專(zhuān)利名稱(chēng)：植物中間苯三酚類(lèi)分子印跡聚合物的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化工分離技術(shù)領(lǐng)域，具體是間苯三酚類(lèi)分子印跡聚合物的制備及利用該聚合物為柱層析填料進(jìn)行植物中貫葉金絲桃素和加貫葉金絲桃素等物質(zhì)的分離和純化。
背景技術(shù)：
間苯三酚類(lèi)物質(zhì)廣泛存在于植物中，該類(lèi)物質(zhì)具有抗抑郁、抗菌、抗腫瘤、抗阿爾茨海默病和促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等藥理活性，它們的穩(wěn)定性較差，對(duì)光、熱和氧氣非常敏感，常溫下存放幾天就可被完全氧化。在貫葉連翹中該類(lèi)物質(zhì)主要為貫葉金絲桃素和加貫葉金絲桃素，前者在全草中的含量為2%-4. 5%，后者的含量?jī)H為O. 2%-1. 9%。二者的結(jié)構(gòu)非常相似，加貫葉金絲桃素僅比貫葉金絲桃素多一個(gè)甲基，且與后者具有類(lèi)似的藥理活性。由于其化學(xué)不穩(wěn)定性，該類(lèi)物質(zhì)對(duì)提取條件較為敏感，常用的回流和索氏提取法都很難滿(mǎn)足其提取的要求。與傳統(tǒng)的熱浸法相比，超聲波提取法具有提取時(shí)間短、提取率高、無(wú)需加熱，避免高溫對(duì)所提取成分的破壞以及提取設(shè)備便于推廣等優(yōu)點(diǎn)。其他的提取方法，如超臨界萃取等方法雖然也取得了良好的效果，但提取的成本較高，難以在實(shí)際生產(chǎn)中推廣使用。該類(lèi)物質(zhì)的分離方法主要有以下幾種方法。第一種方法是采用薄層色譜法進(jìn)行粗提物的分離，常采用的固定相為薄層層析硅膠GF254，展開(kāi)劑為不同比例混合溶劑。該方法雖然較為簡(jiǎn)便，但所得產(chǎn)物的純度較低。其次是基于硅膠柱的柱層析和制備色譜法，一般采用的流動(dòng)相為不同比例的混合溶劑，粗提物經(jīng)過(guò)分離和精制后其純度可達(dá)到98%以上。再者是采用加速溶劑萃取和高速逆流色譜法。上述方法均能得到一定純度的目標(biāo)化合物，但分離過(guò)程復(fù)雜，缺乏特異性，有機(jī)溶劑用量較大，所需時(shí)間和成本較高。分子印跡技術(shù)作為一種能夠獲得在空間和結(jié)合位點(diǎn)上與某種分子完全匹配的聚合物的制備技術(shù)，具有構(gòu)效的預(yù)定性、識(shí)別的特異性和廣泛的實(shí)用性。而且由于分子印跡聚合物對(duì)目標(biāo)分子具有高度的選擇性識(shí)別作用，較生物性抗體具有穩(wěn)定性和重復(fù)性好、耐極端環(huán)境能力強(qiáng)、制備過(guò)程簡(jiǎn)便、成本低廉，因此將印跡聚合物用于待測(cè)物質(zhì)的親和識(shí)別和富集較其他方法具有極大的優(yōu)勢(shì)，目前已展示出誘人的前景。參考文獻(xiàn)的報(bào)道，采用氧化還原引發(fā)劑低溫引發(fā)制備間苯三酚類(lèi)分子印跡聚合物微球，所制備的微球經(jīng)漂洗、過(guò)篩、洗脫和干燥等一系列處理后，再通過(guò)紫外分光光度法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)分析即可制備出具有高效識(shí)別性能的聚合物材料。而后采用濕法進(jìn)行親和識(shí)別柱的裝填和預(yù)處理，提取物經(jīng)濃縮后上樣，即可簡(jiǎn)便快速地分離和純化出含量和純度較高的間苯三酚類(lèi)化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有分離純化方法的不足，提出一種間苯三酚類(lèi)分子印跡聚合物的制備方法，本發(fā)明還包含所述的聚合物在植物中間苯三酚類(lèi)物質(zhì)分離純化上的應(yīng)用。
植物中間苯三酚類(lèi)分子印跡聚合物的制備及應(yīng)用，其步驟如下
1)先將聚乙烯醇400加入蒸餾水中，加熱至95°C使其溶解，形成濃度為3%-8%聚乙烯醇400溶液(優(yōu)選的為4%-6%)，冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)至三口燒瓶中；
