專(zhuān)利名稱(chēng)：一種三液相萃取天然產(chǎn)物有效成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種從天然產(chǎn)物中萃取有效成分的方 法，特別涉及一種三液相萃取天然產(chǎn)物有效成分的方法。
背景技術(shù)：
天然產(chǎn)物有效成分是指具有生物活性的、可以作為藥用或營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值的 物質(zhì)， 一般是以植物為主，有效成分包括多糖、蛋白質(zhì)、生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、 蒽醌及茶醌類(lèi)、萜類(lèi)及甾體類(lèi)、皂苷類(lèi)、香豆素與脂類(lèi)、木脂素類(lèi)、強(qiáng)心苷類(lèi)、 酚酸類(lèi)、糖苷類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、色素類(lèi)等。
天然產(chǎn)物有效成分的提取方法主要是溶劑萃取法，其分離原理主要是依據(jù) 物質(zhì)在兩個(gè)互不相溶的液相中分配特性的差異來(lái)進(jìn)行分離。對(duì)于極性相差較大 的有效成分，往往需要選擇不同的溶劑，經(jīng)多次萃取才能達(dá)到提取分離的目的。 如對(duì)于水溶性成分采取水提醇沉的工藝，對(duì)脂溶性成分則通常采用醇提水沉的 方法，對(duì)于極性更弱的成分則用正己烷或石油醚提取。這樣往往導(dǎo)致操作步驟 繁瑣、提取不完全、成分相互摻雜、收率較低等問(wèn)題。隨著天然產(chǎn)物有效成分 工業(yè)化的迅猛發(fā)展，實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物有效成分的低成本、高收率及高效率的提取 分離迫在眉睫。
源于上世紀(jì)60年代的雙水相萃取技術(shù)由于其萃取條件溫和、容易放大、可 連續(xù)操作，在蛋白質(zhì)等大分子和天然產(chǎn)物小分子有效成分的分離中得到應(yīng)用， 但由于傳統(tǒng)雙水相萃取中常用的聚合物(如聚乙二醇)價(jià)格較高、回收困難， 因此實(shí)際應(yīng)用較少。最近幾年國(guó)內(nèi)外又有學(xué)者提出用親水性的短鏈醇與無(wú)機(jī)鹽形成的新型雙水相萃取天然產(chǎn)物中的有效成分，但有效成分多集中于上相(醇 相)，難以得到有效地分離。多相萃取無(wú)疑是實(shí)現(xiàn)提取與分離的有效途徑，如液 -液-液三相萃取體系可同時(shí)萃取天然產(chǎn)物中的多種有效成分，在一定程度上改善 提取效果，彌補(bǔ)兩相萃取的不足，因而引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。如陳繼 等人釆用高聚物/鹽或兩種高聚物加入到青霉素發(fā)酵液或?yàn)V液中形成兩相，再加 入酯類(lèi)化合物形成三相，將青霉素的分離與純化一步完成(中國(guó)專(zhuān)利CN
1324795A)。也有學(xué)者將聚環(huán)氧乙烷聚環(huán)氧丙烷(EOPO2500) /硫酸銨/磷酸三丁 酯三相體系用于甘草粗提液中甘草酸和甘草黃苷的分離(Separation and Purification Technology, 2007， 53: 216~223)。這兩個(gè)實(shí)例都是基于傳統(tǒng)雙水相 萃取發(fā)展出來(lái)的三液相萃取，主要缺陷仍然是所用聚合物價(jià)格過(guò)于昂貴。有人 將氯仿-己烷-乙腈-水的飽和三相體系用于茴^虎耳草固-液浸取后殘?jiān)羞秽?香豆精以及黃酮醇配糖的分離提純，通過(guò)逆流萃取，分離純化效果較好，但此 方法所用的有機(jī)溶劑乙腈的毒性較強(qiáng)，在天然產(chǎn)物的分離純化中應(yīng)避免使用。 有機(jī)膦、有機(jī)胺也因毒性或殘留難以應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取與分離?；谛滦?雙水相萃取開(kāi)發(fā)疏水性有機(jī)物/親水性低分子有機(jī)物/無(wú)機(jī)鹽/水三液相體系，從天 然產(chǎn)物或其粗提液中同時(shí)萃取兩種以上極性相差較大的有效成分是本發(fā)明提出 的新設(shè)想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)天然產(chǎn)物有效成分提取分離技術(shù)中存在提 取效率低、溶劑用量大、成本高的不足，提供一種疏水性有機(jī)物/親水性低分子 有機(jī)物/無(wú)機(jī)鹽/水三液相體系從天然產(chǎn)物或其粗提液中同時(shí)提取分離兩種以上 有效成分的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是將疏水性有機(jī)物、親水性低分子有機(jī)物以及無(wú)機(jī)鹽溶液按比例加入到天然物質(zhì)粉末中或是將無(wú)機(jī)鹽固體和疏水性有機(jī)物按比例加入 到天然產(chǎn)物的親水性低分子有機(jī)物提取液中，攪拌均勻，靜置或離心分相。
