0.02mL/hr、
0.03mL/hr、0.04mL/hr、0.05mL/hr、0.06mL/hr、0.07mL/hr、0.08mL/hr、0.09mL/hr、0.1mL/hr、0.15mL/hr、0.2mL/hr、0.3mL/hr、0.4mL/hr、0.5mL/hr、0.6mL/hr、0.7mL/hr、0.8mL/hr、
0.9mL/hr、lmL/hr、1.lmL/hr>1.2mL/hr>1.3mL/hr>1.4mL/hr>1.5mL/hr>1.6mL/hr>1.7mL/hr、1.8mL/hr>1.9mL/hr、2mL/hr、2.lmL/hr、2.2mL/hr、2.3mL/hr、2.4mL/hr、2.5mL/hr、
2.6mL/hr、2.7mL/hr、2.8mL/hr、2.9mL/hr、3mL/hr、3.lmL/hr、3.2mL/hr、3.3mL/hr、3.4mL/hr> 3.5mL/hr、3.6mL/hr、3.7mL/hr、3.8mL/hr、3.9mL/hr、4mL/hr、4.lmL/hr、4.2mL/hr、
4.3mL/hr、4.4mL/hr、4.5mL/hr、4.6mL/hr、4.7mL/hr、4.8mL/hr、4.9mL/hr、5mL/hr、6mL/hr、6.5mL/hr、7mL/hr、7.5mL/hr、8mL/hr、8.5mL/hr、9mL/hr、9.5mL/hr、10mL/hr、10.5mL/hr、llmL/hr、ll.5mL/hr、12mL/hr、12.5mL/hr、13mL/hr、13.5mL/hr、14mL/hr、14.5mL/hr 或15mL/hr。微流體裝置可以設(shè)計成使得超過約50%，例如55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的被捕獲細(xì)胞可在陣列的上游部分、區(qū)段或區(qū)域中被捕獲。微流體裝置可以設(shè)計成使得超過約10%，例如15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的被捕獲細(xì)胞可以基于大小而不是基于親和性被捕獲。微流體裝置可以設(shè)計成使得超過約10%，例如15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的被捕獲細(xì)胞可以基于親和性而不是大小被捕獲?；诖笮〉牟东@可通過確定發(fā)生捕獲的陣列內(nèi)的位置、部分、區(qū)段或區(qū)域來確定。作為一個非限制性實例，在陣列的下游半?yún)^(qū)內(nèi)捕獲的細(xì)胞可以稱為是根據(jù)大小而不是親和性被捕獲的。
[0146] 本文所述的任何微流體裝置可包含輸入端、輸出端和障礙物陣列，其中該陣列可以配置為在使摻雜樣品以一定的流速流過本發(fā)明的任何裝置時，捕獲至少約80%的細(xì)胞或顆粒，如CTC，這些細(xì)胞或顆粒已經(jīng)摻入一定體積的樣品中，例如lmL、l.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL、8mL、8.5mL、9mL、9.5mL、10、llmL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、21mL、22mL、23mL、24mL、25mL、26mL、27mL、28mL、29mL、30mL、31mL、32mL、33mL、34mL、35mL、36mL、37mL、38mL、39mL 或 40mL體積的樣品中。例如，該陣列可以配置為在使摻雜樣品以0.25mL/hr或更高的流速流過本發(fā)明的任何裝置時，捕獲至少約80%，例如81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的細(xì)胞或顆粒，這些細(xì)胞或顆粒已經(jīng)摻入一定體積的樣品中，例如 lmL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、
6.5mL、7mL、7.5mL、8mL、8.5mL、9mL、9.5mL、10、llmL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、21mL、22mL、23mL、24mL、25mL、26mL、27mL、28mL、29mL、30mL、31mL、32mL、33mL、34mL、35mL、36mL、37mL、38mL、39mL或40mL體積的樣品中。該革巴向部分可以是表I中的任何革巴向部分，或例如EpCAM。流速可以是至少約0.01ml/hr或至少約0.25ml/hr，例如，