2)將模板分子溶解于致孔劑中，加入功能單體，得到混合溶液；所述的模板分子為常山酮，致孔劑為乙腈，功能單體為甲基丙烯酸、丙稀酰胺、4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酸酯中的一種或兩種的組合；所述的模板分子和功能單體的摩爾比為1:4-8，模板分子在致孔劑中的摩爾濃度為2. 5mmoI/L-5mmoI/L ；
3)將步驟2)的混合溶液用超聲清洗儀超聲5min，混合均勻，放入4°C冰箱孵育24h，得到預(yù)聚合體系；
4)將步驟3)的預(yù)聚合體系置于冰水浴中，加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，用超聲清洗儀超聲 5min,通入氮?dú)?min，而后在氮?dú)鈿夥栈蛘婵諣顟B(tài)下密封；所述的交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯，作為優(yōu)選該交聯(lián)劑是三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，加入量為功能單體摩爾量的5倍，所述的引發(fā)劑是等摩爾比的過(guò)氧化苯甲酰和N， N- 二甲基苯胺，加入量為功能單體摩爾量的O. 2倍；
5)將步驟4)形成的混合溶液在攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下慢慢滴加到步驟I)的三口燒瓶中引發(fā)聚合，引發(fā)溫度為10°C -30°C，聚合時(shí)間為6h-36h (優(yōu)選引發(fā)溫度為18°C _25°C，聚合時(shí)間為12h-24h)，使其形成乳白色的微懸浮乳液，即為印跡聚合物微球；
6)將步驟5)中的印跡聚合物在丙酮中用濕篩法過(guò)分級(jí)篩，除去極少數(shù)粒徑較大和較小的微球，選直徑為50Α -70/4ιι的顆粒，用定量濾紙包好，用體積比為7:3的甲醇鹽酸混合溶劑索氏萃取，期間定時(shí)對(duì)提取液進(jìn)行紫外掃描，直到無(wú)模板分子特征吸收時(shí)停止萃??；然后將萃取所得物60°C烘干至恒重，即得到對(duì)植物中間苯三酚類(lèi)化合物具有特異性識(shí)別能力的分子印跡聚合物；
7)將步驟6)的分子印跡聚合物微球用濕法裝填層析柱，依次用丙酮和甲醇潤(rùn)洗，即制備出分子印跡層析柱，備用；
8)稱(chēng)取植物藥材粉末，加入5-10倍量的丙酮溶液，超聲提取3次，每次30min，合并提取液，濃縮至含生藥量O. lg/mL-lg/mL后加蒸餾水至含水量20%-50%。而后用非極性溶劑萃取1-3次，萃取溶劑總體積為生藥量的10-15倍。用pH大于等于8. 5的40%_60%的乙醇水溶液萃取除雜，取堿醇相，調(diào)節(jié)PH至0-4，用生藥量6-8倍的非極性溶劑萃取，室溫減壓蒸干后即得間苯三酚類(lèi)的粗提取物。所述的非極性溶劑為石油醚、乙醚、烷烴類(lèi)(常為正戊烷、正己烷或正庚烷)或環(huán)烷烴類(lèi)(常為環(huán)戊烷或環(huán)己烷)，或它們以任意比例混合后的溶劑；
9)稱(chēng)取粗提取物溶解于丙酮后，將其與印跡聚合物粉末混勻成漿，緩緩上樣，控制柱流速為O. 5mL/min，用氯仿淋洗除去雜質(zhì)，隨后用體積比為7:3的甲醇乙酸混合溶液洗脫保留在柱上的間苯三酚類(lèi)物質(zhì)，經(jīng)18°C _25°C濃縮干燥后即得高純度的該類(lèi)化合物。柱層析純化過(guò)程中點(diǎn)GF254硅膠板監(jiān)控分離過(guò)程，優(yōu)化工藝參數(shù)，所用展開(kāi)劑為體積比4. 5:1的正己烷乙酸乙酯混合溶劑。有益效果
本發(fā)明所制備的分子印跡層析柱對(duì)貫葉金絲桃素和加貫葉金絲桃素等間苯三酚類(lèi)物質(zhì)具有動(dòng)態(tài)的“記憶”功能，可以用于植物中該類(lèi)物質(zhì)的分離和純化，與普通的硅膠柱相比， 分子印跡層析柱具有特異性和和重復(fù)性好，分離效率和回收率高、吸附容量大、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)。較液液萃取法具有溶劑用量和基質(zhì)干擾少、回收率和處理效率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例可使本專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員全面理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例I