上述疏水性有機(jī)物為乙酸乙酯、叔丁醇、正己烷、氯仿和石油醚，無(wú)機(jī)鹽 為氯化鈉、硫酸銨、硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫
二鉀中的一種或幾種組合；所選用的親水性低分子有機(jī)物為甲醇、乙醇、正丙
醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、乙二醇、1， 2-丙二醇、1, 3-丙二醇、1, 4-丁 二醇、1， 2-丁二醇、1， 3-丁二醇、2， 3-丁二醇、二氧六環(huán)、四氫呋喃、丙酮 中的一種或幾種組合；加入的疏水性有機(jī)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 40%，親水性低分 子有機(jī)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15~40%，無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5~35%;料液比為1:20 1: 200;萃取溫度為15~30°C;攪拌均勻、靜置分相0.5 4.0h，或在1000-8000 rpm 下離心5-20 min。
本發(fā)明的效果和益處是和傳統(tǒng)的提取分離方法相比，利用三液相體系對(duì)極 性不同的有效成分進(jìn)行同步提取與分離，完成目標(biāo)產(chǎn)物的初步純化，有效地提 高萃取分離效率、簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本、易于產(chǎn)業(yè)化。與基于傳統(tǒng)雙 水相萃取發(fā)展起來(lái)的三液相萃取相比，有機(jī)溶劑廉價(jià)易回收，粘度低傳質(zhì)分相 快，更適合天然產(chǎn)物的提取與分離。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。
實(shí)施例l:辣椒堿與辣椒紅素的提取與分離
步驟l將干辣椒粉碎，過(guò)60目篩，得到干辣椒粉末。
步驟2取3.6g無(wú)水磷酸氫二鉀和10.8g水配成磷酸氫二鉀溶液。 步驟3將上述無(wú)機(jī)鹽溶液和3.6g無(wú)水乙醇及2.0g正己垸加入到1.0g干辣椒 粉末中，攪拌均勻，形成三液相體系，室溫下靜置分相2.0h。 91%的辣椒紅素分配在上相(正己烷相)，93%的辣椒堿分配在中相(乙醇相)，辣椒殘?jiān)鼊t在中相 和下相之間，其它成分，尤其是極性強(qiáng)的雜質(zhì)則留在下相(鹽相)。 實(shí)施例2:辣椒堿與辣椒紅素的提取與分離
步驟l將千辣椒粉碎，過(guò)60目篩，得到干辣椒粉末。
步驟2取辣椒粉l.Og，用二氧六環(huán)33.0g在5(TC下回流提取l.Oh，共三次， 過(guò)濾，合并濾液，得到干辣椒的二氧六環(huán)提取液。
步驟3配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.3%的磷酸氫二鉀溶液。
步驟4將上述無(wú)機(jī)鹽溶液6.4g， 9.6g 二氧六環(huán)提取液及4.0g正己烷混合， 攪拌均勻，形成三液相體系，室溫下靜置分相2.0h。 100%的辣椒紅素分配在上 相(正己垸相)，100%的辣椒堿分配在中相(二氧六環(huán)相)，此體系中沒(méi)有殘?jiān)?其它成分，尤其是極性強(qiáng)的雜質(zhì)則留在下相(鹽相)。辣椒堿與辣椒紅素實(shí)現(xiàn)了 有效的分離。
實(shí)施例3:丹酚酸B與丹參酮IU的分離
步驟1將丹參粉碎過(guò)60目篩，得到丹參粉末，用82% pH為2.0的乙醇溶 液65"C下回流提取1.5h,料液比為1: 10，過(guò)濾，將殘?jiān)儆胮H為2.0的水95°C 回流提取0.5h，料液比為l: 20，過(guò)濾，合并兩次提取液得到丹參粗提液。
步驟2測(cè)得上述丹參粗提液中乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，取此粗提液6.248， 加入1.76g固體硫酸銨，混合使其溶解。
步驟3向上述混合液中加入2.0g正己烷，攪拌均勻，形成三液相體系，室 溫下靜置分相1.5h。 92.7。/。的丹參銅IIa分配在上相(正己烷相)，93%的丹酚酸 B分配在中相(乙醇相)，粗提液中殘留的不溶物在相界面之間，86%的多糖集 屮在下相(鹽相)。
實(shí)施例4:盾葉薯蕷中皂苷成分與皂苷元的提取與分離步驟1將盾葉薯蕷粉碎過(guò)60目篩。取盾葉薯蕷粉末，按照料液比為1: 20 加入70% (Wv)乙醇，冷浸12h，得到皂苷粗提液。
步驟2皂苷粗提液中乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54。/。，取此粗提液2.31g，加入U(xiǎn)4g 同體硫酸銨，攪拌使其溶解。
步驟3向上述混合物中加入占雙水相體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的石油醚，混合 均勻，形成三液相體系。室溫靜置4h后，100%的薯蕷皂苷元富集在上相(石油 醚相)；盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、葡萄糖二糖苷、葡萄糖三糖苷、延齡草次 苷主要富集于中相(乙醇相)，回收率均在97%以上，72%的糖類(lèi)集中在下相(鹽 相)。