0.01mL/hr、0.02mL/hr、0.03mL/hr、0.04mL/hr、0.05mL/hr、0.06mL/hr、0.07mL/hr、0.08mL/hrλ0.09mL/hr、0.lmL/hr、0.15mL/hr、0.2mL/hr、0.3mL/hr、0.4mL/hr、0.5mL/hr、0.6mL/hr、0.7mL/hr、0.8mL/hr、0.9mL/hr、lmL/hr、1.lmL/hr、l.2mL/hr、l.3mL/hr、l.4mL/hr、
1.5mL/hr、l.6mL/hr、L 7mL/hr、l.8mL/hr、L 9mL/hr、2mL/hr、2.lmL/hr、2.2mL/hr、2.3mL/hr、2.4mL/hr、2.5mL/hr、2.6mL/hr、2.7mL/hr、2.8mL/hr、2.9mL/hr、3mL/hr、3.lmL/hr、
3.2mL/hr、3.3mL/hr、3.4mL/hr、3.5mL/hr、3.6mL/hr、3.7mL/hr、3.8mL/hr、3.9mL/hr、4mL/hr、4.lmL/hr、4.2mL/hr、4.3mL/hr、4.4mL/hr、4.5mL/hr、4.6mL/hr、4.7mL/hr、4.8mL/hr、
4.9mL/hr、5mL/hr、6mL/hr、6.5mL/hr、7mL/hr、7.5mL/hr、8mL/hr、8.5mL/hr、9mL/hr、9.5mL/hr、10mL/hr、10.5mL/hr、llmL/hr、11.5mL/hr、12mL/hr、12.5mL/hr、13mL/hr、13.5mL/hr、14mL/hrU4.5mL/hr或lSmL/hi*。微流體裝置可以設(shè)計成使得超過約50%，例如55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的被捕獲細(xì)胞可在陣列的上游半?yún)^(qū)內(nèi)被捕獲。微流體裝置可以設(shè)計成使得超過約10%，例如15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的被捕獲細(xì)胞可以基于大小而不是親和性被捕獲?；诖笮〉牟东@可通過確定發(fā)生捕獲的陣列內(nèi)的位置、部分、區(qū)段或區(qū)域來確定。作為一個非限制性實例，在陣列的下游半?yún)^(qū)內(nèi)捕獲的細(xì)胞可以稱為是根據(jù)大小而不是親和性被捕獲的。[0147]本文所述的任何微流體裝置可包含輸入端、輸出端和障礙物陣列，該障礙物陣列能夠捕獲至少約60%的摻入正常血液樣品中的CTC，其中該裝置用一定體積的、濃度為20 μ g/mL的一種或多種結(jié)合部分如抗體的溶液涂覆?？贵w溶液的體積可以為約100 μ L至約 ImL 或 2mL,例如 100 μ L、150 μ L、200 μ L、250 μ L、300 μ L、350 μ L、400 μ L、450 μ L、500 μ L、550 μ L、600 μ L>650 μ L>700 μ L>750 μ L、800 μ L、850 μ L、900 μ L、950 μ L、ImL、
1.5mL或2mL?？贵w溶液的濃度可以為約I μ g/mL至約100 μ g/mL,例如I μ g/mL、2 μ g/mL、3 μ g/mL>4 μ g/mL>5 μ g/mL、10 μ g/mL、15 μ g/mL、20 μ g/mL、25 μ g/mL、30 μ g/mL、35 μ g/mL、40 μ g/mL、45 μ g/mL、50 μ g/mL、55 μ g/mL、60 μ g/mL、65 μ g/mL>70 μ g/mL>75 μ g/mL、80 μ g/mL、85 μ g/mL>90 μ g/mL、95 μ g/mL或100 μ g/mL。該微流體裝置可能能夠捕獲至少約60%的摻入正常血液樣品中的CTC，例如至少約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的摻入正常血液樣品中的CTC。
[0148]表I用于表征具有間充質(zhì)特征的CTC的標(biāo)記物
[0149]
【權(quán)利要求】