(一)、間苯三酚類(lèi)化合物分子印跡聚合物的制備
稱(chēng)取6g聚乙烯醇400加入150mL雙蒸水中，于90°C _95°C熱水中溶解，冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)入至250mL三口燒瓶中。準(zhǔn)確取模板分子(貫葉金絲桃素)0. 5mmol和功能單體甲基丙烯酸2mmol，溶解于150mL丙酮中，充分溶解后超聲處理5min，然后置于4°C冰箱24h使其生成穩(wěn)定的復(fù)合物即完成預(yù)聚合；隨后加入交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯lOmmol， 引發(fā)劑過(guò)氧化苯甲酰和N，N- 二甲基苯胺各O. 4mmol，超聲處理5min (除去氧氣)后慢慢滴到400rpm轉(zhuǎn)速攪拌下的加熱溫度為2(TC的上述三口燒瓶中，引發(fā)聚合18h后形成乳白色的微懸浮乳液，即印跡聚合物微球；所得印跡聚合物顆粒在丙酮中用濕篩法過(guò)分級(jí)篩，除去極少數(shù)粒徑較大和較小的微球，選擇粒徑為50//m-70//m的顆粒，用定量濾紙包好，用體積比為 7:3的甲醇鹽酸混合溶劑索氏萃取，期間定時(shí)對(duì)提取液進(jìn)行紫外掃描，直到無(wú)模板分子特征吸收時(shí)停止萃取，萃取時(shí)間為48h ;隨后將萃取所得物60°C烘干至恒重，得到對(duì)植物中間苯三酚類(lèi)化合物具有特異性識(shí)別能力的分子印跡聚合物。非模板分子印跡聚合物的制備，即不加模板分子，不進(jìn)行預(yù)聚合，其余操作同上述步驟。(二)、間苯三酚類(lèi)化合物分子印跡聚合物的表征
將模板分子的丙酮溶液作為吸附液，準(zhǔn)確稱(chēng)取10份50mg的模板分子印跡聚合物，于 25°C下測(cè)定它們對(duì)不同濃度的模板分子的吸附量，以吸附量對(duì)模板分子濃度作圖，繪制等溫吸附曲線。為了表征模板分子印跡聚合物的吸附性能，同時(shí)測(cè)定非模板分子印跡聚合物的等溫吸附曲線，將獲得的數(shù)據(jù)用于式(I)的Scatchard分析。由Scatchard曲線的斜率和截距可求得分子印跡聚合物的Qmax和KD。表征結(jié)果表明模板分子印跡聚合物存在兩類(lèi)吸附位點(diǎn)，一類(lèi)是具有高結(jié)合能和高選擇性的結(jié)合位點(diǎn)，另一類(lèi)是具有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(diǎn)(其 Kdi=L 5/^mol/L, Qmaxl=8765. 3/^mol/g ；KD2=3. 5 X IO^moI/L, Qmax2=503. 7/^mol/ g)。而非模板分子印跡聚合物僅有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(diǎn)(Kd=2. 3X 10^mol/L, Qmax=251. 6/^mol/g)；
方程
式(I)中Kd :結(jié)合位點(diǎn)的平衡離解常數(shù)，C :模板分子的平衡濃度，Qmax :最大表觀結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。(三)、分子印跡層析柱的制備
稱(chēng)取500mg的模板分子印跡聚合物裝入空柱管中，裝柱勻漿液為5mL體積比為2:1的甲醇異丙醇混合液，將印跡聚合物放入勻漿液中超聲5min制成混懸液。在裝柱之前，首先把下層的篩板放入，然后用3mL-5mL甲醇對(duì)空柱管潤(rùn)洗，徐徐加入勻漿好的印跡聚合物混懸液，而后放入上層的篩板并壓緊。依次用IOmL甲醇和IOmL丙酮沖洗，待用。
(四)、柱層析分離純化中藥粗提物中的間苯三酚類(lèi)化合物
稱(chēng)取2g粗提物,用ImL甲醇潤(rùn)濕后上樣,控制流速O. 5mL/min,用IOmL氯仿淋洗，15mL 體積比為7:3的甲醇乙酸混合溶液洗脫，洗脫液低溫減壓蒸干后得間苯三酚類(lèi)化合物共計(jì) 102. 3//g，其中貫葉金絲桃素65. 3//g，加貫葉金絲桃素26. 2//g，其余為間苯三酚類(lèi)其他化合物。本發(fā)明的效果為，該印跡層析柱對(duì)間苯三酚類(lèi)化合物具有專(zhuān)一性選擇性，其經(jīng) 50mL體積比為9:1的甲醇乙酸混合液和50mL丙酮依次再生后，可連續(xù)使用多次。實(shí)施例2