實(shí)施例5:文冠果種仁中油脂、皂苷與蛋白的提取與分離
步驟1將文冠果種仁粉碎至一定粒徑，得到文冠果種仁膏。 步驟2配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.7%的硫酸銨水溶液。
步驟3分別將7.5g正己烷、13.5g上述硫酸銨水溶液以及9g無(wú)水乙醇先后 加入到1.5g文冠果種仁膏中，攪拌均勻，室溫下靜置分相2.0h后在5000r/min 條件下離心10min，形成三液相體系。87%的油脂分配在上相(正己烷相)，83.5% 的皂苷分配在中間相(乙醇相)，種仁蛋白及殘?jiān)性谥邢嗪拖孪嗟南嘟缑嬷?間，其它成分，尤其是極性強(qiáng)的雜質(zhì)則主要集中在下相(鹽相)。
權(quán)利要求
1.一種三液相萃取天然產(chǎn)物有效成分的方法，其特征在于將疏水性有機(jī)物、親水性低分子有機(jī)物以及無(wú)機(jī)鹽溶液按比例直接加入到粉碎后的天然產(chǎn)物中或是將無(wú)機(jī)鹽固體和疏水性有機(jī)物按比例加入到天然產(chǎn)物的親水性低分子有機(jī)物提取液中，其中料液比為1∶20～1∶100，萃取溫度為15～30℃，疏水性有機(jī)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5～40％，親水性低分子有機(jī)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15～40％，無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5～35％，攪拌均勻、靜置分相0.5～4.0h或者在1000-8000rpm下離心5-20min，有效成分依極性的差異分別被萃取到上相、中相和下相，部分蛋白和多糖以及藥材殘?jiān)峙湓谙嘟缑嬷g。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三液相萃取天然產(chǎn)物有效成分的方法，其特 征在于所選用的無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉、硫酸銨、硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸 鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀中的一種或幾種組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三液相萃取天然產(chǎn)物有效成分的方法，其特 征在于所選用的親水性低分子有機(jī)物為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁 醇、異丁醇、乙二醇、1， 2-丙二醇、1， 3-丙二醇、1， 4-丁二醇、1, 2-丁二醇、 1， 3-丁二醇、2， 3-丁二醇、二氧六環(huán)、四氫呋喃、丙酮中的一種或幾種組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三液相萃取天然產(chǎn)物有效成分的方法，其特 征在于所選用的疏水性有機(jī)物為乙酸乙酯、叔丁醇、正己烷、氯仿和石油醚。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三液相萃取天然產(chǎn)物有效成分的方法，其特 征在于萃取操作是一次萃取、多次萃取、連續(xù)萃取或逆流萃取。
全文摘要
一種三液相萃取天然產(chǎn)物有效成分的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于將無(wú)機(jī)鹽溶液、親水性低分子有機(jī)物以及疏水性有機(jī)物按比例直接加入到粉碎后的天然產(chǎn)物中或是將無(wú)機(jī)鹽固體和疏水性有機(jī)物按比例加入到天然產(chǎn)物的親水性低分子有機(jī)物提取液中，攪拌均勻，靜置或離心，形成三液相，有效成分按照極性不同被分別富集在上相、中相和下相，部分蛋白、多糖和藥材殘?jiān)峙湓谙嘟缑嬷g，達(dá)到從天然產(chǎn)物中同時(shí)萃取得到極性不同的有效成分的目的。本發(fā)明的效果和益處是開(kāi)發(fā)了一種易于產(chǎn)業(yè)化的天然產(chǎn)物有效成分的提取分離方法，提高了萃取效率，有效地將提取與分離純化工藝相結(jié)合，有利于降低天然產(chǎn)物有效成分的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)B01D11/04GK101637667SQ20091001332
公開(kāi)日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2009年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月19日
發(fā)明者修志龍, 琳 劉, 華 張, 梁志霞, 董悅生 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)