1.一種微流體裝置，其包含: 輸入端， 輸出端，和 設(shè)置于其間的障礙物陣列，其進一步包含支撐柱，其中α)每個支撐柱具有至少loo微米的直徑和至少300微米的中心距；(ii)具有至少45微米的直徑和至少150微米的中心距；或(iii)具有至少60微米的直徑并且與所述輸入端間隔小于1000微米。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述支撐柱與所述陣列中的障礙物具有不同的樣式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中每個所述支撐柱具有大于所述陣列中的最大障礙物的直徑，或具有至少100微米的直徑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述支撐柱以方形陣列樣式化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述支撐柱彼此間隔至少30微米或比所述陣列中障礙物之間的任何距離大至少約50%的距離。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述支撐柱距離所述輸入端小于200微米。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述障礙物陣列包含第一間隙和第二間隙，其中所述第二間隙是由所述障 礙物的上下移動而創(chuàng)建的，所述第二間隙小于所述第一間隙并以重復(fù)樣式位于所述陣列中。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述障礙物陣列包含第一間隙和第二間隙，其中所述第二間隙是由所述障礙物的向上或向下移動創(chuàng)建的，所述第二間隙小于所述第一間隙并以重復(fù)樣式位于所述陣列中。
9.一種微流體裝置，其包含: 樣品輸入端， 樣品輸出端，和 位于其間的障礙物陣列，所述陣列具有多個區(qū)域， 第一區(qū)域，包含在所述第一區(qū)域中的多個障礙物之間的第一間隙和第二間隙，其中所述第一間隙和所述第二間隙是不同的，和 第二區(qū)域，具有均勻分布的、其間具有單一間隙的障礙物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置，其中所述第二區(qū)域處于所述第一區(qū)域的下游。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的裝置，其中處于所述第一區(qū)域下游的第二區(qū)域包含具有某一直徑的障礙物，其中每個障礙物具有的直徑小于所述第一區(qū)域中的每個障礙物的直徑。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置，進一步包含處于所述第二區(qū)域下游的一個或多個額外區(qū)域，其中所述一個或多個額外區(qū)域中的每一個具有均勻分布的、其間具有單一間隙的障礙物，其中所述單一間隙從所述第二區(qū)域到所述額外區(qū)域的每個下游陣列逐漸變小。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中處于所述第二區(qū)域下游的所述一個或多個額外區(qū)域中的每一個包含具有某一直徑的障礙物，其中所述障礙物直徑從所述第二區(qū)域到所述額外區(qū)域的每個下游陣列逐漸變小。
14.根據(jù)權(quán)利要求7、8或 9所述的裝置，其中所述第二間隙以對稱樣式、均一樣式、重復(fù)樣式、非均一樣式分布。
15.一種微流體裝置，其包 含:輸入端， 輸出端，和 位于其間的障礙物陣列，所述陣列具有多個區(qū)域， 第一區(qū)域，包含在所述第一區(qū)域中的多個障礙物之間的第一間隙和第二間隙，其中所述第一間隙和所述第二間隙是不同的，和 第二區(qū)域，包含在所述第二區(qū)域中的多個障礙物之間的第一間隙和第二間隙，其中所述第一間隙和所述第二間隙是不同的，并且其中在所述第一和第二區(qū)域中的所述第一間隙是相同的，并且其中在所述第二區(qū)域中的所述第二間隙小于在所述第一區(qū)域中的所述第二間隙。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的裝置，其中所述第二區(qū)域處于所述第一區(qū)域的下游。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的裝置，其中處于所述第一區(qū)域下游的所述第二區(qū)域包含具有某一直徑的障礙物，其中每個障礙物具有的直徑小于所述第一區(qū)域中每個障礙物的直徑。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的裝置，進一步包含處于所述第二區(qū)域下游的一個或多個額外區(qū)域，其中所述一個或多個額外區(qū)域中的每一個具有位于多個障礙物之間的第一間隙和第二間隙，其中所述第一間隙和所述第二間隙是不同的，其中所述多個區(qū)域中的每一個的所述第一間隙是相同的，并且其中所述第二間隙從所述第二區(qū)域到所述額外區(qū)域的每個下游陣列逐漸變小。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的裝置，其中處于所述第二區(qū)域下游的所述一個或多個額外區(qū)域中的每一個包含具有某一直徑的障礙物，其中所述障礙物直徑從所述第二區(qū)域到所述額外區(qū)域的每個下游陣列逐漸變小。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的裝置，其中所述間隙以非隨機樣式、重復(fù)樣式或均一樣式排布。