(一)、間苯三酚類(lèi)化合物分子印跡聚合物的制備
制備的基本過(guò)程同實(shí)施例I，所用的聚乙烯醇400濃度為6%，所用致孔劑用量為200mL， 功能單體為丙烯酰胺3mmol，交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯15mmol，引發(fā)劑過(guò)氧化苯甲酰和N,N- 二甲基苯胺各O. 6mmol,引發(fā)聚合溫度25°C,聚合時(shí)間為12h,聚合物索氏萃取洗脫時(shí)間為18h。(二)、間苯三酚類(lèi)化合物分子印跡聚合物的表征
表征方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示模板分子印跡聚合物存在兩類(lèi)吸附位點(diǎn)，一類(lèi)是高選擇性的結(jié)合位點(diǎn)，另一類(lèi)是低選擇性的結(jié)合位點(diǎn)(其KD1=4. 2X10>mol/L, Qmaxl=158. 2/Aiiol/g ； KD2=1. 3 X IQT2MmolfL, Qmax2=83. 9/如ol/g)。而非模板分子印跡聚合物僅有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(diǎn)(KD=3. 6X 10>mol/L，Qmax=77. 5//mol/g)。(三)、分子印跡層析柱的制備
制備的基本過(guò)程同實(shí)施例1，所用的聚合物的量為750mg，潤(rùn)洗溶劑為15mL甲醇和15mL 丙酮。(四)、柱層析分離純化中藥粗提物中的間苯三酚類(lèi)化合物
基本過(guò)程同實(shí)施例1，所用的粗提物的量為3. 5g，氯仿15mL，洗脫溶劑18mL，洗脫液經(jīng)低溫減壓干燥后得間苯三酚類(lèi)化合物共計(jì)156. lAg，其中貫葉金絲桃素93. 8//g，加貫葉金絲桃素33. 6//g，其余為間苯三酚類(lèi)其他化合物。本發(fā)明的效果為，該印跡層析柱對(duì)間苯三酚類(lèi)化合物具有專(zhuān)一性選擇性，其經(jīng) 50mL體積比為9:1的甲醇乙酸混合液和50mL丙酮依次再生后，可連續(xù)使用多次。實(shí)施例3
(一)、間苯三酚類(lèi)化合物分子印跡聚合物的制備
制備的基本過(guò)程同實(shí)施例I，所用的聚乙烯醇400濃度為5%，所用致孔劑用量為IOOmL, 功能單體為甲基丙烯酸酯4mmol，交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯20mmol，引發(fā)劑過(guò)氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺各O. 8mmol，引發(fā)聚合溫度18°C，聚合時(shí)間為24h，聚合物索氏萃取洗脫時(shí)間為12h。(二)、間苯三酚類(lèi)化合物分子印跡聚合物的表征
表征方法同實(shí)施例1，結(jié)果顯示模板分子印跡聚合物存在兩類(lèi)吸附位點(diǎn)，一類(lèi)是高選擇性的結(jié)合位點(diǎn)，另一類(lèi)是低選擇性的結(jié)合位點(diǎn)(其KD1=3. lXlQT2Mmol/L, Qmaxl=142. 3/^mol/g ； KD2=0. 8X 10_2/4iiol/L,Qmax2=71. 4/4iiol/g)。而非模板分子印跡聚合物僅有低結(jié)合能和低選擇性的結(jié)合位點(diǎn)(Kd=2. 7X10>mol/L, Qmax=63. 2//mol/g)。(三)、分子印跡層析柱的制備制備的基本過(guò)程同實(shí)施例1，所用的聚合物的量為lOOOmg，潤(rùn)洗溶劑為20mL甲醇和 120mL丙酮。(四)、柱層析分離純化中藥粗提物中的間苯三酚類(lèi)化合物?；具^(guò)程同實(shí)施例1， 所用粗提物的量為7g，氯仿17mL，洗脫溶劑20mL，洗脫液經(jīng)低溫減壓干燥后得到間苯三酚類(lèi)化合物共計(jì)232. 4//g，其中貫葉金絲桃素153. 5//g，加貫葉金絲桃素67. 9//g，其余為間苯三酚類(lèi)其他化合物。本發(fā)明的效果為，該印跡層析柱對(duì)間苯三酚類(lèi)化合物具有專(zhuān)一性選擇性，其經(jīng) 50mL體積比為9:1的甲醇乙酸混合液和50mL丙酮依次再生后，可連續(xù)使用多次。
權(quán)利要求