21.一種微流體裝置，其包含: 輸入端， 輸出端，和 位于其間的障礙物陣列，其中至少所述障礙物的子集成簇排布，每個簇包含至少三個障礙物，其中簇中相鄰障礙物之間的距離小于所述簇與其相鄰簇之間的距離。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，其中所有的或基本上所有的所述障礙物均成簇。
23.根據(jù)權(quán)利要求1、7、8、9、15或21所述的裝置，其中所述障礙物用一種或多種結(jié)合部分涂覆。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的裝置，其中所述結(jié)合部分是親和標(biāo)記的配體。
25.根據(jù)權(quán)利要求1、7、8、9、15或21所述的裝置，其中所述陣列包含不同大小的障礙物。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，其中所述陣列包含至少100、200或300個彼此相鄰的簇。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，其中簇中障礙物之間的最大距離比第一簇與鄰近所述第一簇的第二簇之間的最小距離至少小3倍。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，其中所述簇在沿流動方向的第一方向上比垂直于所述流動方向的第二方向上具有更長的尺寸。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，其中所述簇定位成使得第一簇位于第二簇的上游居中，并且其中所述第二簇的中心以與流動方向水平線呈約0° -90°的角度偏離所述第一簇的中心。
30.根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，其中簇中障礙物之間的距離小于40、30、20或15微米。
31.根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，其中所述陣列包含串聯(lián)或并聯(lián)的多個區(qū)域，其中每個區(qū)域中的簇具有不同的特征。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的裝置，其中所述特征選自:(a)簇內(nèi)一個或多個障礙物之間的不同間距，(b)簇之間的不同間距，(c)連接角，(d)簇之間的不同角度，(e)相同簇中的障礙物之間的不同角度，或其組合。
33.根據(jù)權(quán)利要求1、9、15或21所述的裝置，其中所述陣列進一步包含位于第一區(qū)域和第二區(qū)域之間的過渡區(qū)，其中所述過渡區(qū)包含不同大小的障礙物。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的裝置，其中所述陣列包含多于4個或5個區(qū)域。
35.根據(jù)權(quán)利要求1、9、15、21或31所述的裝置，其中所述輸入端流體連接至一個或多個額外陣列。
36.根據(jù)權(quán)利要求21所述的裝置，其中所述簇以非均一、非隨機或重復(fù)樣式排布。
37.根據(jù)權(quán) 利要求21所述的裝置，其中所述簇由具有各為(i)約10°-90° (ii)約20° -40°，或(iii)約30° -40°的第一和第二迎角的三個障礙物組成。
38.一種微流體裝置，其包含樣品輸入端、樣品輸出端和位于其間的障礙物陣列，該障礙物陣列具有在所述障礙物的子集之間的第一間隙和在所述障礙物的第二子集之間的第二間隙，其中所述第一間隙大于所述第二間隙，并且其中所述第二間隙在整個所述陣列中以非均一、非隨機樣式分布。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的微流體裝置，其中所述第二間隙以重復(fù)樣式分布。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的微流體裝置，其中所述第二間隙分布成使得所述第二間隙的中心形成橫穿流動方向的虛擬線。
41.一種微流體流通式裝置，其包含: 輸入端， 輸出端，和 障礙物陣列，其中所述陣列被配置為當(dāng)樣品以約0.25mL/hr至約12.5mL/hr的速度流過所述裝置時，捕獲摻入該血液樣品中的至少80%的EpCAM表達細(xì)胞，該血液樣品不含EpCAM表達細(xì)胞，體積為約3.75mL至約20mL。
42.一種微流體流通式裝置，其包含: 輸入端， 輸出端，和 障礙物陣列，其中所述陣列被配置為當(dāng)樣品以約0.25mL/hr至約12.5mL/hr的速度流過所述裝置時，捕獲摻入體積為約3.75mL至約20mL的、不含CTC的血液樣品中至少80%的CTC。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的裝置，其中超過50%的被捕獲細(xì)胞在所述陣列的上游半?yún)^(qū)被捕獲。
44.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的裝置，其中超過10%的被捕獲細(xì)胞是基于大小而不是親和性被捕獲的。
45.一種用于富集CTC的方法，包括使含有CTC的樣品流動通過以上任一權(quán)利要求所述的微流體裝置。
46.一種用于監(jiān)測癌癥復(fù)發(fā)的方法，包括:(a)計數(shù)或表征從多個在不同時間點取自患者的樣品中富集的CTC，并計數(shù)或表征來自所述患者的CTCjP (b)使用來自(a)的數(shù)據(jù)以至少80%的置信水平確定所述患者中癌癥復(fù)發(fā)的可能性。
47.一種用于監(jiān)測接受癌癥治療的患者的治療效果的方法，包括:(a)計數(shù)或表征從治療前取自患者的樣品和至少一個在治療后取得的樣品中富集的CTCjP (b)使用來自(a)的數(shù)據(jù)以至少80%的置信水平確定治療是否有效。
48.一種用于篩查患者中的癌癥的方法，包括:(a)計數(shù)或表征從來自所述患者的樣品中富集的CTCjP (b)使用來自(a)的數(shù)據(jù)確定所述患者是否患有癌癥或是否應(yīng)該尋求進一步的檢測來確認(rèn)所述癌癥，其中所述篩查具有至少80%的靈敏度。
49.根據(jù)權(quán)利要求45、46、47或48中任一項所述的方法，進一步包括:(c)對捕獲的CTC進行分子分析或?qū)⒉东@的CTC分類，并且使用來自步驟(c)的信息作出決定。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述分子分析包括:測序、SNP檢測、基因表達分析、cDNA分析、mRNA分析、蛋白質(zhì)表達分析、修飾蛋白質(zhì)分析、翻譯后修飾蛋白質(zhì)分析、突變蛋白質(zhì)分析、蛋白質(zhì)修飾分析、miRNA譜分析、監(jiān)測酶活性、顯色原位雜交(CISH)分析或熒光原位雜交(FISH)分析 。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述分類包括鑒定CTC的亞群，其中所述亞群根據(jù)所進行的分子分析的結(jié)果或被對于表1中標(biāo)記物特異性的結(jié)合部分所捕獲的能力來表征。
52.根據(jù)權(quán)利要求45、46、47或48中任一項所述的方法，進一步包括比較在微流體流通式裝置的一個或多個區(qū)域的每一個中捕獲的細(xì)胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求45、46、47或48中任一項所述的方法，其中在少于20hr的時間內(nèi)處理至少IOmL的樣品。
54.—種微流體裝置，其包含用抗體涂覆的障礙物陣列，其中所述裝置的表面用葡聚糖或葡聚糖衍生物進行功能化。
55.一種微流體裝置，其包含用抗體涂覆的障礙物陣列，其中所述裝置的表面在至少10小時里具有小于15°的接觸角。
56.一種微流體裝置，其包含用兩種或更多種不同的聚合物功能化的表面，其中所述第一聚合物是碳水化合物且所述第二聚合物是聚乙二醇(PEG)。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的裝置，其中所述碳水化合物是葡聚糖。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的裝置，其中所述碳水化合物具有10K-70K的分子量。
59.根據(jù)權(quán)利要求57所述的裝置，其中所述葡聚糖的濃度為所述表面的0.01%-5%(w/w)或 0.05%-2%(w/w) ο
60.根據(jù)權(quán)利要求56所述的裝置，其中所述PEG具有1，000-100，000道爾頓的分子量。