1.植物中間苯三酚類(lèi)分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于其具體操作步驟如下.1)先將聚乙烯醇400加入蒸餾水中，加熱至95°C使其溶解，形成濃度為3%-8%聚乙烯醇400溶液，冷卻至室溫，然后轉(zhuǎn)至三口燒瓶中；.2)將模板分子溶解于致孔劑中，加入功能單體，得到混合溶液；所述的模板分子為貫葉金絲桃素，致孔劑為丙酮，功能單體為甲基丙烯酸、丙稀酰胺、4-乙烯基吡啶和甲基丙烯酸酯中的一種或兩種的組合；所述的模板分子和功能單體的摩爾比為1:4-8，模板分子在致孔劑中的摩爾濃度為2. 5mmol/L-5mmol/L ；.3)將步驟2)的混合溶液用超聲清洗儀超聲5min，混合均勻，放入4°C冰箱孵育24h，得到預(yù)聚合體系；.4)將步驟3)的預(yù)聚合體系置于冰水浴中，加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，用超聲清洗儀超聲 5min，通入氮?dú)?min，而后在氮?dú)鈿夥栈蛘婵諣顟B(tài)下密封；所述的交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或乙二醇二甲基丙烯酸酯，加入量為功能單體摩爾量的5倍，所述的引發(fā)劑是等摩爾比的過(guò)氧化苯甲酰和N，N- 二甲基苯胺，加入量為功能單體摩爾量的O. 2倍；.5)將步驟4)形成的混合溶液在攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下慢慢滴加到步驟I)的三口燒瓶中引發(fā)聚合，引發(fā)溫度為10°C -30°C，聚合時(shí)間為6h-36h，使其形成乳白色的微懸浮乳液，即為印跡聚合物微球；.6)將步驟5)中的印跡聚合物在丙酮中用濕篩法過(guò)分級(jí)篩，除去極少數(shù)粒徑較大和較小的微球，選直徑為50Α -70/4ιι的顆粒，用定量濾紙包好，用體積比為7:3的甲醇鹽酸混合溶劑索氏萃取，期間定時(shí)對(duì)提取液進(jìn)行紫外掃描，直到無(wú)模板分子特征吸收時(shí)停止萃??；然后將萃取所得物60°C烘干至恒重，即得到對(duì)植物中間苯三酚類(lèi)化合物具有特異性識(shí)別能力的分子印跡聚合物；.7)將步驟6)的分子印跡聚合物顆粒用濕法裝填層析柱，依次用丙酮和甲醇潤(rùn)洗，即制備出分子印跡層析柱。
2.權(quán)利要求I所述的植物中間苯三酚類(lèi)分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述的聚乙烯醇400溶液的濃度為4%-6%。
3.權(quán)利要求I所述的植物中間苯三酚類(lèi)分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述的引發(fā)溫度為18°C -25°C，聚合時(shí)間為12h-24h。
4.權(quán)利要求I所述的植物中間苯三酚類(lèi)分子印跡聚合物的應(yīng)用，其特征在于用于植物中貫葉金絲桃素和加貫葉金絲桃素等間苯三酚類(lèi)物質(zhì)的分離和純化。
全文摘要
植物中間苯三酚類(lèi)分子印跡聚合物的制備及應(yīng)用，采用懸浮聚合法，按照模板分子、功能單體和交聯(lián)劑摩爾比為1:3-6:15-30混合，加入氧化還原引發(fā)劑過(guò)氧化苯甲酰和N，N-二甲基苯胺，然后在10℃-30℃下邊攪拌邊滴加于3%-8%的聚乙烯醇400水溶液中，所得聚合物微球經(jīng)漂洗、過(guò)篩、洗脫和干燥等一系列處理后，濕法填充于玻璃層析柱中，經(jīng)甲醇和丙酮依次潤(rùn)洗后用于植物中貫葉金絲桃素和加貫葉金絲桃素等間苯三酚類(lèi)物質(zhì)的選擇性吸附和高效富集，所制備的層析柱較已有的層析柱具有特異性強(qiáng)、制備簡(jiǎn)便、成本低廉、所需儀器和反應(yīng)條件容易實(shí)現(xiàn)等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)B01D15/22GK102580693SQ20121000073
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月4日
發(fā)明者侯玉澤, 劉世磊, 張敏, 徐航, 李兆周, 李志康, 李文榮, 李道敏, 杜琳 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)