61.根據(jù)權(quán)利要求56所述的裝置，其中所述PEG具有1，000-20，000道爾頓的分子量。
62.根據(jù)權(quán)利要求56所述的裝置，其中所述PEG和所述碳水化合物分別具有1:10-10:1的摩爾比。
63.根據(jù)權(quán)利要求54或56所述的裝置，其中所述表面進一步包含結(jié)合部分。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的裝置，其中所述結(jié)合部分選自抗生物素蛋白、NeutrAvidin、鏈霉抗生物素蛋白或CaptAvidin。
65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的裝置，其中所述結(jié)合部分與所述碳水化合物共價結(jié)合。
66.根據(jù)權(quán)利要求63所述的裝置，其中所述結(jié)合部分通過連接體與所述碳水化合物結(jié)合。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的裝置，其中所述連接體是生物素-PEG-NHS。
68.一種微流體裝置，其包含用抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物涂覆的障礙物陣列。
69.一種微流體裝置，其包含與一種或多種抗體偶合的塑性表面，其中所述抗體距所述塑性表面平均大于PEG3長度。
70.以上所述的任何裝置，其中所述裝置的表面是塑料或環(huán)烯烴共聚物(COC)或環(huán)烯烴聚合物(C0P)。
71.—種微流體裝置，其能夠捕獲摻入正常血液樣品中的至少60%的CTC，其中所述裝置用約10 V- g/mL至約100 μ g/mL的抗體溶液進行功能化。
72.一種用于捕獲和釋放感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片的方法，包括:(a)使包含感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片的樣品流過用碳水化合物和結(jié)合部分涂覆的表面，該結(jié)合部分能與選擇性地存在于所述感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片上的細(xì)胞表面標(biāo)記物選擇性地結(jié)合，和(b)使用選擇性裂解所述碳水化合物的酶和/或競爭性釋放生物素偶聯(lián)物的生物素衍生物，從而使所述感興趣的細(xì)胞或細(xì)胞碎片從所述表面上釋放下來。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中競爭性釋放生物素偶聯(lián)物的生物素衍生物包括脫硫生物素。
74.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中選擇性裂解所述碳水化合物的酶包括葡聚糖酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷水解酶、轉(zhuǎn)糖苷酶、磷酸化酶或裂合酶。
75.根據(jù)權(quán)利要求64、65、66和67所述的裝置，進一步包含抗體的結(jié)合部分。
76.根據(jù)權(quán)利要求64、65、66和67所述的裝置，進一步包含DNA連接體。
77.根據(jù)權(quán)利要求24所述的裝置，其中所述親和標(biāo)記的配體使得能夠捕獲上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的細(xì)胞、經(jīng)歷間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)的細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞或其任意組合。
78.一種用于制造權(quán)利要求1的裝置的方法，其中使用環(huán)烯烴共聚物(COC)材料或環(huán)烯烴聚合物(COP)材料來制造所述裝置，其中使用原坯模塑所述COC或COP材料。
【文檔編號】B01D61/26GK103889556SQ201280012018
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月6日
【發(fā)明者】艾莉森·斯凱利, 丹尼斯·斯米爾諾夫, 董義, 基思·D·梅爾戴克, 卡姆·斯普羅特, 沃爾特·卡尼, 春生·蔣, 理查德·黃, 尤安娜·魯帕斯庫 申請人:Gpb科學(xué)有限責(zé)任公司